氏 名・（本籍） 佐
さ
藤
とう
輝
てる
紀
き
（秋田県）
専 攻 分 野 の 名 称 博士（医学）
学 位 記 番 号 医博甲第 858 号 学 位 授 与 の 日 付 平成 26 年 3 月 22 日
学 位 授 与 の 要 件 学位規則第 4 条第 1 項該当 研 究 科 ・ 専 攻 医学系研究科医学専攻
学 位 論 文 題 名 Apelin is a positive regulator of ACE2 in failing hearts
（心不全病態においてアペリンは ACE2 の陽性調節因子である）
論 文 審 査 委 員 （主査） 教授 尾 野 恭 一
（副査） 教授 羽 渕 友 則 教授 長谷川 仁 志
Akita University
学位論文内容要旨
Apelin is a positive regulator of ACE2 in failing hearts.
心不全病態においてアペリンは
ACE2の陽性調節因子である
申請者 秋田大学大学院 循環器内科学 佐藤輝紀
研究目的
ApelinはAPJレセプターに結合することで多彩な生理活性を発揮する内因性のペプチドリガン
ドである。心臓における強力な陽性変力作用、血管拡張作用や血管新生、インスリン感受性の改 善や、中枢神経系における水分調節作用などが報告されており特に心血管系の治療ターゲットと して近年注目されている。ApelinはAngiotensin converting enzyme2 (ACE2)の基質であること もin vitroの実験で報告されているが、その生理的な意義は明らかではない。また、Apelinシス テムがレニン―アンジオテンシン系(RAS)に拮抗的に作用するという報告がなされているが、心 臓における機能的な意義はいまだ明らかでない部分が多い。そこで私たちは、心機能調節におけ るApelinとRASの相互作用の機能的意義を、特にACE2に着目し、ノックアウトマウスの機能 解析を用いて明らかにすることを目的とした。
研究方法
マウス；Apelin, ACE2, AT1R遺伝子欠損(KO)マウスを作製した。またApelin/AT1R遺伝子二重 欠損(ダブルKO)マウスも作製した。それらのマウスの心機能は動物用心エコー(Vevo770)で測定 している。マウスの心臓における遺伝子発現解析は定量RT-PCR、蛋白発現をウエスタンブロッ トで評価した。
圧負荷心肥大モデル；マウスの心臓圧負荷モデルとして、横行大動脈縮窄手術(TAC)を用いた。
麻酔下に大動脈を剖出し、7-0silkで27G針と共に縛って大動脈に狭窄を作製する。2週間または 8週間後に心エコーで心機能評価し、その後に心臓をサンプリングした。
マウスの薬物投与；ARB投与はロサルタンカリウムを0.6g/Lの濃度で飲み水に混ぜ、6週間投与 した。Apeiln-13ペプチド、Ang1-7ペプチドは1mg/kg/dayの投与速度となるように浸透圧ポン プをマウスの皮下に挿入し、2週間持続投与した。
メタボローム解析(RAS fingerprint)；RASのペプチド変換酵素活性を評価する為、マウスの血液 をヘパリン添加チューブに採取し、血漿を凍結保存。平衡化した後に、アンギオテンシンペプチ ドを網羅的に測定した。
ACE2レポーターアッセイ；培養細胞であるHEK293T細胞やVero E6細胞を用いて、ACE2レ ポータープラスミドとAPJレセプタープラスミド、AT1レセプタープラスミドをトランスフェク ションし、ApelinやAngiotensinIIを添加することでACE2の転写活性がどのように変化するか をルシフェラーゼアッセイにて評価した。
研究成績
ApelinKOマウスの心臓においては、ACE2の発現量が有意に低下していた。また、ApelinKOマ ウスの血漿中における、ACE2活性も同様にして有意に低下していた。さらに、血漿サンプルに おけるメタボローム解析ではACE2の低下を反映してアンジオテンシン1-7 (Ang1-7)が有意に低 下していることを見出した。
ApelinKOマウスの心機能は12か月齢において野生型と比較して有意に低下しているが、ARB
を投与することによって改善することができた。さらに、AT1R/ApelinダブルKOマウスを作製 したところ、TAC手術による圧負荷モデルにおいても、ApelinKOマウスの心機能低下は改善さ れた。重要なことに、TACにより低下するApelinKOマウスの心機能はAng1-7を投与すること で改善することができた。
一方で、Apelinペプチドを外因性に野生型マウスに投与することで心臓のACE2が上昇した。培 養細胞におけるACE2レポーターアッセイの結果からも、ApelinはACE2のプロモーター活性 を上昇させてACE2を制御することが明らかとなった。
最後に、AT1R KOマウスにおいてもApelinを投与することで、ACE2の発現上昇が見られ、
Apelinの陽性変力作用が確認されたことから、ApelinはAT1R非依存的にACE2を制御するこ とが明らかとなった。
結論と考察
これまでの先行研究から内因性のApelin が欠損することによってマウスの心機能が低下するこ とが分かっていたが、今回の研究により内因性Apelinの欠損によりACE2, Ang1-7の発現が減少 することが分かった。同様に、外因性のApelinは野生型マウスのACE2発現を上昇させ、心機 能を改善した。さらに、その作用はAT1R とは独立な機構であったことから、ApelinがACE2 の発現を誘導するという新しいシグナル経路が存在することが分かった。すなわち、ACE2が ApelinシステムとRASを共役させていて、ApelinはACE2を正に調節することで心機能調節に おいて重要な役割を担っていると考えられた。一方で、ApelinがACE2の基質であるという先行 研究から、ACE2はApelinのネガティブフィードバック機構として存在しているとこれまで考え られてきたが、本研究において、Ang1-7によりApelin欠損マウスの心機能を改善したことから、
ApelinがACE2を介してAng1-7 シグナルを活性化する、つまりApelinシグナルの下流におい
てACE2がAng1-7の正の調節因子として機能することが初めて明らかになった。また、本研究
ではApeilnがACE2を転写性に制御していることを示したが、詳細なメカニズムは解明の余地
がある。将来的にはApelin-ACE2-Ang1-7分子ネットワークが新たな治療法の開発につながる可 能性があり、臨床研究も含めて今後の課題としたい。
