東北医科薬科大学
審査学位論文（博士）要旨
氏名（本籍） ﾈﾓﾄ ﾜﾀﾙ
根 本 亙（秋田県）
学位の種類 博士（薬科学）
学位記番号 薬科 第 1 号
学位授与の日付 平成29年3月10日
学位授与の要件 学位規則第４条2項該当
学位論文題名 脊髄疼痛伝達機構における Angiotensin 系の役割の解明
論文審査委員
主査 特任教授 櫻 田 忍
副査 教授 東 秀 好
副査 教授 丹 野 孝 一
1
脊 髄 疼 痛 伝 達 機 構 に お け る
Angiotensin
系 の 役 割 の 解 明東 北 医 科 薬 科 大 学 大 学 院 薬 学 研 究 科 薬 理 学 教 室 根 本 亙
Renin angiotensin (RA) 系 は 血 圧 調 節 や 水・電 解 質 の ホ メ オ ス タ シ ス に 深 く 関 与 し て い る ．Renin は RA 系 に お け る 初 段 階 酵 素 で ， 主 に 腎 臓 の 傍 糸 球 体 細 胞 で 生 合 成 さ れ て 血 中 に 放 出 さ れ た 後 ，肝 臓 で 生 合 成 さ れ る ア ン ジ オ テ ン シ ノ ー ゲ ン (AGT) に 作 用 し て ，デ カ ペ プ チ ド で あ る angiotensin (Ang) Iを 遊 離 す る ．Ang I は 血 中 あ る い は 血 管 内 皮 細 胞 表 面 上 に 存 在 す る Ang 変 換 酵 素 (ACE) に よ り オ ク タ ペ プ チ ド の Ang II へ と 変 換 さ れ る ．そ の 後 ，Ang II は 血 管 平 滑 筋 ， 脳 ， 心 臓 等 の 広 範 囲 に 発 現 し て い る AT1 及 び AT2 受 容 体 に 作 用 す る こ と で 生 理 作 用 を 示 す (Fig. 1A)．非 常 に 興 味 深 い こ と に ，Ang II は そ の 代 謝 産 物 も 生 理 活 性 を 有 し て お り ，ACE2 に よ り C 末 端 側 の Phe が 切 断 さ れ Ang (1-7) へ と 代 謝 さ る ． 一 方 ，aminopeptidase A の 働 き に よ り ，N 末 端 の Asp が 切 断 さ れ る と Ang III を 生 成 す る (Fig. 1B)．Ang III は Ang II と 同 様 に AT1及 び AT2受 容 体 に 対 す る 完 全 ア ゴ ニ ス ト と し て 作 用 す る が ，Ang (1-7) は Mas 受 容 体 に 作 用 す る こ と に よ り ，AT1 受 容 体 を 介 し た 多 く の 作 用 に 対 し て 抑 制 的 に 働 く ．
Fig. 1. Cascade of the circulating renin angiotensin syst e m (A) and metabolis m of angiotensin II (B)
上 述 し た 循 環 血 液 中 で の Ang II 産 生 機 構 は 循 環 RA 系 と 呼 ば れ て い る ．一 方 で ，AGT，ACE 及 び Ang II 受 容 体 な ど の RA 系 構 成 因 子 は 種 々 の 臓 器・組 織 に お い て も 存 在 し て お り ， 循 環 RA 系 か ら 独 立 し た 組 織 RA 系 を 構 成 し て
2
い る ．こ れ ま で に ，心 臓 ，血 管 ，腎 臓 ，骨 髄 ，脂 肪 組 織 及 び 脳 に お い て 組 織 RA 系 の 存 在 が 確 認 さ れ て い る ．
組 織 RA 系 は 中 枢 神 経 系 に お い て も 重 要 な 役 割 を 担 っ て お り ，特 に 脳 内 RA 系 に 関 す る 研 究 が 活 発 に 行 わ れ て い る ． す な わ ち ， 脳 に お い て 産 生 さ れ た Ang II は 交 感 神 経 系 を 活 性 化 す る こ と に よ る 昇 圧 作 用 ，塩 分 ・水 分 摂 取 量 の 増 加 ，バ ソ プ レ シ ン 等 の 下 垂 体 ホ ル モ ン の 分 泌 促 進 に 関 与 し て い る ．脳 内 に お い て Ang II は 疼 痛 伝 達 に も 関 与 し て お り ， 尾 側 延 髄 腹 外 側 野 (CVLM) に お い て は 痛 覚 過 敏 を 誘 発 す る (Neuroscience 2009, 158:1301-1310)． そ れ と は 対 照 的 に ， 脳 室 内 (Pain 1986, 27:237-245) や 中 脳 水 道 周 囲 灰 白 質 (PAG) (Neuroscience 2005, 132:453-463) へ Ang II を 投 与 す る と 抗 侵 害 刺 激 作 用 を 示 す ． こ れ ら の 報 告 は ， 脳 領 域 の 違 い に よ り ， 疼 痛 伝 達 機 構 に お い て Ang II が 相 反 す る 作 用 を 示 す こ と を 示 唆 し て い る ． 一 方 ，Ang II は 疼 痛 伝 達 に お い て 重 要 な 部 位 の 一 つ で あ る 脊 髄 後 角 に 存 在 (Neurosci. Lett. 1976, 2:229-234) し ，後 根 神 経 節 に お い て は 痛 み の 伝 達 物 質 で あ る サ ブ ス タ ン ス P や カ ル シ ト ニ ン 遺 伝 子 関 連 ペ プ チ ド と 共 存 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る (Regul. Pept.
2010, 162:90-98)．し か し な が ら ，脊 髄 疼 痛 伝 達 機 構 に お け る Ang II の 役 割 に つ い て は 未 だ 解 明 さ れ て い な い ．そ こ で,本 研 究 で は 脊 髄 疼 痛 伝 達 機 構 に お け る Ang 系 の 役 割 を 解 明 す る こ と を 目 的 に ，以 下 の 内 容 に つ い て 検 討 を 行 っ た ．
第 1 章 で は マ ウ ス へ Ang II 及 び III を 脊 髄 ク モ 膜 下 腔 内 (i.t.) 投 与 し ， こ れ ら の ペ プ チ ド が 脊 髄 疼 痛 伝 達 機 構 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た ．そ の 結 果 ，i.t.投 与 さ れ た Ang II 及 び III は ， 下 腹 部 へ の 両 後 肢 に よ る scratching， 両 後 肢 や 尾 部 へ の biting 及 び licking か ら な る 疼 痛 関 連 行 動 を 誘 発 し た ．Ang II 及 び III 誘 発 性 疼 痛 関 連 行 動 は AT1 受 容 体 拮 抗 薬 losartan の i.t.投 与 に よ り 用 量 依 存 的 に 抑 制 さ れ た も の の ，AT2 受 容 体 拮 抗 薬 PD123319 は こ れ ら の 疼 痛 関 連 行 動 に 対 し て 効 果 を 示 さ な か っ た ． 従 っ て ，Ang II 及 び III は 脊 髄 内 の AT1 受 容 体 に 作 用 す る こ と に よ り ，疼 痛 関 連 行 動 を 誘 発 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．さ ら に ，脊 髄 内 (L5) に お け る AT1 受 容 体 の 発 現 を 顕 微 測 光 法 に よ り 解 析 し た と こ ろ ，AT1 受 容 体 は 脊 髄 疼 痛 伝 達 機 構 に お い て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 脊 髄 後 角 (ラ ミ ナ I 層 及 び II 層) に 高 発 現 し て い た ． ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 や 各 種 MAPK 関 連 阻 害 薬 を 用 い た 解 析 か ら ，Ang II 及 び III 誘 発 性
3
疼 痛 関 連 行 動 は 脊 髄 背 側 部 に お け る ERK1/2 や JNK で は な く p38 MAPKの リ ン 酸 化 に 起 因 し て 引 き 起 こ さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た ．さ ら に ，脊 髄 後 角 に お い て AT1 受 容 体 は 神 経 細 胞 や ア ス ト ロ サ イ ト に 発 現 し て お り ，ミ ク ロ グ リ ア に は 存 在 し て い な か っ た ． 加 え て ，Ang II 及 び III に よ る p38 MAPK の リ ン 酸 化 は ，AT1 受 容 体 が 発 現 し て い る 神 経 細 胞 及 び ア ス ト ロ サ イ ト に お い て 引 き 起 こ さ れ ，AT1 受 容 体 が 発 現 し て い な い ミ ク ロ グ リ ア で は 引 き 起 こ さ れ な か っ た ． 従 っ て ，Ang II 及 び III は 脊 髄 後 角 の 神 経 細 胞 及 び ア ス ト ロ サ イ ト に 発 現 し て い る AT1 受 容 体 に 作 用 す る こ と に よ り ，こ れ ら の 細 胞 に お け る p38 MAPK の 活 性 化 を 引 き 起 こ し ，そ の 結 果 と し て 疼 痛 関 連 行 動 を 誘 発 す る こ と が 明 ら か と な っ た (Fig. 2)．
Fig. 2. Sche matic illustration of the mechanis m of angiotensin II- or III-induced pain-related behavior in mice
Ang II 及 び III は そ れ ぞ れ AT1 受 容 体 に 対 す る 完 全 ア ゴ ニ ス ト と し て 機 能 す る も の の ，AT1 受 容 体 に 対 す る 親 和 性 は Ang II の 方 が 約 2.5 倍 高 い こ と が 知 ら れ て い る ． し か し な が ら ，Ang III (0.1 pmol) は Ang II (3 pmol) と 同 等 の 疼 痛 関 連 行 動 を 誘 発 し た ． こ れ に 関 し て ， 本 研 究 室 で は こ れ ま で に 0.1 及 び 0.3 pmol と い う 極 め て 低 用 量 の Ang (1-7) が Mas 受 容 体 を 介 し て Ang II 誘 発 性 疼 痛 関 連 行 動 を 抑 制 す る こ と を 報 告 し て い る (Eur. J. Pain 2014, 18:1471-79)．従 っ て ，i.t.投 与 さ れ た Ang II は ，そ れ 自 身 か ら 生 成 さ れ た Ang (1-7) に よ り 疼 痛 関 連 行 動 が 抑 制 さ れ る 可 能 性 が 推 察 さ れ る ． 一 方 ，Ang III は Ang II の N 末 端 側 に 存 在 す る Asp が 欠 落 し て い る た め ，Ang (1-7) に は 代 謝 さ れ な い ．Ang III が AT1 受 容 体 へ の 親 和 性 の 低 さ に も 関 わ ら ず ，Ang II よ り も 低 用 量 で 疼 痛 関 連 行 動 を 誘 発 し た 要 因 は ，Ang III か ら は Ang (1-7) が 生 成 さ れ な い た め と 考 え ら れ る ．
4
第 2 章 で は ，内 因 性 Ang II の 脊 髄 疼 痛 伝 達 機 構 に お け る 役 割 を 明 ら か に す る 目 的 で ，ホ ル マ リ ン 試 験 を 用 い て i.t.投 与 さ れ た losartan が 抗 侵 害 刺 激 作 用 を 示 す か 否 か を 検 討 し た ．そ の 結 果 ，ホ ル マ リ ン に よ り 誘 発 さ れ る 第 1 相 及 び 第 2 相 の 侵 害 刺 激 行 動 は ，losartan (30-100 nmol) に よ り 有 意 に 抑 制 さ れ た ． ま た ，ホ ル マ リ ン 投 与 3 分 後 の 脊 髄 後 角 で は Ang II 及 び リ ン 酸 化 p38 MAPK の 発 現 量 が 生 理 食 塩 液 投 与 群 の そ れ ら と 比 較 し て 約 1.5 倍 程 度 上 昇 し て い た ． 加 え て ，losartan の i.t.前 投 与 が ホ ル マ リ ン に よ る p38 MAPK の リ ン 酸 化 を 有 意 に 抑 制 し た こ と か ら ，ホ ル マ リ ン 試 験 に お い て losartan は Ang II の AT1 受 容 体 を 介 し たp38 MAPKの 活 性 化 を 抑 制 す る こ と に よ り 抗 侵 害 刺 激 作 用 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た (Fig. 3)． さ ら に ，Ang II は 脊 髄 に お け る 痛 み の 伝 達 物 質 あ る い は 調 節 因 子 と し て 機 能 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．
Fig. 3. Sche matic illustration of antinociceptive effect produced by losartan in the mouse for malin test
主 論 文 (原 著 論 文)
1. Nemoto W, Nakagawasai O, Yaoita F, Kanno SI, Yomogida S, Ishikawa M, Tadano T, Tan-No K. Angiotensin II produces nociceptive behavior through spinal AT1 receptor-mediated p38 mitogen -activated protein kinase activation in mice.
Mol. Pain, 9:38 (2013).
2. Nemoto W, Ogata Y, Nakagawasai O, Yaoita F, Tadano T, Tan -No K. Involvement of p38 MAPK activation mediated through AT1 receptors on spinal astrocytes and neurons in angiotensin II- and III-induced nociceptive behavior in mice.
Neuropharmacology, 99:221-231 (2015).
3. Nemoto W, Ogata Y, Nakagawasai O, Yaoita F, Tanado T, Tan -No K. The intrathecal administration of losartan, an AT1 receptor antagonist, produces an antinociceptive effect through the inhibiton of p38 MAPK phosphorylation in the mouse formalin test.
Neurosci. Lett., 585:17-22 (2015).
