氏 名・（本籍） 伊

氏 名・（本籍） 伊

い

藤

とう

智

とも

夫

お

（秋田県）

専 攻 分 野 の 名 称 博士（医学）

学 位 記 番 号 医博甲第 854 号 学 位 授 与 の 日 付 平成 26 年 3 月 22 日

学 位 授 与 の 要 件 学位規則第 4 条第 1 項該当 研 究 科 ・ 専 攻 医学系研究科医学専攻

学 位 論 文 題 名 No Involvement of Acid Sphingomyelinase in the Secretion of IL-6 from alveolar Macrophages in neonatal rat

（酸性スフィンゴミエリナーゼはラット肺胞マクロファージからの IL-6 分泌に 関与しない）

論 文 審 査 委 員 （主査） 教授 橋 本 学

（副査） 教授 南 谷 佳 弘 教授 三 浦 昌 朋

Akita University

学 位 論 文 内 容 要 旨

No Involvement of Acid Sphingomyelinase in the Secretion of IL-6 from alveolar Macrophages in neonatal rat

（ 酸 性 ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ナ ー ゼ は ラ ッ ト 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ か ら の IL-6 分 泌 に 関 与 し な い ）

申 請 者 氏 名 伊 藤 智 夫

研 究 目 的

新 生 児 慢 性 肺 疾 患 （ CLD: chronic lung disease of newborn） は 長 期 の 治 療 を 要 す る 合 併 症 で 、 そ の 有 無 は 未 熟 児 の 予 後 を 大 き く 左 右 す る 。 CLD の 病 因 は 多 因 子 性 と さ れ 不 明 な た め 確 立 さ れ た 治 療 法 は な い 。 最 近 、 絨 毛 膜 羊 膜 炎 な ど 子 宮 内 炎 症 が CLD の 発 症 の 重 要 因 子 と さ れ 、 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 活 性 化 と CLD 発 症 の 関 与 が 報 告 さ れ た 。

酸 性 ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ナ ー ゼ （ ASM: acid sphingomyelinase） は ラ イ ソ ゾ ー ム 酵 素 で 、 細 胞 膜 の 主 要 リ ン 脂 質 で あ る ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ン を セ ラ ミ ド と フ ォ ス フ ォ コ リ ン に 分 解 す る 。 近 年 、 ASM の 活 性 化 が 炎 症 を 含 め た 細 胞 ス ト レ ス 応 答 へ 関 与 す る こ と が 確 立 さ れ 、 治 療 目 的 の ASM 抑 制 剤 も 数 多 く 報 告 さ れ て い る 。

今 回 我 々 は 、 CLD モ デ ル に お け る 肺 の 炎 症 と ASM 活 性 化 、 お よ び 、 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 関 連 を 調 べ た 。

研 究 方 法

妊 娠 ラ ッ ト に 対 し 、 妊 娠 20 日 お よ び 21 日 (満 期 は 22 日 )に LPS（ lipopolysaccharide）

3.5mg/kg を 腹 腔 内 投 与 し た 。仔 ラ ッ ト の 日 齢 1 の 肺 組 織 の ASM 活 性 を 測 定 し た 。生 理 食 塩 水 投 与 を コ ン ト ロ ー ル と し 測 定 値 を 検 討 し た 。

培 養 ラ ッ ト 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ (ATCC8383)に LPS を 1µg/ml の 濃 度 で 培 養 液 に 投 与 し 、細 胞 ASM 活 性 お よ び 培 養 液 中 IL-6 を 測 定 し た 。さ ら に LPS に 加 え ASM 抑 制 剤 を 添 加 し 、同 様 に 細 胞 ASM 活 性 お よ び 培 養 液 中 IL-6 を 測 定 し た 。 以 上 に 対 し Western blot 法 に て ASM 蛋 白 を 検 討 し た 。 ASM 抑 制 剤 と し て imipramine、 chlorpromazine、 maprotiline、 nortryptiline 、 promethazine 、 doxepin 、 protryptyline 、 desipramine を 使 用 し 、 imipramine は 30µM 、 chlorpromazine は 25µM、maprotiline、nortryptiline、promethazine、doxepin、protryptyline、

desipramine は 10µM で 投 与 し た 。

ASM 活 性 は

C-labeled sphingomyelin を 用 い て 測 定 し た 。 IL-6 は ELISA 法 を 用 い て 測 定 し た 。 統 計 学 的 検 討 は Excel 2012 を 用 い て 行 っ た 。

研 究 成 績

妊 娠 ラ ッ ト へ の LPS 腹 腔 内 投 与 で は 仔 ラ ッ ト の 肺 組 織 ASM 活 性 は 上 昇 し た 。し か し 、統 計 学 的 有 意 差 を 認 め な か っ た 。

培 養 ラ ッ ト 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ に LPS を 添 加 す る と 、投 与 後 2 時 間 で 有 意 な 培 養 液 中 IL-6 上 昇 を 認 め た 。 し か し 、 細 胞 ASM 活 性 上 昇 は 認 め な か っ た 。

培 養 ラ ッ ト 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ に 対 し LPS と ASM 抑 制 剤 の 投 与 を 行 う と 、 開 始 後 2 時 間 で 細 胞 ASM 活 性 は 全 薬 剤 で 有 意 に 抑 制 さ れ た 。培 養 液 中 IL-6 は 、imipramine、chlorpromazine、

maprotiline 、 doxepin 、 protryptyline で 有 意 に 抑 制 さ れ た 。 し か し 、 nortryptiline 、 promethazine、 desipramine で は 有 意 な 抑 制 を 認 め な か っ た 。

ASM 抑 制 剤 と し て imipramine を 用 い 、 LPS 投 与 後 2 時 間 、 4 時 間 お よ び 6 時 間 の 検 討 を 行 っ た 。そ の 結 果 、細 胞 ASM 活 性 は 6 時 間 後 ま で 抑 制 さ れ た 。培 養 液 中 IL-6 は 2 時 間 後 、4 時 間 後 で は 有 意 に 抑 制 さ れ た が 、 6 時 間 後 で は 抑 制 さ れ て い な か っ た 。

Western blot 法 に よ る ASM 蛋 白 の 解 析 で 、 全 薬 剤 で 蛋 白 量 を 含 め 変 化 を 認 め な か っ た 。

結 論

母 体 誘 発 炎 症 に よ る 仔 ラ ッ ト CLD 発 症 と ASM 活 性 化 、お よ び 、培 養 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る サ イ ト カ イ ン 分 泌 と ASM 活 性 化 、 以 上 2 点 の 有 意 の 関 係 は み ら れ な か っ た 。

Imipramine を 含 め た い く つ か の ASM 抑 制 剤 は 、培 養 ラ ッ ト 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ 活 性 化 に よ る IL-6 産 生 を 抑 制 し た が 、 反 応 初 期 に 対 す る 抑 制 効 果 で あ っ た 。

CLD の 病 因 に お け る ASM 活 性 化 の 関 与 に 関 し て 今 後 さ ら な る 研 究 が 必 要 で あ る 。

Akita University

学位（博士―甲）論文審査結果の要旨

主査 ： 橋本 学 申請者： 伊藤 智夫

論文題名：

（酸性スフィンゴミ エリナーゼはラット肺胞マクロファージからの

分泌に関与しない）

要旨

新生児慢性肺疾患（CLD）の患者では出生時の気管（支）内の気道分泌液中のマク ロファージの数の有意な増加が認められる。この細胞からの炎症性サイトカイン分泌が

発症の一つの要因であり

（ASM）がサイトカイン分泌に 関与するのではないかと考えられている。

著者は肺の炎症環境下では

がマクロファージのサイトカイン分泌に関与するこ とを証明するため動物・細胞レベルで検討をおこ なった。妊娠ラット腹腔内への

活性を測定したが、有意な 増加がなかった。次に、ASM が肺胞マクロファージからの

分泌に 関与するかどうか実験細胞モデルで検討した。培養ラット肺胞マクロファージに

を単独および各種

抑制剤を同時に投与し、細胞内

活性と培養液中の

を 測定し検討した。LPS 投与で

の発現や活性の増加はみられなかったが、IL-6 分 泌の増加がみられた。また、

抑制剤（imipramine）同時投与群で

活性と

分泌を有意に抑制することを明らかにした。

本論文の斬新さ、重要性、実験方法の正確性、表現の明瞭さは以下の通りである。

１）斬新さ

Akita University

小動物の仔の肺組織に炎症状態を作成する試みをはじめておこなった。LPS の腹腔 内投与では作成できなかったが、投与ルートについて今後の小動物を使った実験モデル の作成に貴重な情報と考える。また、はじめて培養肺胞マクロファージを使用し、各種 状況下での

蛋白の発現、ASM 活性化、IL-6 分泌の状態を検討した。

２）重要性

LPS

投与により肺胞マクロファージの

蛋白発現・ASM 活性化に変化はないが

分泌が増加し、ASM が細胞からの

分泌に関与しないとの結論であった。こ れは従来の報告とは異なるものであり、ASM 活性とマクロファージからのサイトカイ ン分泌の関連性の解明にさらなる検討が必要であることを明らかにした。しかし、

阻害剤は有意に

分泌を低下させることを証明したことは、

など炎症に起因す る肺疾患でも

阻害剤の有用性を示すものと考える。また、個々の細胞レベルの

活性化ではなくマクロファージの数の増加によるサイトカイン増加が、

発現 には重要な要因であることを示した可能性がある。このように、本研究の結果は今後の

の基礎的研究に一石を投じたことは重要と考える。

３）研究方法の正確性

ASM

蛋白の発現は

法で、ASM 活性は著者の属するグループで経験の ある

を用い測定した。IL-6 定量は

法で測定した。

いずれの検討もコントロール群を含めた統計学的検討を加えており、えられた結論は客 観的で正確性があると考えられる。

４）表現の明瞭さ

マクロファージのサイトカイン産生に

が関与するかどうかを実験的に明らかに するための方法、実験結果、考察を簡潔・明瞭に記載していると考える。

以上述べたように、本論文は学位を授与するに十分値する研究と判定された。

Akita University