5 8 0 金 沢大 学 十 全 医 学 会雑 誌 第9 7巻 第3号 5 8 0 −5 9 3 く1 9 88I
糖尿 病 患 者 に おける血清フ ル ク トサ ミ ン 濃度 の測 定
− その基 礎 的検討と臨 床 的 意義 一
食 沢 大学 医 学 部 内 科学 第一 講座 く主任こ服 部 信 教 掛
真 田 陽
く昭和6 3年5 月1 0日受 付j
生 体 内において， 血 清 中の蛋 白と プ ト ウ糖は非 酵 素 的なald imin e結 合によ り結 合し， A m ado ri転 位を経て安 定な keto a min e くフ ルク ト サミ ン1 と な る． こ の フ ルク ト サミ ンは アルカ リ性で還 元 性を 示 す こと が知ら れ ている． 本 研 究で は血 清フ ルク ト サミ ン濃 度の測 定に つい て 基礎 的 検 討を行い， 更にそ の臨 床 的 意 義に つ いて も検 討を加え た． 測 定 法は アル カ リ溶 液 中で フ ル ク ト サ ミ ンが nitr ob lu e
tetr a z 。Iiu m くN B Tl を還 元 発 色さ せ ること を利用 し た も の で あ り， 吸 光 度によ り 血清フ ルク ト サミ ン
濃 度を測 定し た． 本 測 定 法の標 準 物 質と し て， 合 成 Am ado ri 化 合 物で あ る 1−de o xy−1−m O rpholin o−D−
fr u cto s e てD M Fl を用いた． 基礎 的検 討の結 果， 測 定 条 件は反応 温度370C， 反 応 時 間1 5分， 反応pH は
1 0．8， 比 色 波 長は5 3 0n m が 至適と考え ら れ た． 測 定 精度に つ いて は測 定 内 誤 差 くC VI は2． 卜 4．1％−測 定 間誤 差 くC Vう は3．卜 5 ．5％であっ た一 健 常 者 くn ニ44う の平均血清フ ルク ト サミ ン濃 度は 2−4 士0■4
くMe a n士 2 S Dl m M ， 糖 尿 病 患 者 くn ニ7 71 では 3．1 士 1 ．3 mM と糖 尿 病 患 者で有 意に高 値を 示 し た
くp く0．0 0 11． 血 清フ ルク ト サミ ン濃 度は糖 化アルブミ ン い ニ0．7 0 8， p く0−0 0 11 お よ び H b AIC い ニ 0．7 5 1， p く0．0 0 1っと有 意な相 関 関 係を 示 し， 更に2 句 4 週 前の空 腹 時血糖 値と強く相 関し た い ニ 0．4 7 4 へ0．7 3 7， p く0．0 1へ 0．0 0 1う． これ らの結 果よ り， 血清フ ルク ト サ ミン濃 度は 比較 的 短 期 間 く2 へ 4週
間 師 の血 糖コ ントロ ー ル の指 標と考え ら れ た． 次に集 団検 診 時の尿 糖 陽 性 者42名を7 5g O G T T の血糖 曲 線の判 定 区 分によ り糖 尿 病 軋 境 界型， 正常 型の3 群に分け， 血 清フ ルク ト サミ ン濃 度， H b AICおよ び空 腹 時 血 糖を測 定し た． 血 清フ ルク ト サミ ン濃 度は糖 尿 病 軋 境 界 型お よ び 正常型 で そ れ ぞ れ 3．5 2士 0．2 8 くm e a n士S．E． M l． ， 2．5 6士0．0 5 お よ び 2−3 1士0．0 6m M であ り， 各 群 間で明らかな差を認め た
くp く0．0 5pvO．0 0 1l．
一 方， 空 腹 時 血糖 及び H b A IC は境 界 型と 正常 型との間には有意 差を認め なかった．
血清フ ルク ト サ ミン濃 度の測 定は簡便であ り， 比較 的短 期 間の血糖コ ントロ ー ル の指標や耐 糖 能 異 常の
スク リ ー ニ ングに有用 である可 能 性が 示唆さ れ た．
K ey w ords fr u cto s a min e， glyc ated albu min， H b A IC，d iabetic c o ntr ol
糖 尿病 治 療の重 要な目 的の1 つは， 糖 尿 病 性 細小 血 管 症の発 症■進 展を防止 す ることにあ り， そのた めには糖 尿 病 患 者を長 期にわ た り良 好な 血糖コ ント
ロ ー ル状 態に おく必 要が あ る． 血糖コ ントロ ー ル状 態を把 握す る手 段と して， 従 来の血糖 値や尿 糖 量に 加え て， 現 在で はglyc ated he moglob in 旧b AICl が 広く 用い ら れて いる．
A b br e viatio n s ニ C V ，
He m oglob in は ブ ド ウ糖と非 酵 素 的にSchiff 結合 し， 不安 定な pr e−H b A IC くald imin el を形 成し た後I
Am ado ri転 位によ り安 定し た H b A IC くketo ami n el と な る1，2 ，が， 赤血球の平 均 寿命が約12 0 日であ るこ と か ら， 過 去1 へ 3 ケ月の比較的長 期の血糖コ ント
ロ ー ル状 態を反 映して いる と考え ら れて いる 錮． し か し， 急 激に血 糖コ ントロ ー ルが 悪化し た糖 尿 病 患
c o efficie nt of v a riatio n 三 D M F， de o xy−m Orph olin o−D −fr u cto s ei F P G， fa sting pla s m a glu c o s ei H b A IC， he m oglob in A ICi 5 月 M F， 5−hydro x y m ethyl fu rfu r alニ H P L C ， h igh pe rfo rm a n c e liquid chr o m atogr aphy ニ H S A ， hu m a n s e r u m
糖 尿 病 患 者の血清フル クトサ ミ ン濃 度
者や発症 後 間も ないイ ン スリン依 存型糖 尿 病患者で は， 高血糖 状 態にあ る もか かわ ら ず， H b AIC 傾が 正 常なこと が あ る− ま た， 不安 定型糖 尿 病 患 者や厳 格
にコ ントロ ール を 必 要 と す る糖 尿 病妊婦に お い て治 療効果を早期に判 定す る際， H b AIC のみでは 不十 分 と思わ れ ること も し ば し ば経 験さ れ ， よ り短い期 間
の血糖コ ントロ ー ル状 態を 示 す指 標の必要 性が指 摘 さ れてき た5 I． こ のた め，
be moglob 血 よ り さ らに半 減期の短い血清蛋白や 血清アル ブミ ン の glyc atio nを 測定す る方 法が報 告さ れ た6 川 が， その測定法の多く は手技の繁 雑なこと か ら臨 床的に広く普及 す るには 至って いない．
血清蛋 白にグルコ ー スが非 酵 素 的に結 合して生じ た keto a min e は， その糖 鎖がフ ル クトー ス構 造を と る た めフ ル クトサ ミ ンと よ ば れ ている が， 最 近フ ル ク ト サミ ンが アルカ リ溶 液 中で テ トラゾ リウ ム塩 を 還元発色さ せ ること を利用 し た簡 便な 血清 糖 化蛋白 測定法 く血 清フ ル クト サミ ン濃 度 測 定うが報 告さ れ た81． 本 論 文で は， こ の血清フ ル クト サミ ン濃 度 測 定 法について 基礎 的 検 討を行う と と もに， 糖 尿 病 患 者
の ス クリー ニ ング や 血糖コ ントロ ー ル にお け る 血清
フ ルク ト サミ ン濃 度 測 定の臨 床 的 意 義に つ いて も検 討を加え た．
材 料およ び方法
工． 血清フ ルク ト サミ ン濃度測 定系の基礎的検 討
1 ． 試薬
フ ルク ト サミ ン定量の標 準物 質と し て 用いる合 成 Am ado ri 転移 生 成 物1−de o xy−1−m O rpholin o−D−fr u c．
to s eくD M Fl ， 発 色 試 薬の nitr ob lu e tetr a z oliu m
くN B Tこgr ade IIIl ， D M F 溶 解に用いると卜 血清ア ルブミ ン くB S Al こ Cohn fr a ctio n V， 結 晶 化 凍結 乾燥ヒト アルブミ ン く結 晶 化 H S Aう は い ずれ も Sigm a社製くSt．Lo uis，M O ， U S Al のものを も ちい
た．その他の試 薬く特 級ンは 和光 純 薬工業よ り 入手し た．
2 ． N B T 発色の至適pH と 比色 時の至適吸収 波長
keto a min e によ る N B T 還 元 発色に及 ぼ すpH の影
響を検 討す る た め． 0．25m M N B T を そ れ ぞ れ含む 0．1 M リン酸 緩 衝 液 くpH7， pH 8 およ び pH 12l ，
0−1 M パ ル ビタ ー ル緩 衝 液 くpH 9 1 およ び0．1M 炭 酸緩 衝液 くpH l O お よ び1い を作 成し た． これ らの溶 液
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2mlに， 0 4m M D M F 含 有生 理食 塩 水， 魯4 ％結 晶 化11 S A 生理食 塩 水あ るいはく卦4m M D M F 含 有4％ 結 晶 化H S A 生理食 塩 水を 2 0 0FLlずつ加え て3 70Cで1 5 分間反応させ． 53 0n m に お け る吸光 度を測定し た．
比色 定量に用 いる 至適 吸収 波長を決 定す る た め，
上記 O e 傍の溶 液 各2 0 0JLl に 0．2 5m M N B T 含 有 0．1 M 炭酸 緩 衝 液 くpH l O．81 を 2ml加え，3 70Cで1 5分 間反応さ せ， そ れ ぞ れの吸収ス ペク ト ラム を記 録し た，
3 ． D M F 溶 液に用いる アルブミ ン製 剤の影 響 D M F溶 液に用いる H S A 製 剤のN B T発 色に及ぼ す 影 響を見る た め，O 4 ％H S A くfr a ctio n Vl 含有 生理 食 塩 水， 砂4 ％ 結 晶 化H S A 含 有生 理食塩 水，61 4m M D M F を溶 解し た4 ％H S A くfr a ctio n Vl 含 有 生理食 塩 水お よ びゆ4m M D M F を溶 解し た 4 ％ 結 晶 化
H S A 含 有生理食 塩 水の各2 0 0JLlに0．2 5m M N B T 含 有0．1 M 緩 衝 液くpH 7 か ら 1 21 を 2ml加え て3 70C で 1 5 分間 反 応さ せ5 30n m に お け る 吸光 度を測 定し た． ま た， これ らO elQlゆの溶 液を 0．2 5m M N B T 含 有 0．1 M 炭 酸緩 衝 液 くpH l O．81 2ml中で反応さ せ， 吸光 度を経 時 的に測 定し た．
4 ． ブ ド ウ糖 濃 度の影響
N B T 発 色に及 ぼ す ブ ド ウ糖の影 響を見る た め，
1 0 0 0m gJdlのブ ド ウ糖を含む4 ％ 結晶 化H S A 生理食 塩水20 0pl に0．2 5m M N B T 含 有0．1 M 緩 衝 液 くp− H7一−1 2う を 2ml加え て 3 70C で 15分 間反応さ せ，
53 0n m に お け る吸 光度を測 定し た． 更に， 1 0 0 0m gl d lか ら 62．5m gノdl の ブ ド ウ糖を含む 4 ％ 結 晶 化
H S A 生理食 塩 水2 0 0JLl に0．2 5m M N B T 含 有0．1 M 炭酸 緩 衝 液 くpH l O潮 を 2ml加え て同 様に反 応さ せ 吸光 度を測 定し た．
5 ． 血清フ ル クト サミ ン濃 度の測定
被検血清は空 腹 時 採血後 分離し−400C で保 存し た．
標 準 曲線 作 成のた め，Om M
，0．5m M ，lm M ，2m M お
よ び 4m M 濃 度の D M F を含む 4 ％ 結 晶化H S A 生 理 食塩水を作り， D M F 標 準 液と し た． こ の D M F 標 準 液あ るい は被 検 血 清20 0JJl に0．25m M N B T 含 有 0．1M 炭酸 緩 衝 液 くpH lO．81 2ml を加えて37OC で反 応 させ ， 10分およ び15分後に5 3 0n m に おけ る 吸光 度 仏．0およ び A．51 を測 定し た． 標 準 曲線は D M F 標 準 液の 10分およ び15分に おけ る 吸光 度の差 くA A ニ A
15W A．0う を D M F濃 度に対してプロ ッ ト す ることによ
albu minニI G T ，im paired glu c o s e tolera n c e三 M M T ， dim ethylthia z oトdiphe nyltetr azoliu m
bro midei N B T
， nitr oblu e tetr a z oliu m ニ O G T T ， O r al glu c o s e tole r a n c e te st i T B A，
thiob arbituric a cid．
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り作成し た． 被検血清の血 清フ ル ク ト サミ ン濃 度は D M F標 準 液と同様に し て得ら れ たA A を標 準 曲 線に
当て は め ることによ り求め， D M F 当 量と し て表 現し た．
1う 測 定 内お よ び測 定 間 誤 差
血 清フ ルク ト サ ミン濃 度が異な る 2 つ のプ ー ル血 清を 1 魔の測 定で 5 回ずつ測 定 くintr a a s s ayl し， 測 定 内 誤 差を求め た． ま た， 演 度の異な る別の2 つ の
プー ル血 清を 5 回の異な る機 会に測 定くinte r a s s ayl し， 測 定 間 誤 差を検討し た．
21 希 釈お よ び 回収 試験
血 清フ ルク ト サミ ン濃 度が高 値を 示 し た 血清を生 理食 塩 水で倍々希 釈し て， 標 準 曲 線と の平 行 性を検 討し た． ま た血 清フ ルク ト サ ミン濃 度が 明 ら か な 3 つ の異な る プ ー ル血 清に， そ れ ぞ れ 0．5， 1 およ び 2m M 濃 度の D M F 標 準液を添 加す ることによ り 回収 試 験を行った．
H ． 臨 床 的 検 討
1 ． 糖 尿 病 患 者およ び健 常 者に おけ る 血清フ ルク ト サミ ン濃 度
い 対 象
当 院第1 内科へ入院 中あ るいは外 来通院 中の糖 尿 病 患 者7 7名 く男35名， 女4 2名， 平 均 年 齢5 8．4歳っと健 常 者4 4名 く男2 0名， 女24名， 平 均 年 齢49．2歳うを対 象
と し た． 2う 方 法
健 常 者お よ び糖 尿病 患者の空 腹 時 血 清を 用 いて前 述の方 法に従い血清フ ルク ト サ ミン濃 度を測 定し た． さ らに， 血清フ ルク ト サ ミン濃 度 測 定 時よ り 0 週，
2週， 4 遇お よ び 6 週 前の空 腹 時 血 糖 値との 関 係を 検 討し た． ま た， 3 6検 体に つき 血清フ ルク ト サミ ン
カ
T
u O C の
て 凸
．
0 ノ
ノ ノ
．
10 1 1 1
もH
Fig．1． E ffe ct of pH o n r edu cing a ctivit y of D M F a nd hu m a n s e r u m albu min くH S AJ．
口，4m M D M Fニ ー，4％H S AニA ，4m M D M F ＋ 4％H S A．
濃 度と同 時に測 定し た glyc ated albu min との相関 を， 100検 体につ いて血清フ ル クト サミ ン濃 度と同時
に測 定し た H b A IC との相 関を検 討し た．
2 ． 糖 尿 病ス クリ ー ニ ングに お け る血 清フ ル クト サミ ン濃 度 測 定の有用性
1つ 対 象
8 3 7名の検 診受診 者に於いて， 3 回の受 診のう ち2 回 以 上尿 糖を指 摘さ れ た 4 2例 く平 均年齢44．0士8．8 歳1 を対 象と し た．
2う 方 法
対 象 者 全 例に7 5g 経口 ブ ド ウ糖 負 荷 試 験 く7 5g − O G T T う を施 行し， 日本 糖 尿 病 学 会の血糖 曲 線の判 定 区 分割に基づい て 正常 軋 境界 乳 糖 尿病型 の 3 群
に分け， 各 群の空 腹 時血糖t F P G l， H b AIC およ び血 清フ ルク ト サミ ン濃 度を検 討し た■
血糖はglu c o s e o xida s e 法， H b AIC は H P L C 法 く京都 第一 科 学， Auto AIC
■r hrり， glyc ated albu min
は T B A 圧h ioba rb itu ric a cid l 法1 0，によ り測 定し た．
III． 推 計 学的検定
結 果はこと わ りのない限り平 均 値士標 準誤 差 で 示 し， 推 計 学 的 検 討は 回帰 分 析 Stude nt，s t−te St およ び分 散 分 析を 用い， 危 険 率5％以 下 を推 計 学 的に有 意と判 定し た．
成 績
1 ． 基 礎 的検 討
1 ． N B T 発 色の至適pH と 比色 時の至適吸収波長
む ロ こ 可 q
L O S q
V 0
8
6 1．
0
0
0．4
W a v elen9 t h くn ml
F ig．2■ E ffe ct of albu min o n abs o rp tio n spe ct− r um of r edu c ed N B T ．
A，4m M D M FこB，4m M D M F＋ 4％H S AiC−
4％H S A ．
