脳 における重金属 の組織 化学的研究
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(2) 122. 桜. 5). 田. 下 記 の 溶 液 で30分 〜1時 間反 応 させ る.. A液. 15〜20%ア. {10%硝. 間,温 度 な どの 条 件 に きび しい制 限 が あ るよ. うに,こ の方 法 を行 な うに あた って もそ の方 の 配 慮. 酸銀 水溶 液0.2cc. が必 要 で あ る. そ こ で まず,光. {. クエ ン酸5gr. につ いて で あ るが,写 真 の現 像 と. は異 な っ て硫 化 銀 法 で は現 像 液 に銀 が 入 れ て あ る の で,暗 室 で は反 応 が進 ま な い.し た が って 写 真 の露. 蒸留 水100cc. A液 全 量 にB液2ccを. 海 光,時. ラ ビ ア ゴ ム 水 溶 液10cc. ハ イ ド ロ キ ノ ン2gr. B液. 寛. 加 えて 混 合 した の ち,た だ. ちに 使 用 す る.. 出 計 で毎 回一 定 の光 量 が え られ る場 所 で行 な う.し か し,直 射 日光 の あ た る所 は よ くな い.後 述 す る反. 6). 蒸留 水 で よ く水 洗 す る.. 応 時 間 が30分 か ら1時 間 内で 終 る よ うな場 所 で行 っ. 7). ヘ マ トキ シ リンで核 を染 め る.. た.反 応 温 度 は写 真 の 現 像 の よ うに20℃ と した.次. 8). 脱 水,透 徹,封 入.. い で,反 応 時 間で あ るが)こ れ が最 も重 要 で あ る,す. Ⅱ 電 子 顕微 鏡 的組 織 化 学. な わ ち,光 や温 度 を一 定 に して も,必 ず し も一 定 の. 電 子 顕微 鏡 的組 織 化学 に よ る検 索 の た め に ラ ッ ト. 時 間 反応 した の ち 後一 定 の染 色 標 本 が で きな い.そ. 5例 の 脳 が 使 用 され た.こ の研 究 に使 用 した ラ ッ ト. こで わ れ わ れ は,次 の よ うな方 法 で,少. はエ ーテ ル で麻 酔 の の ち,次 の 方 法 で 検 索 した.. 件 に お け る像 を得 よ う と考 え た.す な わ ち)わ れ わ. 1). 麻 酔 した ラ ッ トの 心 臓 か ら, 3%グ. しで も同条. ル タ ール. れ の 教室 で これ ま で研 究 が行 な われ て きた 海馬 領域. アル デ ヒ ド ・Millonig緩 衝 液 を硫 化 水 素 ガ スで. の 切 片 を1つ の 反応 液 の 中 に必 ず1枚 入 れ,こ れ を. 飽 和 した液 で灌 流 固 定 した.そ の 後,開 頭 し,. 対 照 標 本 と して 使 っ た.反 応 を行 な っ て い る間 に,. 脳 を取 り出 し,さ らに海 馬 領 域 を摘 出 し,そ の. この 切 片 を 取 り出 し,後 述 す るよ うに 海馬 領域 に お. 組 織片 を細 切 す る. 2). い て苔 状 線 維 終末 が,海 馬 のh3, h4野 の錐 体 細胞 の. 試 料 を上 記 の 固 定 液 に入 れ て さ らに2時 間 固 定 す る.. 3). 樹 状 突起 に 終 る部位 を 観察 し,そ の終 末 部 が樹 状突 起 の 表 面 に ボ タ ン状 に 終 る状態 が 明確 に み え る時 間. Millonig緩. 衝 液 で12〜24時 間 洗 う.液 は 数 回. と りか え る.. を至適 時 間 と した. 以 上 の よ うに 反応 液 に 入 れ る条件 を一 定 に して お. 4). 試 料 を カ ミソ リの 刃 で,で きる だ け薄 切 す る.. か な い と,現 像 が 進 み す ぎた写 真 の よ うに 人 工 産 物. 5). 薄 切 片 を次 の 液 に30〜60分 入 れ る. が で き,像 の判 定 が で きな くな る.た と えば,反 応. A液. {1Mの 硝酸銀 水溶液1cc. 20%ア. ラ ビア ゴ ム水 溶液100cc. 液 に入 れ る時 間 が 長 す ぎ る と,反 応 を起 さな い と思 わ れ る多 くの 神 経 細胞 や グ リア細胞 も渡 銀 され て く. ハ イ ドロ キ ノ ン2gr. B液. {. オ ン を含 ん で い るた め に お こ るの で はな く,神 経 細. 蒸留水100cc. 胞 の好 銀 性 か ら銀 と結 合 して 陽 性 反応 をお こ した も. A液 全量 にB液20ccを 6). る場 合 が あ る‑こ の よ うな 反応 は そ の 細 胞 が 金 属 イ. クエン酸5gr 加 え る(使 用 直 前). 緩 衝 液 で 切 片 を短 時 間 洗 った 後, オ ス ミウ ム溶 液(PH. 7.3)で0.5〜1時. 1%四. の と考 え られ る. 酸化. 間固定す. る. 7). また, Haug(1973)はNa, 溶 液 に 固 定 し,ク. SとNaH2PO4と. の水. リオ ス タ ッ トで 薄 切 した切 片 を 用. い て い る.こ の 方 法 で は神 経 細 胞 や グ リア細 胞 が金. 試 料 を脱 水,エ ポ ン包 埋,電 子 染色 を 行 な い 電 子 顕微 鏡 で 観 察 す る. 結. 属 との 反 応 で は な く,渡 銀 法 と して 染 っ て く る こ と が 多 い の で,こ の 研 究 で は 硫 化 水 素 ア ル コ ール 溶 液. 果. Ⅰ ) 硫 化銀 法 に 関 す る検 討 硫 化銀 法 の 原 理 は組 織 片 を 硫 化物 の 入 った 固 定 液. で 固 定 し,パ ラ フ ィン包 埋 した試 料 を使 用 した. Ⅱ ) 光 学 顕 微 鏡 的 硫 化 銀 法 に よ る結 果 硫 化 銀 法 を用 いて 脳 の 各 部 位 を染 色 す る と,暗 黒 褐 色 に 染 ま る強 陽 性 反 応 部 位 と,黒 褐 色 後 染 ま る陽. で 固定 し,同 時 に組 織 を硫 化 し,組 織 の 中 に含 ま れ. 性 反 応 部 位 と,さ. て い る重 金 属 の硫 化 物 を作 り,さ らに これ を銀 を含. 部 位 とが 観 察 され た.こ の 反 応 の 中 で 弱 陽 性 反 応 を. ん だ現 像 液 で銀 とお き換 え て 硫 化銀 の 状態 で 観察 す. 呈 す る部 位 は 染 色 法 の 少 しの 変 化 に よ り弱 陽 性 あ る. る もの で あ る.し た が っ て,写 真 の現 像 に 際 して,. い は陰 性 の 反 応 を呈 す るの で,こ. らにや や 褐 色 に染 ま る弱 陽 性 反 応. れ らの 部 位 は 金 属.
(3) 脳 におけ る重金属 の組織 化学 的研究 に よ る 陽 性 反 応 部 位 か ら 除 外 し た. A). 胞 か ら出 た 苔 状 線 維 の 終 末 部 が 認 め られ る部 位 で あ る.な おh1か. 終脳 a). 大 脳 皮 質(Cortex. diatum,. cerebri). 大 脳 皮 質 は 部 位 に よ りか な り著 しい構 造 上 の差 異 が あ る が,一. 般 に大 脳 皮 質 に は系 統 発 生 学 的 に古 い. 古 皮 質 お よ び 原 始 皮 質,な る,し. た が っ て,本. atum. らh5野 に わ た る全 野 のstratum. stratum. multiformeお. moleculareに. ra. よ び歯 状 回 のstr. お いて 陽 性 反 応 を認 め た.そ の. 他 の層 は陰 性 で あ った. Ⅱ ) 海馬 台(Subiculum). らび に新 皮 質 が 区 別 され. 研 究 に お い て も各 皮 質 ご と に 検. この 部 に お い てはstratummoleculareの. 内層 は. 硫 化 銀 反 応 は陽 性 で あ っ た が,そ の外 層 と錐 体 細 胞. 索 を 進 め た. 1). 123. 古 皮 質(狭. は 陰 性 で あ っ た.. 義 の 嗅 脳)(Paleocortex). ラ ッ トで は 狭 義 の 嗅 脳 の う ち 嗅 球 が 硫 化 銀 法 で 反 応 を 呈 し た.す. な わ ち,嗅. 球 の 最 表 層 にみ られ る嗅. 神 経 の 軸 索 は 硫 化 銀 法 で 陰 性 で あ っ た.そ. の 内方 に. あ る 嗅 神 経 の 終 末 部 と僧 帽 細 胞 の 樹 状 突 起 と が シ ナ プ ス を作 る部 位 で あ る 円形 の 嗅 糸球 は そ の 全体 が び ま ん 性 の 陽 性 反 応 を 呈 し て い た.さ. らに そ の 内方 に. 配 列 し て い る僧 帽 細 胞 の 反 応 は 陰 性 で あ っ た.僧 細 胞 層 の 内 方 に は 顆 粒 細 胞 とneuropilか 粒 層 が 認 め ら れ る が,こ. 帽. らな る顆. の顆 粒 細 胞 の 細胞 体 は硫 化. 銀 法 で 反 応 は 陰 性 で あ つ た が,. ま た は弱 陽 性 反応 を呈 す るほ か は,硫 化 銀 法 で そ の 反 応 は 弱 陽 性 か 陰 性 を呈 す るに す ぎな か っ た. 3). 新 皮 質(NeOCortex). 大 脳 皮 質 の 新 皮 質 は そ の 細 胞 構 築 か ら次 の6層 に 分 け る こ とが で き る.す な わ ち,第1層(表 第2層(外. 顆 粒 層))第3層(錐. 層))第5層(神. 在層),. 体層),第4層(内. 経 細 胞層),お. よ び第6層(多. 顆粒 形 細胞. 強 陽性 反. 層)か ら構 成 されて いる,こ れ らの6層 形 成 は大 脳 皮. 帽 細 胞 か らで た軸 索 は嗅 索 とな. 質 の 部 位 に よ りそ の 構 造 が異 な る. 一方 ,硫 化 銀 法 で 新皮 質 を 染色 す る と陽 性 あ るい. 応 を 呈 して い た.僧. neuropilほ. Ⅲ ) その 他 の 領 域 原 始 皮 質 に属 す る その 他 の領 域 で は梨 状 葉 が 陽 性. っ て 後 走 す る が この もの は 硫 化 銀 反 応 が 陰 性 で あ っ た.. は弱 陽 性 反応 を呈 す る層 と全 く反応 を み と め な い層. 狭 義 の 嗅脳 に属 す る嗅 球 以 外 の 部 位 は硫 化 銀 反 応 で 陰 性 で あ っ た. 2). 陽 性 を呈 す る部 位 は 第2層 の外 顆 粒 層 と第3層. 原 始 皮 質(Archicortex). ら. 馬 と歯. に第4層 の 内 顆 粒層 と第5層 の神 経 細胞 層 との 境 界. 海馬 台 が 硫 化 銀 法 で 陽性 反応 を呈 す る部 位. 部 か ら内 顆 粒層 後 か け て硫 化銀 法 で 陽性 また は弱 陽. で あ っ た. 1). の錐. 体 層 の 境 界 部 か ら外 顆粒 層 に か け て で あ った.さ. 原 始 皮 質 に 属 す る 部 位 の 中 で 海 馬 領 域(海 状 回)と. が 区 別 で きた.新 皮 質 の 全体 に お い て 陽 性 ま た は弱. 性 反応 部 位 を認 め た.. 海 馬 領 域(Hippocampal. formation). 新皮 質 に お い て,第1層. 海 馬 領 域 は 海 馬 と 歯 状 回 に よ り構 成 され て お り,. 層 の 内層 と第4層. の表 在 層,第3層. の錐体. の 内 顆 粒層 の外 層 との 部 位,お. よ. さ らに海 馬 と歯 状 回 は そ の細 胞 な らび に髄 鞘 構 築 学. び 第5層 の神 経 細胞 層 の 内層 は反 応 が ほ とん ど,ま. 的 に い くつ か の 分 野 と層 後 分 け られ て い る.す. た は 全 く陰性 で あ っ た.さ. ち,歯 状 回 に はstratum anulosumお. moleculare,. よ びstratum. multiformeの. ま た 海 馬 に は 脳 室 面 か らalveus, orme,. stratum. stratum. pyramidaleを. は 弱 陽性 を呈 す る場 合 が 多 か っ た.新 皮 質 は 部 位 に. 各 層 が,. よ っ て6層 形 成 の層 の 発達 状態 が異 な るた め,硫 化. murtif. 銀 法 で陽 性,ま. radiatum,. h2,. h3,. h4,お. に詳 細 に検 索 す る と,錐 体 細胞 の一 部 の もの が )そ の 細胞 体 に陽 性 反応 を認 め るだ け で 大 部 分 の もの が き. よ びh 5,. 野 が 分 類 で き た.. h5野 のstratum. radiatumのstratum. に 接 す る 領 域 と,歯 状 回 のstratum が 強 陽 性 反 応 を 呈 し た.こ. 陰 性 で あ っ た.内,外. ら. pyramidale multiformeの. の顆 粒 層 を形 成 す る細 胞 はす. べ て反 応 は陰 性 で あ った.そ れ に 反 して ,神 経 細 胞 間 のneuropilは. 海 馬 領 域 を 硫 化 銀 法 で 染 色 す る と 海 馬 のh3か. た は 弱 陽性 反応 を 呈 す る層 の 領 域 も. 部位 に よ り変 化 した.こ れ らの反 応 陽性 部 位 を さ ら. moleculare. 構 成 す る錐 体 細 胞 の 形 態,大 h1,. らに 第6層 の 多 形 細 胞 層. gr. らに 海 馬 に お い て はstra. さ お よ び 配 列 状 態 か ら, の5分. stratum. よ びstratum. の 各 層 が 分 け られ た.さ tum. stratum. pyramidale,. lacunosumお. stratum. なわ. 陽 性 ま た 弱 陽 性 反 応 を呈 し た.し. か し,新 皮 質 に お い て は硫 化 銀法 で 海 馬 領 域 で み ら れ た よ うな強 陽性 反応 部位 は 全 く認 め る こ とが で き. 層. の 領域 は歯 状 回 の顆 粒 細. な か っ た. b) 大 脳 髄 質(Substantia. medullaris. cerebri).
(4) 124. 桜. 田. 大 部 分 が 有 髄 線 維 の集 団 で あ る大 脳髄 質 は,ほ. 寛 と. ん どす べて の領 域 が硫 化 銀 法で その反応 は陰性 を呈 した. c) 大 脳核(Nuclei. 海 性 反応 か 陰 性 で あ っ た. ま た下 垂 体 もす べ て反 応 は 陰性 で あ った. c). cerebri). 大 脳 核 に属 す る核 と して は)尾 状 核,レ ンズ核(被 殻 と淡 蒼 球),前 障,扁 桃 体 が あ る.こ れ らの 核 の う. 才3脳 室(Ventriculus. tertius). 才3脳 室 壁 に は脳 室 周 囲 器 官 群(終 板 器 官,脳 弓 下 器 官,松 果 体,交 連 下 器 官,傍 室 器)最 後 野 な ど). ち前 障 は硫 化 銀 法 で そ の反 応 は陰 性 で あ った が,そ. が存 在 す るが,こ れ らの器 官 は硫 化 銀 法 で す べ て 反. の他 の核 はす べ て 陽 性 反 応 を呈 した.. 応 は陰 性 で あ っ た.た だ才3脳 室 脈 絡叢 の 一 部 が 強. 1)尾 状 核 と レン ズ核(被 殻 と淡 蒼 球) caudatusとNucleus. (Nucleus. lentiformis). 陽 性 反 応 を呈 して い た. C). 中. 脳(Mesencephalon). 尾 状 核 と被 殻 は その 組 織 学 的 な 構 造 は ま った く同. 中脳 に お い て硫 化 銀 法 で陽 性 反 応 が み と め られ る. 様 で,両 核 を形 成 す る神 経 細 胞 は 小 型 の もの が大 部. 部 位 は赤 核 と黒 質 で あ っ た.赤 核 で は これ を構 成 す. 分 で,そ の 中 に大 型 の 細 胞 が 少 し混 在 して い た.こ. る神 経 細 胞 は一 部 の もの が陽 性 反 応 を呈 す る以 外 の. れ らの 神 経 細 胞 は いず れ も硫 化 銀 法 で 反応 は 陰性 で. 大 部 分 の神 経 細 胞 は反 応 が陰 性 で あ っ た.こ の 細 胞. あ っ た.ま た,両 核 内 に は有髄 神 経 線 維 の小束 が 多. の 間 後存 在 す るneuropilが. 数 み とめ られ るが,こ れ らもす べ て 反応 は 陰性 で あ. た.一 方,黒 質 は緻 密 部 と網 様 部 に分 け られ るが,. っ た.し か しこれ らの神 経 細 胞 の間 を構 成 す るneu. 緻 密 部 で は これ を構 成 す る神 経 細 胞 の ほ とん どす べ. 弱 陽 性 反 応 を呈 して い. ropilは 陽 性 反 応 を呈 した.こ の よ うな陽 性 反 応 の,. て が硫 化 銀 法 で陰 性 で あ っ た.細 胞 の 間 に あ るne. 核 内 後 お け る部 位差 はな か った.一 方,淡 蒼 球 は尾. uropi1の み が 弱 陽 性 反応 を呈 して いた.網 様 部 は そ. 状 核 や 被殻 と その 構 造 は ほ ぼ 同一 で あ り,反 応 陽性. の すべ て に お い て反 応 が陰 性 で あ った.中 脳 の その. 部 位 はneuropilの. 他 の部 位 は,反 応 が陰 性 で あ っ た.. み で あ った.し か も,陽 性 反 応. は尾 状 核 な どに 比較 す る とか な り弱 か った. 2). 扁 桃 体(corpus. amygaloideum). 扁 桃 体 は 主 核 と亜核 か ら構 成 され てい る核 で ある. す な わ ち,外 側 核,基 底 核,中. 心核,皮 質 核,内 側. 核 に 分 け られ た.こ れ らの核 の 中 で硫 化銀 法 で強 い. D). 小. 脳(Cerebelum). 小脳 後 お い て は小 脳 皮 質,髄 質,お. よ び 小脳 核 の. い ず れ の 部位 も硫 化 銀 法 で反 応 は陰 性 で あ った. E). 橋 と延 髄(PonsとMedulla. oblongata). 橋 や延 髄 に は脳 神 経 に属 す る核 が 多数 存 在 す る が. 陽性 反応 を呈 す る部 位 と して外 側 核 の外 側 縁,外 側. い づ れ の核 も硫 化銀 法 で は 反 応 が陰 性 で あ った.こ. 核 の腹 内側 部,基 底 核 の小 細胞 性 部,中 心核 の外 側. れ らの核 以外 の 部位 もすべ て に お い て 反応 を 呈 しな. 部,お よ び皮 質核 な どが観 察 で きた.扁 桃 体 の そ の. か った.. 他 の 部位 は 弱陽 性 か,ま っ た く陰 性 を呈 した. B). 間. 脳(Diencephalon). 間脳 は大 き く視 床 脳 と視 床 下 部 に分 け られ る. a). 視床 脳(Thalamencephalon). 視 床 脳 に属 す る部 位 と して は視 床 上 部)背 側 視 床 お よ び腹 側 視 床 が あ るが,こ れ らの部 位 は いず れ も 硫化 銀 法 で は陽 性 反 応 部 位 を み とめ る こ とが で きな か った. b). Ⅲ ). 電 子 顕微 鏡 的 硫化 銀 法 に よ る結 果. 光 学 顕微 鏡 的組 織 化 学 に お い て 重 金属 の 証 明 の た め に使 用 され て い る硫 化銀 法 を電 子 顕微 鏡 レ ベ ル に 利 用 で き るよ うに改 良 され た方 法(IbataとOtsuka 1968, 1969)後. よ りラ ッ トの 海馬 領 域 にみ られ る苔. 状 線維 終末 を 観 察 した. ま ず,硫 化銀 反応 を 行 な わ な い 正 常 の 苔 状 線 維 終 末 を電 子 顕微 鏡 で み た.苔. 視 床 下 部(Hypohalamus). この 部位 は 多数 の神 経 核 に よ り構 成 され て い るが,. 状 線 維 終 末 は 海 馬 のh3‑. h6野 の錐 体 細胞 の樹 状 突起,と. くに その 棘 を取 り囲. み大 きな 膨 み とな って 終末 して い た‑.状. 突起 か ら. 硫 化 銀 法 で染 め る と才3脳 室 の前 部 の脳 室 に そ っ て. 突 出 した 一 つ の 棘 は 二,三 の 分 岐 を繰 り返 し,こ の. 強 陽 性 反 応 部 位 が み とめ られ た.こ の 部 は室 傍 核,. 分 岐 した 一 つ の 棘 に1〜2個. 腹 内側 核,背. れ を取 り囲 ん で 終 って いた.ま た 苔 状 線 維 終末 は 一. 内側 核 に よ り作 られ た もの で あ る.こ. の苔状線維終末 部が こ. れ らの 核 で は,そ の 神 経 細 胞 は ご く少 しの細 胞 が陽. 部 で は平 滑 な 樹 状突 起 の 根 幹 と もシ ナ プ ス を作 って. 性 反 応 を呈 して い る が,ほ か の大 部 分 の 細胞 は陰 性. い た.こ の 大 きな 終 末 部 の 中 に は きわ め て 多数 の 密. で あ っ た.し たが っ て陽 性 反 応 が み られ る組 織 は,. 集 した シ ナ プス 小胞(直 径 約500A)が. neuropilで. そ の 全 体 を満 た して い た.ま た,こ. あ った.上 記 の 核 以 外 の核 はす べ て 弱陽. 含 ま れ,ほ ぼ の シ ナ プス 小 胞.
(5) 脳 にお け る重金 属 の組 織 化学 的研 究. 125. 後 ま じ って,小 量 で は あ るが 電 子密 度 の高 い 小顆 粒. の物 質 が 流 出 しや す く,ま た ク リオス タ ッ トで は連. を含 ん だ含 粒 小 胞(直 径 約1000A)が. 続 切 片 が 作 りに くい な どの 点 か ら硫化 水 素 アル コ ー. 観 察 され た.さ. らに これ らの小 胞 と は別 個 に比 較 的 多 数 の ミ トコ ン. ル溶 液 で 固 定 し,パ ラ フ ィン包 埋 の方 法 を用 い た.. ドリアが 混在 して い た.シ ナ プス膜 の 状態 は,棘 に. ま た反 応 液 で 反応 させ る場 合,光,温. 終 わ る場 合 後 は,シ ナ プ ス前 膜 はや や 電 子 密 度 が 高. 度)反 応 時 間. が問 題 とな る.こ の 問 題 に 関 して は す で に結 果 の 項. く,シ ナ プス後 膜 側 で は さ らに濃 い 太 い 線 と して認. での べ た ご と く,非 特異 性 の反 応 が起 り特 異 性 な反. め られ た.両 膜 は 約200Aの. 応 との 判 定 が 困 難 とな る.特 にHaug(1973)が. 明 る い間 隙 を もって 相. 報告. 対 して いた.樹 状突 起 根 幹 部 の表 面 に終 る シナ プス. して い る よ うな硫 化 銀 法 陽性 の神 経細 胞 や グ リア細. 膜 は とこ ろ ど ころ で前,後 膜 と もや や 肥厚 す るが両. 胞 の 多 くの もの は 重 金属 の た め の特 異 的 な 反応 で は. 者 の 間 に は電 子 密度 の差 は なか っ た.ま た,い ず れ. な く,神 経 組 織 の好 銀性 の性 質 か ら起 った 非 特 異 性. の場 合 も,シ ナ プス前 膜 に接 近 して シ ナ プ ス小胞 が. の反 応 に よ り生 じた もの と考 え られ る.. 集 積 して い る像 は ほ とん ど観察 で きなか った.さ. ら. に棘 内 部 に は,い わ ゆ る棘 装 置 を認 め る こ とが で き. Spatz(1922)に. よ り脳 の 中 に も重 金 属,特 に鉄 が. 存 在 して い る こ とが 始 め て 報告 され た が,そ の 後, これ に 関す る研 究 は それ ほ ど発展 をみ な か っ た‑近. な か った. 次 い で,電 子 顕 微 鏡 用 に 改良 され た硫 化 銀 法 で 海. 年 に な っ て ジチ ゾ ン を生 体 的 に 注 射 す る と,生 体 内. 馬 領 域 の苔 状 線 維 終 末 を中 心 に 観 察 を行 な った.硫. に存 在 す る重 金 属 と反応 し,組 織 を紅 染 さ させ る ジ. 化 銀 法 で 染色 し,エ ポ ン包 埋 され た 切片 を トル イ ジ. チ ゾ ン法 を使 用 し, Maske(1955)が. ン青 で 染色 した光 学 顕 微 鏡 用 標 本 に お い て も,す で. 定 部 位 後重 金 属 が 含 ま れ て い る こ と が 明 らか に し. に錐 体 細 胞 の樹 状突 起 表 面 に黒褐 色 の銀 粒 子 の沈 着. た.そ の後)緒 言 で記 載 した ご と く,こ の 部 位 が組. が認 め られ た 。 これ を電 子 顕 微 鏡 で 観 察 す る と銀 粒. 織 化 学 的 後,ま た,電 子 顕微 鏡 的 に詳 細 に 研 究 され,. 子 は苔 状 線 維 終末 部 内 にの み沈着 し,そ れ 以外 の錐. 現 在 で は この 部 に存 在 す る重 金 属 は亜 鉛 で あ る こ と. 体細 胞,顆 粒 細胞,神 経 膠 細 胞,苔 状 線 維 終末 以外. が 明 らか 後 され て い る(Otsukaほ か1975). 一方 ,海 馬 領域 以外 の部 位 に お け る重 金 属 を組 織. の神 経 終 末, neuropilら. に は全 く沈 着 が認 め られ な. 海 馬 領 域 の一. か っ た.こ の よ うな 反応 陽 性 の神 経 終末 に お い て は. 化 学 的 に 研 究 した 報 告 はHaug(1973)の. 銀 粒 子 は シ ナ プス小 胞 上 に局 在 し,ミ. あ る‑し か し,こ の 研究 と本 研 究 で は硫 化銀 法 の 方. トコ ン ド リア. や シ ナ プス膜 上 に は 観察 で きなか った. 考. 法 が 異 な るた め か,か な りの所 見 の ち が い が み とめ られ た.わ れ わ れ の 研究 で は硫 化 銀 反応 で 強 陽 性 あ. 察. る い は陽 性 反 応 を呈 す る部位 の 中 に存 在 す る神 経 細. この 研 究 に 使 用 した硫 化 銀 法 はTimm(1958)や, Voigt(1951,. もの だ け で. 胞 や グ リア細 胞 は ご く一 部 の もの が,反 応 が 陽 性 で. 1959)ら に よ り開発 され た 重 金属 を 検. あ る にす ぎなか っ た.一 方, Haug(1973)の. 報告 に. 出す るた め の組 織化 学 的 な方 法 で あ る.こ の方 法 は. よ る と陽 性 反 応 を呈 す る部 位 の 他 に,周 囲 の組 織 は. これ まで に 開 発 され た組 織 化 学 的 に重 金属 を証 明 す. 陰 性 で あ っ て も神 経 細 胞 や グ リア細 胞 の み が 陽性 を. るた めの 方 法 と して は 最 も良 い方 法 で あ る.(Haug. 呈 す る部 位 が,か な り記 載 され て い る.こ れ は 先 後. 1973)ま. た,こ の方 法 は重 金 属 を硫 化 物 と して組 織. 内 に沈着 させ,こ れ を銀 と反 応 させ 硫 化 銀 を生 ぜ し め,こ の 銀粒 子 を顕 微 鏡 で観 察 す る もの で あ る.す なわ ち,こ の方 法 は理 論 的 に は写 真 の 現像 の 原 理 を 利 用 した もの で あ る.. も述 べ た よ うに硫 化 銀 法 に よ る非 特 異 性 反応 を も反 応 陽 性 部 位 と して い るた め だ と思 わ れ る. 本 研 究 に よ っ て脳 に お け る硫 化銀 法 の 強 陽 性 反 応 あ るい は 陽性 反応 部位 と して認 め られ た もの は嗅 球 海馬 領域,海 馬 台,尾 状 核,レ. この方 法 に お いて,組 織 の 固 定 と反応 液 に作 用 さ. 傍 核,才3脳. 室 脈 絡叢,な. ンズ 核,扁 桃 体,室. どが あ り,ま た,陽 性 反. せ る時 間 が 問題 と な る.組 織 の 固 定 には わ れ わ れ は. 応 あ るい は 弱 陽性 反応 部 位 と して は,大 脳 の 新皮 質. 硫 化水 素 で飽 和 され た アル コ ール 溶 液 を使 用 し,パ. 赤 核,黒 質 な どで あ った‑こ れ らの 部 位 の 中 で 嗅 球,. ラフ ィン包 埋 した もの を用 い た がHaug(1973)ら. 海 馬 領 域,海 馬 台,扁 桃 体 な どの 部 位 は,い わ ゆ る. は. 硫 化 ナ トリウ ム水 溶 液 で 固 定 し ク リオ ス タ ッ ト切 片. 大 脳 辺 縁 系 に属 す るか,あ. を使用 した.大 塚 ら(未 発 表)は,こ. の両方の方法. る い は辺 縁 系 に 近 い 働 き. を して い る と考 え られ る部 位 で あ る.し か も,こ れ. を 検討 した.そ の 結 果,水 溶 液 の 固 定 液 で は水 溶 性. らの 各 部 位 で陽 性 反 応 物 質 の存 在 す る組 織 はす べ て.
(6) 126. 桜. 神 経 細胞 で は な く)い わ ゆ る, neuropi1と. 田 い われ る. 組 織 構 造 を呈 す る部位 であ った. Neuropi1と. は脳 組. 寛. 海 一方. ,脳 に存 在 し,上 記 の よ うな働 きを す る と考. え る重 金 属 は い か な る金属 で あ るか と い う こ とは 不. 織 の 中 で神 経 細胞 を の ぞ い た組 織 を い うので あ るか. 明 な 点 が 多 い.古. ら,こ こに は 多 くの神 経 線 維,シ. に は鉄 が含 ま れ て い る こ とが 報 告 されて 来 た(Spatz. ナ プ ス,グ. リア細. くか ら錐 体 外 路 系 に属 す る神 経 核. 胞 な どが存 在 す る. 一 方 ,電 子 顕微 鏡 用 に改 良 され た硫 化 銀 法 で 海馬. 1922).し た が って,本 研 究 に お い て 錐 体 外 路 系 に 関. 領域 の苔 状 線 維 終末 部 を 観察 す る と,す で にHaug. た硫 化 銀 法 に よ る陽 性 反応 物 質 は 鉄 を含 む物 質 で あ. (1967)やIbataとOtsuka(1968,. ろ う と考 え られ る.. 1969)ら. が 発表. して い る と同様 に苔 状 線 維 終末 部 内 の シ ナ プス 小胞. 係 す る尾 状核)レ. ンズ 核,赤 核,黒. 質 に み と め られ. ま た,海 馬 領 域 に み られ る硫 化 銀 法 に よ る陽 性 物. 上 に陽 性 物 質 で あ る銀 粒 子 の 沈着 が証 明 で きた‑海. 質 は分 光 計 測(Maske. 1955)や オ ー トラ ジ オ グ ラ フ. 馬 領 域 の部 位 以 外 は まだ 電 子 顕微 鏡 に よ る組 織 化学. イー に よ る研 究(von. Euler 1961, Osukaほ. で は観 察 を行 な って い な い の で 確 定 は で きな い が,. 1967, Otsukaほ. か1975)か. カ),. ら亜 鉛 で あ る と考 え られ. 光 学 顕 微 鏡 に よ る観 察 で み られ た大 脳 辺 縁系 に お け. て い る.し か し,そ の他 の大 脳 辺 縁 系 の 中 の 硫 化 銀. る硫 化 銀 法 で陽 性 反 応 部 位 は,い わ ゆ るneuropil. 反 応 陽 性 を呈 す る部 位 は いか な る重 金 属 を含 ん で い. で あ って,し か も神 経 終 末 が 多数 み とめ られ る組 織. るか とい うこ とは ま だ全 く不 明 で あ る.た だ,本 研. 構 造 を もって い るの で,お そ ら く,こ の反 応 陽 性 物. 究 にお い て も明 らか な よ うに,海 馬 領域 以 外 の 大 脳. 質 は シ ナ プス を形 成 す る シナ プ ス前 線 維 の終 末 部 に. 辺 縁 系 の 陽 性 反 応 部 位 は,海 馬 領 域 と同様 に シ ナ プ. あ るの で は な い か と考 え られ る.. ス が 多 く認 め られ る とこ ろ で あ る の で,こ れ らの 部. さ ら 後,硫 化銀 法 に よ り陽 性,ま を呈 す る部 位 と して,尾 状 核,レ. た は弱 陽 性 反 応. ン ズ核,赤 核,黒. 位 に も重 金 属 と して 亜 鉛 が 含 まれ て い るの で は な い か と推 察 で き る.し か も,こ れ らの重 金 属 を含 ん だ. 質 な どが あ っ た.こ れ らの核 は いず れ も錐 体 外 路 系. 物 質 は大 脳 辺 縁 系 の 特 有 な機 能 に 関係 した 動 き を し. に属 す る核 で あ る.こ れ らの 部 位 にお いて も陽 性 反. て い る こ と も考 え られ る.今 後,さ. 応 が認 め られ るの は これ らの 核 を構 成 して い る神 経. の 詳 細 な検 索 が 必 要 で あ る.. 細胞 で は な く, neuropilで. あ っ た.し た が って,大. らに 多 方 面 か ら. また,室 傍 核 は神 経 分 泌 機 能 を有 して お り,下 垂. 脳 辺 縁 系 の場 合 と同 様,に 反 応 陽 性 物 質 は これ らの. 体 後 葉 ホ ル モ ン を生 産 す る細 胞 で あ る の で,こ の 部. neuropilを. に存 在 す る重 金 属 も神 経 分 泌 物 に含 ま れ て い るの で. 構 成 す る シナ プス前 線 維 の 終 末 部 に含 ま. れ て い るの で はな いか と推 察 で き る. ま た,大 脳 皮 質 の 新 皮 質 も硫 化 銀 法 で,陽 性 あ る. は ない か と考 え られ る が しか し,こ の核 と同 様 な 働 き を もつ 視 索 上 核 に は硫 化 銀 法 で 陽 性 を呈 す る物 質. い は 弱陽 性 反 応 を呈 す る部 位 が あ った.そ れ は新 皮. を み と め る こ と がで きな い こ とや,室 傍 核 内 に お い. 質 の6層 形 成 の 中 の 外 顆 粒 層 と錐 体 層 の 境 界 部 と,. て も,神 経 分 泌 細 胞 は反 応 が 陰 性 で あ る と ころ か ら. 内顆 粒 層 と神 経 細 胞 層 の 境 界 部 の 部 位 で あ った.こ. この 重 金 属 は神 経 分 泌 物 に は 関係 が な い よ うに 思 わ. の2つ. の 陽 性 反 応 部 位 は い ず れ も錐 体 細 胞 の 樹. れ る.そ れ よ り もむ しろ,こ の重 金 属 が い か な る金. 状突 起 の根 部 で構 成 され て お り,こ の 樹 状 突 起 の 表. 属 か と い うこ とは不 明 で あ る が,先 に も述 べ た よ う. 面 に は 多数 の 神 経 終 末 が 認 め られ た.し たが って,. に神 経 分 泌 細 胞 に終 る シ ナ プ ス前 線 維 の 終末 部 内 に. 反 応 陽 性 物 質 は こ こで もシ ナ プ ス前 線 維 の 終 末 部 に. 含 まれ て,神 経 伝 達 機 能 に 関係 す る もの と考 え られ. 含 ま れ てい るの で は ない か と思 わ れ る.. る.. さ らに,室 傍 核 と その 周辺 部 も硫 化 銀 法 で 陽 性 反 結. 応 を呈 した.こ の 核 で も反応 陽 性 物 質 は神 経 細 胞 で はな くneuropilに. 認 め られ,こ こ で もシナプス に存. 在 す る もの と考 え られ る. この よ うに,脳 に み られ る重 金 属 は,そ の 大 部 分. 語. 硫 化 銀 法 を用 い て ラ ッ トの脳 に お け る重 金 属 の分 布 状 態 を光 学 顕 微 鏡 と電 子 顕微 鏡 で 観察 し た. 光 学 顕 微 鏡 に よ る観察 か ら,硫 化 銀 法 に よ る反 応. の もの が シナ プス,特 に シナ プス 前 線 維 終 末 部 に含. 陽 性 物 質 は大 脳 辺 縁 系 に属 す る嗅 球,海 馬 領 域,海. まれ て い る と考 え られ る こ とか ら,こ れ らの 物 質 は. 馬 台,お. 神 経伝 達 物 質 か,あ. 系 に属 す る尾 状核,レ. るい は,伝 達 後関 係 す る酵 素 類. に含 まれ て い る もの と思 わ れ る.. よ び扁 桃 体 に認 め られ た.ま た,錐 体 外 路 ンズ核,赤. も反 応 陽 性 物 質 が証 明 され た,さ. 核,お. よ び黒 質 に. ら に ま た,大 脳 皮.
(7) 脳 に お け る重 金 属 の組 織 化学 的 研究 質 の 新 皮 質 や室 傍 核 に も反 応 陽 性物 質 が 観 察 され た. これ らの 各部 位 で,反 応 陽 性 物 質 は どの 部 位 に お いて も,そ の部 を構 成 す る神 経 細胞 内 に は ほ とん ど. 銀 法 に よ る反 応 陽 性 物 質(こ. 127 こで は重 金 属)と. シナ. プ ス,特 に,シ ナ プ ス前 線 維 の 終末 部 との 形 態 学 的 な ま た は機 能 的 な関 係 が検 討 され た. 認 め られ ず,多 数 の シ ナ プ ス がみ とめ られ るneuro らに海 馬 領域 の電 子 顕 微 鏡 に. 稿 を終 えるにあた り)ご 懇 篤 なる ご指導 とこ校 閲 を賜. よ る硫 化 銀 法 の観 察 か ら反応 陽 性物 質 は苔 状 線 維 終. わ った大 塚長康教授 に深 く感謝 いた します.ま た,終 始. opilに 見 出 され た.さ. 末 内 の シ ナ プ ス小胞 に一 致 して 分 布 して い る こ とが. ご助言 とご指導 をいただ いた佐 々木順造 博 士)苅 田成人. わ か っ た.. 技 官内藤 由美子女 史の ご援助 後心か ら感謝 いた します.. これ らの検 索 結 果 か ら,脳 内 にみ とめ られ る硫化. 文. (本論文 の要旨 は第18回 日本組 織細胞 化学会 に発表 した). 献. 1) Euler, C. von: On the significance of the high zinc content in the hippocampal formation. In physiologie de I'hippcampe. Editions du Cantre National de la Recherche Scintifique, Paris, P. 135, 1962. 2) Fleischhauer, K. and Horstmann, E.: Intravitale Dithizonfarbung homologer Felder der Am monsformation von Saugern. Z. Zellforsch., 46, 598, 1957. 3) Haug, F. M. S.: Electron microscopical localization of the zinc in hippocampal mossy fiber synapses by a modified sulfide silver procedure. Histochemie, 8, 355, 1967. 4) Haug, F. M. S.: Heavy metals in the brain. A light microscope study of the rat with Timm's sulphide silver method. Methodological considerations and cytological and regional staining. 5) 6) 7) 8). patterns. Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology, Springer Verlag, New York, P. 71. 1973. Ibata, Y. and Otsuka, N.: Fine structure of synapses in hippocampus of the rabbit with spe ial reference to dark presynaptic endings. Z. Zellforsch., 91, 547, 1968. Ibata, Y. and Otsuka, N.: Electron microscopic demonstration of zinc in the hippocampal for mation using Timm's sulfide-silver technique. J. Histochem. Cytochem., 17, 171, 1969. Maske, H.: Uber den topochemischen Nachweis von Zink in Ammonshorn vershiedener Saug etiere. Naturwissenschaften, 42, 424, 1955. McLardy, T.: Neurosyncytial aspects of the hippocampal mossy fibre system. Confin. neu rol. 20, 1, 1960.. 9) McLardy, T.: Zinc enzymes and the hippocampal mossy fibre system. Nature, 194, 300, 1962. 10) McLardy, T.: Some cell and fibre peculiarities of uncal hippocampus. In: The rhinenceph alon and related structures. Progress in brain research, vol. 3. P. 70. Amsterdam: Else vier. 1963. 11) McLardy, T.: Second hippocampal zinc-rich synaptic system. Nature, 201, 92, 1964. 12) Otsuka, N. and Kawamoto, M.: Histochemische and autoradiographische Untersuchungen der Hippocampus-formation der Maus. Histochemie, 6, 267, 1967. 13) Otsuka, N. and Umetani, M.: Chemocytoarchitechtonics of ammon's formation. Proc. Jap . Histochem. Ass., 3 , 231, 1962. 14) Otsuka, N., Okano, H. and Yokoyama, K.: A study on the mossy fiber endings in the hipp ocampal formation by electron microscopic auto radiography. Acta Histochem. Cytochem., 8, 175, 1975..
(8) 128. 桜. 15) Spatz, H.: Uber motorischen 16) Timm, F.:. den Eisennachweis. System. Virchows Zur Histochemie. 田. 寛. im Gehirn,. Arch.. path.. 海. besonders. Anat.,. Bauchspeicheldrusen. (unter besonderer. Metalvergiftungen). Virchows. Z. Zellforsch.,. Beriicksichtigung. Arch.. path.. des extrapyramidal. 77, 261, 1922.. des Ammonshorngebietes.. 17) Voigt, G. R.: Histologische Versilberungen. Habil.-Schr. 18) Voigt, G. R.: Untersuchungen mit der Sulfidsilbermethode nteller. im Zentren. Anat.,. 48, 548, 1956.. Jena, 1951. an menschlichen des Diabetes. and tierischen. mellitus. and experime. 332, 295, 1959.. 写 真 の 説 明. 写 真1.. 嗅 脳,硫 化 銀 法 ×40. 写 真2.. 嗅 球 を中 心 と した拡 大像,同 上 ×60. 写 真3.. 海 馬 領 域,同 上 ×20. 写 真4.. 新 皮 質,同 上 ×30. 写 真5.. 尾 状 核,同 上 ×17. 写 真6.. 扁桃 体,同 上 ×27. 写 真7.. 視 床 下 部,陽 性 反 応 を呈 す る室 傍 核 が 認 め られ る.同 上 ×20. 写 真8.. 視 床 下 部,室 傍 核 を 中心 とし た反 応 陽 性 部位 が 観 察 され る.同 上 ×20. 写 真9.. 視 床 下 部,反 応 が陰 性 の 視 索 上 核 が 認 め られ る.同 上 ×20. 写 真10. 第3脳 室 周 囲 器 官 群 に属 す る交 連 下 器 官,反 応 は陰 性 で あ る.同 上 ×18 写 真11. 第3脳 室 脈 絡 組 織,そ の 一 部 分 が 反応 陽 性 で あ る.同 上 ×17 写 真12. 小 脳 と延 髄,両 部 位 と も反 応 は陰 性 で あ る.同 上 ×13 写 真13. 苔 状 線 維 終 末 部 の 電 子 顕 微 鏡像,終 末 内 に多 数 の シ ナ プス 小 胞 が 認 め られ る.×38,000. 写 真14. 電 子 顕 微 鏡 用 硫 化 銀 法 に よ る苔 状 線 維 終末 像,終 末 内 の シ ナ プス 小 胞 に 一 致 して 反応 陽 性 物 質(銀 粒 子)が 分 布 して い る像 が 認 め られ る.×32,000..
(9) 脳 にお ける重金属の組織化学 的研究129 桜. 写真1. 写真3. 写 真5. 田. 寛. 海. 論. 文. 附. 図. 写真2. 写真4. 写真6.
(10) 130. 桜 桜. 田. 田 寛. 海. 寛 論. 海 文. 附. 図. 写真7写. 真8. 写 真9写. 真10. 写 真11. 写 真12.
(11) 脳 における重金属の組織化学 的研究 桜. 田. 寛. 海. 論. 写 真13. 写真14. 文. 附. 図. 131.
(12) 132. 桜. Histochemical. study. 田. 寛. of heavy. 海. metals. in the. brain. by Hiromi Department. of Anatomy, (Director:. SAKURADA. Okayama. University. Medical School. Prof. Nagayasu Otsuka). The distribution of heavy metals were studied in rat brain by light and electron microscopy with the sulfide silver method. Reaction products by this method were found under light microscopy in olfactory bulb, the hippocampal formation, subiculum, and amygdaloid nucleus belonging to the limbic system, and in caudate nucleus, lenticular nucleus, red nucleus and substantia nigra belonging to the extrapyramidal tracts. These products were also observed in neocortex of cerebral cortex and paraventricular nucleus. These reaction positive-materials were not found in nerve cell bodies in all these area but found in neuropil containing many synapses. Electron microscopic observation of the hippocampal formation showed that these materials were distributed in synaptic vesicles of the mossy fibers. From these results the morphological and functional relationship between these products (heavy metals) and synapses, especially the ending of presynaptic fibers, were discussed..
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