マウス骨髄細胞の

序 文

固形癌，血液疾患などに対する抗癌化学療法や 臓器・骨髄移植などの集学的医療は副作用によ り，患者の骨髄機能を抑制して易感染状態を招く 結果，日和見感染症対策が重要な課題となる．な かでも侵襲性

症をはじめとする重篤な深 在性真菌症に関しては，既存抗真菌薬の予防的ま たは治療的投与が奏功しない例が少なくない．こ の不完全な抗真菌化学療法の改善策として，低下

した易感染患者の感染防御能を高めるためのサイ トカインなどによる免疫療法の併用が期待されて いる．しかし，サイトカイン自体を使用すること，

安全性および医療経済性の点で問題があることか ら，より有用性の高い新たな免疫療法薬の早急な 開発が要望されている．それにもかかわらず，深 在性真菌症，その他の日和見感染症に適用可能な 免疫療法薬の研究開発が必ずしも進展しておら ず，その一因は簡便性と感度がすぐれた有効性評 価システムが確立されていないことにあると考え られる．

われわれは多くの深在性真菌症に対する生体防

マウス骨髄細胞の Candida albicans 発育阻止能に及ぼす サイトカインの増強作用の評価法の検討

帝京大学医学部微生物学^1），同 第二外科^2），帝京大学医真菌研究センター^3）

諸藤慎一郎

安部 茂

丹生 茂

斧 康雄

山口 英世

冲永 功太

（平成 12 年 10 月 19 日受付）

（平成 13 年 1 月 9 日受理）

日和見感染の予防および治療法としての抗菌化学療法の効果が不充分な場合，特定のサイトカイン，

特に G-CSF をはじめとするコロニー刺激因子自身または，その産生誘導活性をもつ化合物は，Candida

albicans（以下C. albicansと略）その他の日和見菌による感染に対する予防および治療に有用と考えられ

る．そうした免疫増強活性をもつ化合物の簡便，迅速でしかも高感度の評価系ならびに探索系を開発す ることを目的として，マウス骨髄細胞（BMC）のC. albicans発育阻止能を増強する活性を指標とするin

vitro測定法を検討した．各種条件下で比較検討した結果，G-CSF とともに 24 時間前培養したシクロフォ

スファミド処置マウス由来の BMC を E T 比 160 で用いた場合に最も高感度に応答し，0.005ng ml の低

濃度でC. albicans発育阻止能の増強がみられた．同様の効果は GM-CSF でも，0.05ng ml 以上の濃度でみ

られた．従って，本法はC. albicans発育阻止能の増強という点で G-CSF や GM-CSF の免疫増強の評価な らびに探索に有用と考えられる．

〔感染症誌 75：326〜332，2001〕

要 旨

別刷請求先：（〒173―8605）東京都板橋区加賀 2―11―1 帝京大学医学部微生物学教室

諸藤慎一郎

Key words： Candida albicans, bone marrow cells , G-CSF , GM-CSF , anti-Candida activity

御機構として重要な役割を担う好中球，マクロ ファージなどの食細胞の真菌発育阻止能を増強す る作用を高感度に測定する簡便な

アッセ イ系をすでに考案しており，これを免疫療法薬検 索に応用することを検討してきた

．このアッセ イ系では成熟した白血球の真菌発育阻止能を指標 としているが，未熟な幹細胞から成熟した食細胞 に分化・増殖する全過程を含めた食細胞機能増強 作用を指標とするほうがより適切と考えられる．

事実，幹細胞を含む骨髄細胞（以下 BMC と略）は

（以下

と略）発育を阻止 する免疫増強作用を測定するエフェクター細胞と して使用できることが報告されている

．近年， さ らにシクロフォスファミド（以下 CY と略）などに よる免疫抑制処置を受けた動物の骨髄細胞中に出 現する未熟な幹細胞が分化・増殖誘導作用を含む over-all の食細胞機能増強作用測定に適している ことが示唆されている

．これらの知見に基づい て正常マウス及び CY を腹腔内に投与したマウス から採取した BMC（それぞれ N-BMC および CY- BMC と略）からの食細胞の分化・誘導活性と合 わせて，その

発育阻止能を増強する活 性を測定する方法を考案し，試験物質として各種 サイトカインをもちいて， その有用性を検討した．

材料と方法

（1）培地・試薬・使用菌株

RPMI1640（日 水 製 薬 社 製）に 20mM HEPES を添加し，カナマイシンおよびペニシリンを加え た．それにウシ胎児血清 （fetal calf serum，Biocell Laboratories ， Inc . California USA 製 ； FCS と 略） を 2.5％ の濃度に添加し， これを培地とした．

試薬としては以下のものを用いた．

Escherichia coli

lipopolysaccharide（DIFCO Lab.

Michigan USA 製；LPS と 略） ，recombinant hu- man granulocyte colony-stimulating factor（キ リ ンビール研究所より分与，G-CSF と略） ，recom- binant mouse granulocyte-macrophage colony- stimulating factor（GM-CSF Genzyme Corpora- tion，Massachusetts. USA 製；GM-CSF と 略） ， recombinant mouse macrophage colony-stimula- ting factor（Santa Cruz Biotechnology. Inc，Calif-

ornia. USA 製；M-CSF と略） ．

使用菌株としては臨床分離株である

TIMM1768

を用いた．

（2）骨髄細胞（BMC）の調製

ICR 雌性マウス（5 週齢）の大腿骨を採取し，両 端を切り落とした後に大腿骨一本当たり PBS 2ml で骨髄内を洗い流して BMC を集めた．一方，既 報

に準じて，マウスに CY （塩野義製薬社，大阪 製） を 200mg kg 腹腔内投与し，3 日後に大腿骨か ら BMC を採取した．トリパンブルー染色法を用 いて生細胞数を測定し，2.5％FCS 添加 RPMI1640 培地で所定濃度に調整した後，実験に用いた．

（3）培養および測定法

96 穴マイクロプレートに BMC 100µl と試験物 質 50

l を含む培地で 37℃，主に 24 時間前培養し た．その後，

TIMM1768 株を 500 細 胞 50

l と な る よ う に 添 加 し た．こ の 時 の エ フェクター細胞（E）および標的細胞（T）として，

それぞれ用いた BMC と

の比（E T 比）は 0，80 および 160 とし，各マイクロプレートを 37

℃，16 時間保温した．本条件下では，

細胞 の大半は菌糸形で発育し

，発育量の測定を既 報

に基いて行った．すなわち，0.125％SDS にて BMC を 除 去 し て 0.05％ の Crystal violet で 染 色 し，洗浄後，酸性イソプロパノールで Crystal vio- let を抽出し，抽出液の OD 値（OD

nm）を測 定した．試験物質存在下での

発育率は，

Candida

を単独で培養した時の発育量を 100％ と

して OD 値より算出した．結果は各条件で，4〜6 コ以上の測定値の平均値及び，その標準偏差を示 した．また独立の実験を 2 回以上実施し，その結 果の再現性を確認した．

結 果

（1）正常マウス由来 BMC の

発育阻 止能に及ぼす前培養時間の影響

G-CSF の存在下で培養した BMC が分化・増殖

することはよく知られているが

，本研究では

BMC の

発育阻止能に G-CSF がいかな

る影響を与えるかを前培養時間を変えて検討し

た．正常 BMC を G-CSF を含む培地中で 0，3 ま

た は 24 時 間 前 培 養 し た 正 常 BMC に

;

;

;;;

;

;

;

;

;

;

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;

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140

120

100

80

60

40

20

0

140

120

100

80

60

40

20

0

Relative growth of C. albicans（%） Relative growth of C. albicans（%）

80 160

Effector to target ratio

80 160

Effector to target ratio LPS      1 µg/ml Untreated control

G-CSF  0.5ng/ml G-CSF  5ng/ml

;

;

LPS      1 µg/ml Untreated control G-CSF  0.5ng/ml G-CSF  5ng/ml

;

;

;;

;

;

;

;

100

80

60

40

20

0

Relative growth of C. albicans（%）

80 160

Effector to target ratio LPS      1 µg/ml Untreated control G-CSF  0.5ng/ml G-CSF  5ng/ml

;

;

細胞を添加，16 時間混合培養した後，BMC の

albicans

発育阻止能を測定した．陽性対照として

は同時に白血球の

発育阻止能増強作用 をもつことが知られている

LPS を用いた．

前培養なしの条件下での結果を Fig. 1 に示す．

無処置対照にくらべて LPS は

発育阻 止能増強効果を示したが，0.5 または 5ng ml の G- CSF で は 有 意 な 影 響 は み ら れ な か っ た．正 常 BMC を試験物質とともに 3 時間前培養した場合 の結果も同様であった．しかし Fig. 2 に示すよう に，24 時間前培養した場合は，0.5 または 5ng ml の G-CSF は，BMC の

発育阻止能を明 かに増強した．特に E T 160 比での相対

発育率は無処置対照培養細胞では 55％ に対 し，G-CSF 0.5ng ml 添加培養細胞では 10％ に低 下した．

以上の結果より，G-CSF の効果を検出するに は，24 時間の前培養の条件が好適であることがわ かった．

（2）CY 投与マウス由来 BMC（CY-BMC）の

albicans

発育阻止能に対する G-CSF の効果

正常マウス BMC と CY 投与マウス BMC の両 者を用い，様々な濃度の G-CSF に対する応答性を 比較するために，各々の BMC について，各種濃度

derived bone marrow cells not preincubated

（Right）Effects of G-CSF onC. albicansgrowth inhibition by normal mouse-derived bone marrow cells preincubated 3 hours

Fig. 2 Effects of G-CSF onC. albicansgrowth inhibi- tion by normal mouse-derived bone marrow cells preincubated 24 hours

100

80

60

40

20

0

Relative growth of C. albicans（%）

;

;

;

;

;

;;;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

100

80

60

40

20

0

Relative growth of C. albicans（%）

80 160

Effector to target ratio

80 160

Effector to target ratio G-CSF    0ng/ml G-CSF  0.05ng/ml

G-CSF  0.5ng/ml G-CSF  5ng/ml

;

;

G-CSF  10ng/ml G-CSF  20ng/ml

;

G-CSF  0ng/ml G-CSF  0.0005ng/mll G-CSF  0.005ng/ml G-CSF  0.05ng/ml G-CSF  0.5ng/ml

;

;

の G-CSF 存在下で，24 時間前培養を行い，C. al-

bicans

発育率を測定した．Fig. 3 （左）に示すよう

に，E T 比 160 で正常マウス BMC の対照培養は 50％ の

発育率を示すのに対し，その半 分 1 2 以 下 に

発 育 を 抑 制 す る G-CSF の濃度，すなわち

発育率を 25％ 以下に 低下させるのに G-CSF の濃度は 0.5ng ml 以上で あることが示された．一方，G-CSF 0.05ng ml 以下 の濃度では明確な効果はみられなかった．

Fig. 3 （右）に CY-BMC に対する G-CSF の効果 を示す．CY-BMC では 0.005ng ml 以上の G-CSF の存在により，E T 比 160 の場合のみならず，E T 比 80 の場合においても，その

発育 阻止能の増強がみられた．これらの結果，G-CSF は正常マウス BMC の場合（0.5ng ml）より 100 分の 1 の濃度（0.005ng ml）で CY-BMC の

bicans

発育阻止能を明確に増強したことを示す．

（3）CY-BMC での GM-CSF の効果

G-CSF は CY 投与マウ ス BMC と 24 時 間 前 培 養することで鋭敏に

発育阻止能を増強

した．そこで，他のサイトカインの

発育 阻止能を検討した．GM-CSF は E T 160 の場合に は GM-CSF でも 0.05ng ml 以上の濃度で約 60％

の

発育率がみられた（Fig. 4 （左） ） ．

（4）CY 投与マウス BMC での M-CSF の効果 M-CSF でも同様の検討を行った．3.8×10

ng ml 以上の濃度で約 40％ の

発育率がみ られたが，38ng ml 以下では明確な効果はみられ なかった（Fig. 4 （右） ） ．

考 察

本研究により，BMC は G-CSF 存在下で 24 時間 前培養することにより強い

発育阻止能 を示すこと，特に CY-BMC では 0.005ng ml とい う低濃度の G-CSF で

発育阻止能の増 強を示すことがわかった．BMC の

発 育阻止活性については，Nozawa ら

の報告を除 き，ほとんど報告されていないが，好中球につい ては報告されており，それらが G-CSF の存在によ り，増強される場合も知られている．Yamamoto ら

は，ヒト末梢血好中球の

発育阻止能

derived bone marrow cells preincubated 24 hours

（Right）Effects of G-CSF onC. albicansgrowth inhibition by CY-treated mouse- derived bone marrow cells preincubated 24 hours

Relative growth of C. albicans（%）

;

;

;;;

;

;

;

;

;

;

200

150

100

50

0

200

150

100

50

0

;

;

Relative growth of C. albicans（%）

80 160

Effector to target ratio

80 160

Effector to target ratio GM-CSF    0ng/ml GM-CSF  0.005ng/ml

GM-CSF  0.05ng/ml GM-CSF  0.5ng/ml

;

;

GM-CSF  5ng/ml

M-CSF  0ng/ml M-CSF  3.8ng/mll M-CSF  38ng/ml M-CSF  380ng/ml M-CSF  3800ng/ml

;

;

が 1ng ml 以上の G-CSF の存在下で増強される こと， Roilides ら

は， 5ng ml 以上の G-CSF が，

ヒト好中球による

の菌糸状発育 阻止作用を増強することを示している．これらの 有効性を示す G-CSF 濃度は本報告で示した，正常 マウス BMC での有効濃度（0.5ng ml）に近い．正 常マウス BMC 中には，かなり分化し，それ自身で

C. albicans

発育阻止能を有する好中球があると考

えると，この有効濃度の一致は説明できる．事実，

成 熟 好 中 球 を 前 培 養 な し に 活 性 化 す る LPS に よって正常 BMC の抗

活性が増強した 結果（Fig. 1）もこの考え方を支持するであろう．

この

発育阻止能の増強のメカニズムに

ついては現時点では不明である．ただし，Palma ら

は 好 中 球 の

発 育 阻 止 能 の LPS に よる増強は，好中球から分泌されるラクトフェリ ン等の抗真菌物質の増加が一因となることを報告 しており，そのような機序が上記の前培養なしで の活性化に関係しているかもしれない．

CY-BMC で は 0.5ng ml の 100 分 の 1 の 濃 度

（0.005ng ml）の G-CSF で

発育阻止能 の増強がおこった．CY-BMC は未熟な幹細胞が存 在し，多糖体などに，すみやかに反応することが 知られている

．この結果もそれと対応している と推定される．細胞群が G-CSF に応答し，更に

albicans

発育阻止能の増強を示すのかを明らかに

すべく，培養前後の細胞像について詳細に検討す る必要があるだろう．

内田ら

は CY 投与マウスでは少量の G-CSF が

C. albicans

感染の防御に働くことを，また Sato-

naka ら

は G-CSF 産生が関与すると考えられる 腸球菌加熱死菌製 剤 FK-23 の

感 染 防 御能が CY 投与マウスでのみ顕著にみられること を報告している．正常マウスにくらべて CY 処置 マウスでは少量の G-CSF による

感染 防御能がより顕著に増強されるという所見は，本 研究において示された CY-BMC の高い G-CSF 感 受性によって説明されよう．さらに，ベスタチン が，CY 投与マウスではより少量の投与で

感染を防御できることを示した Aoyagi ら

Fig. 4 （Left）Effects of GM-CSF onC. albicans growth inhibition by CY-treated mouse-derived bone marrow cells preincubated 24 hours

（Right）Effects of M-CSF onC. albicans growth inhibition by CY-treated mouse- derived bone marrow cells preincubated 24 hours

の成績は CY-BMC が G-CSF と構造的にも薬理学 的にもまったく異なる低分子免疫増強物質に対し ても高感度に応答する可能性を示唆している．

CY-BMC は G-CSF のみならず，少なくとも低 濃 度 の GM-CSF の 存 在 下 に お い て も

発育阻止能の増強がみられた．GM-CSF の

発育阻止能増強作用は，BMC についてはほ とんど報告されていないが，ヒト好中球に対して はいくつかは報告されており，Blanchard ら

お よび Richardson ら

はそれぞれ 2.5pg ml 以上と 4ng ml 以上の GM-CSF が

発育阻止能 を増強すると報告している．またマウス好中球と マウス GM-CSF を組み合わせた実験系は Tansho ら

が 1.5〜6.5ng ml の GM-CSF 濃度で 好 中 球 の

Candida

発育阻止能を増強することを報告してい

る．このように好中球に対する GM-CSF の

での効果は報告者または用いた実験系の違い によって，大きくことなるものの，CY 投与マウス 由来の BMC を用 い た 本 研 究 に お い て GM-CSF の最小有効濃度が 0.05ng ml であったことは，こ の測定系が GM-CSF に対しても好中球を用いた 系と同程度かまたはそれ以上の高感度を示す可能 性をうかがわせる．

一方，M-CSF の効果については高濃度に添加す る必要があり，その理由は不明であり，今後，さ らに検討が必要であろう．

この測定法は BMC を食細胞へ分化・誘導させ

C. albicans

発育阻止能を増強するサイトカインや

薬剤を高感度に検出すると考えられる．今後，こ の方法を用いて G-CSF や GM-CSF の産生誘導に 関与するような新たな免疫療法剤の検索および評 価が可能になるものと期待される．事実，一部の 漢方製剤投与血清についても評価ができた．

本論文の要旨は第 100 回日本外科学会総会，第 74 回日 本感染症学会総会で発表した．

文 献

1）安部 茂，山口英世：真菌感染に対する生体防御

能．日本医真菌学雑誌 2000；41：77―81.

2）Abe S, Satoh T, Tokuda Y, Tansho S, Yamaguchi H：A rapid colorimetric assay for determination of leukocyte mediated inhibition of mycelial growth of Candida albicans. Microbiol Immunol

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3）Nozawa RT, Yokota T：Microbicidal Activity of bone marrow cells. Augmentation ofCandidakill- ing activity of the cells by culturing with fibro- blast conditioned medium . Microbiol Immunol 1982；26：153―161.

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（1→3）-β-D-Glucan preparation, sonifilan, in cyclo- phosphamide-induced leukopenic mice . Biosci Biotechnol Biochem 1999；63：104―110.

5）Yamazaki M, Okutomi T：Augmentation of re- lease of cytotoxin from murine bone marrow and peritoneal macrophages by tumor transplanta- tion. Canser Res 1989；15：352―356.

6）Tansho S, Abe S , Yamaguchi H ： Inhibition of Candida albicans growth by murine peritoneal neutrophils and augmentation of the inhibitory activity by bacterial lipopolysaccharide and cy- tokines. Microbiol Immunol 1994；38：379―383.

7）Uchida K, Yamamoto Y, Klein TW, Friedman H, Yamaguchi H ： Granulocyte-colony stimulating factor facilitates the restoration of resistance to opportunistic fungi in leukopenic mice. J Med Vet Mycol 1992；30：293―300.

8）Yamamoto Y, Klein TW, Friedman H, Kimura S, Yamaguchi H ： Granulocyte colony-stimulating factor potentiates anti-Candida albicansgrowth in- hibitory activity of polymorphonuclear cells . FEMS Immunology and Medical Microbiology 1993；7：15―22.

9）Roilides E, Holmes A, Blake C, Pizzo PA, Walsh TJ ： Effects of granulocyte colony-stimulating factor and interferon-γ on antifungal activity of human polymorphonuclear neutrophils against pseudohyphae of different medically important Candida species . Journal of Leukocyte Biology 1995；57：651―656.

10）Palma C, Cassone A, Serbousek Det al．：Lac- toferrin release and interleukin-1, interleukin-6, and tumor necrosis factor production by human polymorphonuclear cells stimulated by various lipopolysaccharides：relationship to growth inhi- bition ofCandida albicans. Infect Immun 1992 ； 60：4604―4611.

11）Satonaka K, Ohashi K, Nohmi T, Yamamoto T, Abe S, Uchida K：Prophylactic effect ofEntero- coccus faecalisFK-23 preparation on experimental candidiasisin mice. Microbiology and Immunology 1996；40：217―222.

12）Aoyagi K, Abe F, Nemoto K, Abe S, Ishizuka M,

Takeuchi T：The novel immunostimulant N-563, an analogue of deoxyspergualin, promotes resis- tance toCandida albicansinfection in mice. Journal of Antibiotics 1994；47：1077―1083.

13）Blanchard DK, Michelini-Norris MB, Djeu JY：

Production of granulocyte-macrophage colony- stimulating factor by large granular lymphocytes stimulated withCandida albicans：Role in activa-

tion of human neutrophil function：Blood 1991；

77：2259―2265.

14）Richardson MD, Brownlie CED, Shankland GS：

Enhanced phagocytosis and intracellular killing ofCandida albicans by GM-CSF-activated human neutrophils . J Medical and Veterinary Mycol 1992；30：433―441.

In Vitro

Assay Method for Augmention of Anti-Candida Activity of Murine Bone Marrow Cells by Cytokines

Shinichiro MOROFUJI

, Shigeru ABE

, Shigeru TANSHO

, Yasuo ONO

, Hideyo YAMAGUCHI

& Kota OKINAGA

Teikyo University School of Medicine,^1）Department of Microbiology and Immunology,

2）Second Department of Surgery,^3）Teikyo University, Research center for Mycology

It is important to develop a sensitive assay method for evaluation of immunomodulating candi- dates including granulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）which may augment host defense func- tion against opportunistic infections. Effects of CSFs on anti-Candida activity of bone marrow cells

（BMC）obtained from normal or cyclophosphamide-treated immunocompromised mice（CY-mice）

were investigated. When BMC from CY-mice were preincubated for 24 hours in the presense of

more than 0.005 ng ml of G-CSF, anti-Candida activity was enhanced at 160 of effector（BMC）to tar-

get （C. albicans ） ratio , whereas anti-Candida activity of BMC from CY-untreated mice was not

changed at concentrations less than only by more than 0.5 ng ml of G-CSF. Similar enhancement of

activity was also observed in the presense of more than 0.05 ng ml of granulocyte-macrophage col-

ony stimulating factor（GM-CSF）in this assay using BMC from CY-mice. These findings suggest that

this

assay method can evaluate the activity of G-CSF and GM-CSF to augment leukocyte s

anti-Candida activity.