薬物トランスポーター群の分子認識・輸送の多様性 に基づいた臓器移行性の制御
著者 辻 彰
著者別表示 Tsuji Akira
雑誌名 平成14(2002)年度 科学研究費補助金 基盤研究(A) 研究成果報告書
巻 2000‑2002
ページ 12p.
発行年 2003‑03
URL http://doi.org/10.24517/00049355
Creative Commons : 表示 ‑ 非営利 ‑ 改変禁止
http://creativecommons.org/licenses/by‑nc‑nd/3.0/deed.ja
ペプチド輸送系の組織特異的発現と分子認識多様性 を利用した腫瘍選択的薬物デリバリー
(課題番号12557204)
平成12年度〜平成13年度科学研究費補助金 基盤研究(B)(2)研究成果報告書
平成14年3月
研 究 代 表 者 辻 彰 (金沢大学薬学部教授）
金沢大学附属図書龍
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ペプチド輸送系の組織特異的発現と分子認識多様性 を利用した腫瘍選択的薬物デリバリー
(課題番号12557204)
平成12年度〜平成13年度科学研究費補助金 基盤研究(B)(2)研究成果報告書
平成14年3月
研 究 代 表 者 辻 彰
(金沢大学薬学部教授）
ここ蚕二重二二翌
平成12年度〜平成13年度科学研究費補助金
課 題 番 号
研 究 課 題
研 究 組 織
研究経費
(基盤研究(B)(2))研究成果報告書
12557204
ペプチド輸送系の組織特異的発現と分子認識 多様性を利用した腫瘍選択的薬物デリバリー
研究代表者：
辻 彰 （ 金 沢 大 学 薬 学 部 教 授 ）
研究分担者：
玉 井 郁 巳 （ 金 沢 大 学 薬 学 部 助 教 授 ）
崔 吉 道 （ 金 沢 大 学 大 学 院 自 然 科 学 研 究 科 助 手 ）
平成12年度 平成13年度
計
5,600千円
4,100千円
9,700千円
は じ め に
腫瘍組織への抗癌性物質の標的化はがんの化学療法にとって最も重要なファクタ ーである。腫瘍標的化のために抗体を利用した手法や表面修飾リポソームを利用す るアプローチが試みられてきているが、いずれも高分子物質を利用した手法である が故に、最終的に血液中から腫瘍組織細胞内へ抗癌活性物質を送り込む過程に問題
を含む。
薬物の組織移行性は、各組織を形成する細胞膜の透過性によって決定される。
従来より薬物の細胞膜透過性は、薬物の分子サイズ、脂溶性、イオン化状態などの 物理化学的因子によって決まる単純拡散機構に従うものと考えられてきた。しかし、
細胞膜を隔てた細胞内外の物質交換機能を有するトランスポータータンパクを介す ることにより、生理的物質のみならず、薬物の細胞膜透過も進行することが、申請 者らの種々研究手法を用いた成果により見いだされてきた。単純拡散に従う細胞膜 輸送は非特異的あるため薬物の組織移行性に特異性を期待することは困難である。
一方、トランスポーターは生理的役割に応じて組織特異的に発現するため、トラン スポーターを介した細胞膜輸送を医薬品にも応用できれば、薬物の組織移行性に高 い選択性と効率をもたらすことが可能である。さらに、腫瘍細胞は旺盛な細胞増殖 を支えるために多くの栄養物を積極的に取り入れるためのトランスポーター機能を 過剰に発現している事例が報告されている。従って、正常組織における分布性が限 局され、しかも腫瘍細胞に高発現するトランスポーターを見いだすことは十分可能 である。
研究代表者等は、正常な小腸・腎上皮細胞刷子縁膜に特異的に発現し、ジ・トリ ペプチドを選択的に細胞内に取り込むペプチドトランスポーターに関する多くの研 究成果を得てきた｡本トランスポーターはペプチドサイズに対しては厳格であるが、
構成アミノ酸の認識性は幅広く、実際にペプチド様薬物も認識・輸送する。ペプチ Fトランスポーター様活性は一部の腫瘍細胞株にも見いだされる。したがって、ト ランスポーターを介した抗がん剤の腫瘍組織ターゲティングのアプローチとして、
正常組織における発現が非常に限局されたペプチドトランスポーターの有用性が期 待できる。
本研究では、上述の背景に基づき、腫瘍組織細胞内移行の律速段階である細胞 膜透過性を促進し、しかも腫瘍組織特異性を併せ持たすことが可能な「腫瘍組織細 胞膜に高い特異性を有する物質輸送トランスポーター分子を用いた全く新しい腫瘍
ターゲティング法の開発」を目的とした。
1
）
本研究により得られた成果を以下にまとめる。
ヒト小腸オリゴペプチドトランスポーターhPEPrlcDNAあるいは空の発現
ベクターをHeLa細胞に遺伝子導入し、強制発現細胞(HeLa‑hPEPrl)およ
ERrnock細胞を得た。HeLa‑hPEPrl細胞におけるhPEPT1mRNAの発現を
RI‑PCRによって確認することが出来た。Hel̲a‑hPEPT1ヘのペプチF性抗が
2
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ん剤[3H]ベスタチン取り込み活性について検討を行ったところ、mock細胞と 比較してその取り込み量が約5倍に増加し、非標識のベスタチンの共存による 阻害効果、pH依存性等がみられ、hPEPr1が有する輸送活性が再現されること が分かった。
HeLa‑hPEPrl細胞をヌーFマウス(Balb/cnu/nu)の背部皮下に移植し することにより担がんマウスを作製した。対照動物として、HeLa細胞の親株 を同様にマウスに移植し腫瘍を形成させた。両マウスにペプチド構造を有する 抗腫瘍薬ベスタチンおよびジペプチドの[3H]カルノシンを投与し、30分後に 血中および腫瘍そのたの組織中の薬物濃度を定量することにより、各化合物の 組織移行性を組織対血漿中濃度比(Kp値）として評価した結果、hPEPI､1を発 現する腫瘍組織におけるKp値はそれぞれ2.0および2.5と算出された。これらの 値は細胞間液のみ分布する[14C]イヌリンの値と比べ有意に高く、両化合物が腫 瘍細胞内に取り込まれていることが示された。HeLa親株細胞の移植により形 成された腫瘍ヘのペプチド化合物の蓄積が観察されたなかったことから、
hPEPr1の過剰発現による特異的な腫瘍ヘの蓄積であることが示された。
hPEPr1発現および非発現細胞へのinvitroでのベスタチンに対する感受性の 変化をMIT法により検討したところ、HeLa‑hPEPr1細胞では約2"g/m1以上 の濃度において顕著な増殖抑制効果がみられた。一方mock細胞については検 討を行ったベスタチン濃度(0.22〜222"g/ml)で増殖抑制効果はほとんどみ られなかった。Invivo実験として担がんマウスにベスタチン(0.5mg/kg)を28 日間経口投与した結果、HeLa‑hPEPr1を移植した腫瘍の増殖はmOck細胞の 腫瘍に比べて顕著に抑制された。これらの結果より、腫瘍細胞にhPEPrlが発 現することによりペプチド性化合物の蓄積および感受性が上昇することが示さ れた。
PEPrlおよびPEPr2のmRNA発現量を定量解析し、腫瘍細胞の持つ輸送活 性と比較検討することを目的として、ヒト肺、乳腺、冑、結腸、膵臓、膀胱、
子宮頸部、皮層、骨あるいは白血球、リンパ球に由来する各種株化腫瘍細胞を 培養後、全RNAを調製し、リアルタイム定量PCR解析を行った。その結果、既 知の代表的なオリゴペプチドトランスポーターであるPEPI､1の発現量は白血病 細胞由来ML‑1細胞で最も高く、次いでNakajimaおよびCaco‑2に顕著な発現 が見られた。PEPr2は殆どの細胞に発現が見られた。これらぺプチドトランス ポーターの発現量を放射性標識グリシルザルコシンおよびベスタチンの取り込 み活性と比較した結果、トラスポーター発現量と輸送活性とが必ずしも一致し ないことから、新規のぺ プチドトランスポーターの存在が示唆された。
PEPr1発現アデノウイルスの作成し、invivoにおけるペプチド性薬物の組
織移行性改善を肝臓を用いて達成することにも成功した。
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）
7
）
更に本研究期間中には、腫瘍細胞の増殖に関与するLargeneutralamino acidtranSporterLAT1およびそのホモログであるLAT2が、血液脳関門を形成 する脳毛細血管内皮細胞にも発現することをラット初代培養脳毛細血管内皮細 胞および初代培養細胞をSV40の導入により株化したRBECl細胞を用いて明ら かにした。これら細胞のロイシン輸送の速度論的析からLAT1およびLAT2は血 液脳関門においてシステムLとして重要な役割を持つことを明らかにすること が出来た。
がん細胞に発現するOCTN、○ATP等のトランスポーターのクローニングな らびに機能特性解析、種々トランスポーター群の体内動態制御への利用法につ いての検討も行った。
本研究による成果は、以上のように腫瘍細胞に発現するトランスポート活性を利 用することにより、ペプチF様構造を有する抗腫瘍薬を腫瘍組織特異的に送達する ことが可能であることを理論的に実証するものである。今後、PEPI､1、PEPI､2の輸 送特性を更に詳細に明らかにし、その構造認識に適合する抗腫瘍薬を開発すれば、
簡便な経口投与により腫瘍組織特異的に薬理活性を発現することが期待できると思
われる。
本科学研究費によって上述の研究を展開できたことに感謝致します。
I
発表を行った研究成果を、学術論文・学会発表に分けて以下に示します。
平成14年3月
金沢大学薬学部 教 授
辻 彰
研 究 発 表
学会誌（総説を含む）
1 ) N a k a n i s h i , T . , T a m a i , I . , T a k a k i , A . , T s U j i , A . , C a n c e r c e l l ‑ t a r g e t e d d r u g d e l i v e I y u t i l i z i n g o l i g o p e p t i d e t r a n s p o r t a c t i v i t y . I n t . J . C a n c e r , 8 8 , 2 7 4 ‑ 2 8 0 ( 2 0 0 0 ) .
2 ) H i r o h a s h i , T . , S u z u k i , H . , C h u , X . Y . , T a m a i , I . , T s U j i , A . , S u g i y a m a , Y . , T h e f u n c t i o n
a n d e x p r e s s i o n o f m u l t i d r u g r e s i s t a n c e ‑ a s s o c i a t e d p r o t e i n ( M R P ) f a m i l y i n h u m a n c o l o n a d e n o c a r c i n o m a c e l l s ( C a c o ‑ 2 ) . J . P h a r m a c o L E x p . T h e r . , 2 9 2 , 2 6 5 ‑ 2 7 0 ( 2 0 0 0 ) .
3)Ogihara,T.,Tamai,I.,TsUji,A.,Stmcturalrequirementsofsubstratesfbr s t e r e o s e l e c t i v e m o n o c a r b o x y l a t e t r a n s p o r t i n C a c o ‑ 2 c e l l s . P h a r m . P h a r m a c o l . C o m m u n . 6,161‑165(2000).
4 ) T a m a i , I . , O h a s h i , R . , N e z u , J . , S a i , Y . , K o b a y a s h i , D " O k u , A . , S h i m a n e , M . , T s U j i , A . , M o l e c u l a r a n d f i l n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f o r g a n i c C a t i o n / C a r n i t i n e t r a n s p o r t e r f a m i l y i n m i c e . J . B i o l ・ C h e m " 2 7 5 , 4 0 0 6 4 ‑ 4 0 0 7 2 ( 2 0 0 0 ) .
5 ) M a y a t e p e k , E . , N e z u , J . , T a m a i , I . , O k u , A . , K a t s u r a , M . , S h i m a n e , M , T s U j i , A . , T w o novelmissensemutationsoftheOCTN2gene(W283RandV446F)inapatientwith p r i m a I y s y s t e m i c c a r n i 伽 e d e f i c i e n c y . H u m . M u t a t . ( O n l i n e ) 1 5 , 1 1 8 ( 2 0 0 0 ) .
6 ) T a m a i , I . , N e z u , J . , U c h i n o , H . , S a i , Y . , O k u , A . , S h i m a n e , M , , T s U j i , A . , M o l e c u l a r identificationandcharacterizationofnovelmembersofthehumanorganicanion t r a n s p o r t e r ( O A T P ) f a m i l y . B i o c h e m ・ B i o p h y s , R e s , C o m m u n . , 2 7 3 , 2 5 1 ‑ 2 6 0 ( 2 0 0 0 ) . 7 ) T a m a i , I . , T s U j i , A . , T r a n s p o r t e r ‑ m e d i a t e d p e r m e a t i o n o f d r u g s a c r o s s t h e b l o o d ‑ b r a i n
b a r r i e r . J . P h a r m . S c i , 8 9 , 1 3 7 1 ‑ 1 3 8 8 ( 2 0 0 0 ) .
8）辻彰，薬物の生体膜輸送機構解析を基盤とした体内動態抑制に関する研究，
薬物動態,15,112‑135(2000)．
9）辻彰，消化管吸収過程における薬物間相互作用，月刊薬事，42,287‑293 ( 2 0 0 0 ) .
10)辻彰,薬物の血液脳関門透過性の改善Pharm.D.,2,1‑5(2000).
11）玉井郁巳，小腸上皮トランスポーター群の分子機構論的解析と薬物の経口デ リバリーヘの応用．薬学研究の進歩,16,77‑88(2000).
12）玉井郁巳，辻彰，トランスポーターが関与する薬物動態と病態薬事新報 2 1 4 1 , 9 ‑ 1 5 ( 2 0 0 0 ) .
13）玉井郁巳，大橋力也，根津惇一，奥飛鳥，嶋根みゆき，崔吉道，辻彰，
OCTNトランスポーターファミリーの組織分布・輸送機能の多様性.薬物動態，
1 5 , 1 8 2 ‑ 1 8 8 ( 2 0 0 0 ) .
14)Naruhashi,K,Tamai,I.,Inoue,N.,Muraoka,H.,Sai,Y.,Suzuki,N.andTsUji,A., I n v o l v e m e n t o f m u l t i d r u g r e s i s t a n c e ‑ a s s o c i a t e d p r o t e i n 2 i n i n t e s t i n a l s e c r e t i o n o f g r e p a f I o x a c i n i n r a t s . A n t i m i c r o b ・ A g e n t s C h e m o t h e r . , 4 6 , 3 4 4 ‑ 3 4 9 ( 2 0 0 1 ) .
15)Kido,Y､,Tamai,I.,Uchino,H.,Sai,Y.,Suzuki,F,andTsUji,A.,Molecularand f u n c t i o n a l i d e n t i f i c a t i o n o f l a r g e n e u t r a l a m i n o a c i d t r a n s p o r t e r L A T l a n d L A T 2 a n d t h e i r p h a r m a c o l o g i c a l r e l e v a n c e a t t h e b l o o d ‑ b r a i n b a r r i e r . J . P h a r m . P h a r m c o l . , 5 3 , 4 9 7 ‑ 5 0 3 ( 2 0 0 1 ) .
1 6 ) N a r u h a s h i , K . , T a m a i , I . , I n o u e , N . , M u r a o k a , H . , S a i , Y . , S u z u k i , N . a n d T s U j i , A , , A c t i v e i n t e s t i n a l s e c r e t i o n o f n e w q u i n o l o n e a n t i m i c r o b i a l s a n d t h e p a r t i a l c o n t r i b u t i o n o f P ‑ g l y c o p r o t e i n . J . P h a r m . P h a r m c o l . , 5 3 , 6 9 9 ‑ 7 0 9 ( 2 0 0 1 ) .
17）玉井郁巳,崔吉道根津淳一,奥飛鳥嶋根みゆき，小泉昭夫,辻彰薬物ト ランスポーター群の遺伝子多型，日本動態16,127‑133(2001)
1 8 ) T o y o b u k u H , S a i Y , T a m a i l , T s U j i A . E n h a n c e d d e l i v e r y o f d r u g s t o t h e l i v e r b y
a d e n o v i r u s ‑ m e d i a t e d h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n o f h u m a n o l i g o p e p t i d e t r a n s p o r t e r P E P T l .
J P h a r m a c o l E x p T h e r , ; i n p r e s s
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口頭発表
招待講演
T s U j i , A ， , T a m a i , 1 . , ' ･ G R e s t r i c t e d b r a i n e n t l y o f e b a s 伽 e c a u s e d b y P ‑ g l y c o p r o t e i n i n t h e b l o o d ‑ b r a i n b a r r i e r " , I n t e r n a t i o n a l S e n d a i H i s t a m i n e S y m p o s i u m , N o v e m b e r
2000,Sendai,JAPAN.
T a m a i , I . , T S U j i , A . , @ G T r a n s p o r t e r ‑ m e d i a t e d d r u g i n t e r a c t i o n ' ' , I n t e r n a t i o n a l C o n f e r e n c e o n D r u g ‑ D r u g l n L r a c t i o n s , J u n e 2 0 0 0 , B a l t i m o r e , U S A .
T s U j i , A . , T i s s u e s e l e c t i v e d r u g d e l i v e r y u t i l i z i n g t r a n s p o r t e r s , M i l l e n n i a l W o r l d C o n g r e s s o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s , A p r i l l 6 ‑ 2 0 , 2 0 0 0 , S a n F r a n c i s c o , U S A . 玉井郁巳、辻彰、第48回日本化学療法学会西日本支部総会シンポジウム
排出タンパク質による薬剤耐性"、京都、2000年12月。
玉井郁巳、辻彰、第74回日本薬理学会年会シンポジウム、血液脳関門に おける輸送機構と脳へのドラッグデリバリー、 血液脳関門排出輸送系によ る薬物の中枢性副作用回避'，、横浜、2001年3月21‑23日。
玉井郁巳辻彰,トランスポーター研究によるドラッグデリバリー戦略の 新展開日本農芸化学会,京都,2001年3月24‑27日。
玉井郁巳、日本薬学会第121年会シンポジウム、薬物輸送・排泄の分子機構、
吸収・排泄型トランスポーター群の分子認識・輸送の多様性と遺伝子多型"、
札幌、2001年3月28‑30日。
玉井郁巳、辻彰、第106回日本解剖学会総会シンポジウム、膜輸送タンパ ク質から脳機能を探る、 血液脳関門における薬物トランスポーター 高知 県南国市、2001年4月2‑4日。
玉井郁巳、福井県立大学大学院特別講義、 薬物動態とトランスポーター"、
福井、2001年4月26日。
玉井郁巳、ドラッグフォーラムオオサカ、 薬物動態とトランスポーター"、
2001年6月20日、大阪。
1 1 )
1 2 ）
1 3 ）
1 4 ）
1 5 ）
I.Tamai,P‑Glycoprotein‑mediatedinteractionbetweenamiodaroneandits CPY3A4‑metaboliteinintestine,第19回生物薬剤学研究会,東京2001年6月 8‑9日
玉井郁巳、日本薬剤学会第26回製剤セミナー、 ペプチドトランスポータ ーを用いた薬物デリバリー 、木更津、2001年7月20日。
玉井郁巳、安全性評価研究会「奈川フォーラム｣、 トランスポーターの生 理機能と薬物動態"、奈川（長野県)、2001年9月1日。
崔 吉 道 玉 井 郁 巳 ， 辻 彰 ， 消 化 管 ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 発 現 変 動 と 薬 物 吸収制御への応用，第16回日本薬物動態学会,2001年10月17‑19日，神戸．
玉井郁巳，辻彰,トランスポーター研究によるFラッグデリバリー戦略の 新展開日本農芸化学会,京都,2001年3月24‑27日．
一 般 発 表
1)Sai,Y.,Nakanishi,T,,Takaki,A.,Koshida,M"Matsumura,N"Saitoh,Y.,Tamai,I., T s U j i , A . , S e l e c t i v e d e l i v e I y o f p e p t i d e a n t i c a n c e r d r u g s v i a o l i g o p e p t i d e t r a n s p o r t e r e x p r e s s e d i n c a n c e r c e l l s , F I P 2 0 0 0 , A p r i l l 6 ‑ 2 0 ( 2 0 0 0 ) , S a n F r a n c i s c o , U S A .
2）玉井郁巳崔吉道，辻彰，ペプチドトランスポーターを利用した腫瘍ヘの薬 物デリバリー,第16回日本DDS学会,2000,7,秋田．
3）加ヶ美徹豊福秀一,崔吉道玉井郁巳，辻彰，アデノウイルスベクターを用 いたペプチドトランスポーター遺伝子導入による薬物の組織,第16回日本薬物 動態学会,2001年10月17‑19日，神戸．
4）崔吉道,豊福秀一,玉井郁巳，辻彰，トランスポーター発現アデノウイルスを 用いたペプチF性薬物の体内動態制御,第17回DDS学会,2001年7月12‑13日，大
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5）橋谷瞳崔吉道,玉井郁巳,辻彰，アデノウイルスベクターを利用した消化
管組織への外来遺伝子導入と機能発現第120年会日本薬学会,2001年3月28‑30 日，札幌
6）豊福秀一,氷見長夫,崔吉道,玉井郁巳,辻彰,肝ターゲッティングを目指し たアデノウイルスベクターによるトランスポーター遺伝子発現,第120年会日本 薬学会,2001年3月28‑30日，札幌
7）豊福秀一,氷見長夫,崔吉道玉井郁巳辻彰，臓器選択的ドラックデリバリ ーを目指したアデノウイルスベクターによるトランスポーター遺伝子発現，日本
、
