機械的刺激に対する骨および骨系細胞の応答に関する実験的研究

(1)

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

機械的刺激に対する骨および骨系細胞の応答に関する実験的研究

蔵田, 耕作

Graduate School of Engineering, Kyushu University

https://doi.org/10.11501/3180274

出版情報：Kyushu University, 2000, 博士（工学）, 課程博士バージョン：

権利関係：

(2)

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(3)

機械的刺激に対する

骨および骨系細胞の応答に関する実験的研究

平成12年12月

蔵田耕作

(4)

3.1 緒言. • • • . • . . . • . • • • • • • • . • . . . • . • 42 3.2 対象および方法. • • • . • • • • • • . • . • . • • . • . . • . . • 43 3.2.1 対象. • . • . • • • • • . . . . • • • • . • . . • • • • . • . 43

3.2.2 マイクロCTによる骨形態の経時計測と機械的刺激の負荷. . . • • . 44

3.2.3 剛体バネモデルおよび二次元有限要素モデルによる応力解析. . . . 46

3.3 結果. . . . • • . . . . . . . 48 3.4 考察. • • • . • • • . . . . . . • . . • . . • . . • . . . • . . • 52 3.5 結言. . . . • . . . . . . 56

.‘，A

(5)

第4章ラット尾椎形態リモデリングの三次元応力解析

4.1 緒言.

4.2 対象および方法.

4.2.1 対象.

4.2.2 機械的刺激の負荷.

4.2.3 形態計測と応力解析.

4.3 結果.

4.4 考察.

4.5 結言.

守J 寸l ny ny nuJ Ay -- aq nhU 5 F3 F3

「3 FD

「D にU 74 74

6.4.2 結果.

6.4.3 考察.

6.5 結言.

103 111 114

第7章結論 ¹¹⁵

参考文献 ¹¹⁸

第1章緒論

1 .1

はじめに

骨は，重力に抗した姿勢の保持や運動機能の維持を行うに不可欠な支持組織である.

同時に，生体内のカルシウムの99%以上を含有する貯蔵庫として働き，体液のホメオスタシス(Homeostasis) を維持する機能を持つ. 形態と力学的強度を維持しながら，さらに細胞外液中のCa2+を一定濃度に保つために，一方では骨を添加して強度の保持が，

他方では骨を破壊して Ca2+ の供給が，生涯を通して行われている. つまり，骨は静的な構造物ではなく，常に吸収と形成を行っている動的な組織である. このような骨の再構築をリモデリング(Remodeling) と呼んでいる. 骨リモデリングは，ホルモン (Hormone)，サイトカイン(Cytokine) に加えて力学的負荷(機械的刺激)が関与する複雑な機構によって調節される. 近年，骨吸収や骨形成に関与する細胞，これらの細胞に作用するホルモン，サイトカイン等の機能が次々と明らかにされ，骨代謝の平衡維持機構の解明が進んでいる. 一方，機械的刺激の作用に関しては，力学的負荷の増加が骨量増加を，力学的負荷の減少は骨量減少をもたらすことは臨床的によく知られているが，その機構については不明な点が非常に多い. 本論文では， inνiνo動物モデル実験系， X線マイクロCT(X-ray microcomputed tomography)による非侵襲形態計測， CT画像をベースとした有限要素モデル(Finite element model， FE model)による応力解析， in νitro細胞培養実験系，局所的な機械的物性計測法等を確立および利用して，機械的刺激に対する骨組織の応答について実験的研究を行う. これらの研究を通して，骨リモデリングのメカニズムについて工学的・力学的視点から検討する.

本章では，本研究の背景として，骨組織の構造と構成成分，リモデリング機構についての基礎知識をまとめた後，機械的刺激に対する骨組織および骨系細胞の応答に関する過去の研究を概説する. さらに，本研究の目的と第2章以降の本論文の構成について述べる.

(7)

1.2

研究背景

1.2.1

生体骨組織の構造

骨は，骨質(Bone matrix)，関節軟骨(Articular cartilage)，骨膜(Periosteum)，骨髄(Maπow) の4組織からなり，さらに血管，神経が豊富に分布する.

上腕骨(Humerus)や大腿骨(Femur)のような長管状の骨，すなわち長管骨(Long bone) は，骨幹 (Diaphysis)，骨幹端(Metaphysis)，骨端(Epiphysis) に分けられる(図1.1). 骨端は長管骨の両端にある最も横径の大きい部分であり，硝子軟骨 (Hyaline cartilage) からなる関節軟骨で覆われている.関節軟骨の下には軟骨下骨(Subchondralbone)があり，

さらに海綿骨 (Cancellous bone， Spongy bone)の骨梁(Trabeculめからなる網目構造へと移行する. 骨幹は皮質骨(Cortical bone)(または綴密骨 (Compact bone)) に囲まれた中空円筒状構造物で，内部は骨髄によって満たされた骨髄腔を形成している. 皮質骨および海綿骨は，骨の主体をなす骨質である. 両者は明瞭な境界を持たずに移行しており，

それらの骨量割合は部位によって異なる. 例えば，骨幹部の骨髄腔では海綿骨がほとんど存在しない. 骨の長軸方向への成長は，骨端成長軟骨板(Epiphyseal growth plate) で行われる. 成長軟骨板では，骨

端側から骨幹部へ向かつて長軸方向に配列した軟骨細胞が柱状構造をなしており，血管侵入等を伴って軟骨基質が次第に石灰化されて

いく. これらの基質は，さらに骨リモデリングによって成熟した骨梁へと改変される. 成人して骨成長が止まると，成長軟骨板は閉じてしまい，板状に横走する骨梁になる. この骨化して残った成長軟

骨板の痕は骨端線(Epiphyseal line)

と呼ばれる. 骨幹端は骨端と骨幹

との境界をなす部分であり，成長軟骨板より骨幹側の領域を指すが，骨幹部との境界は明瞭ではな

主として骨の表層を取り囲む皮質骨は，多数の層板構造からなる非常に硬い組織である(図1.2)・大

Articular cartilage

Epiphysis 7

Metaphysis

十

Diaphysis

Metaphysis Diaphysis

十

i

Epiphyseal line Cancellous bone

Cortical bone Periosteum

Endosteum Marrow

Fig.l.l Structure of a long bone (femur).

- 2 -

型日甫乳類の骨幹部皮質骨は3つの層，つまり外層，中間層，内層からなっている. 骨膜に面した外層と骨髄に面した内層は皮質骨全体を同心円状に取り囲むような層板骨 (Circumferential lamellar bone)であり，それぞれ骨膜性骨 (Periosteal bone)，内骨膜性骨 (Endosteal bone)と言われている.中間層では血管の通る2つの管系が発達している. 1 つは骨長軸と平行に走行するノ\ノtース管(Haversian canal)，もう 1 つはハパース管と垂直方向に走行しハパース管同士を連絡させているフォルクマン管(Volkmann's canal)で、

ある. 中間層では，このハパース管を中心にして骨層板(Lamella) と呼ばれる間質と骨細胞(Osteocyte)とによる層板構造が形成されており(図1.3)，これを骨単位( オステオン， Osteon)またはハパース系(Haversian system)と呼ぶ. オステオンの聞には，リモデリングの結果取り残されたオステオンの断片である介在層板(lnterstitial lamella)が存在する. 各層板には多数の骨小腔(Osteocytic lacuna)とそれに連続する細い骨小管(Bone canaliculus) が認められる. 骨小腔の中には骨細胞が存在している. これらは骨小管の中に細胞質突起を伸ばして網状構造を形成し，ギャッフ。結合(Gap junction)を介した細胞間情報伝達を行っている.

一方，海綿骨は，骨内側面に枝分かれした骨梁(あるいは骨小束事，骨小柱)の三次元

Endosteal Periosteal layer

Lamel1a

Haversian canal Volkmann's canal

Fig.l.2 Structural organization of cortical bone.

- 3 -

(8)

網目構造を形成しており，骨髄腔内で互いに連結している. この骨梁間の髄腔には血管が分布し，その周囲で造血が行われている. 海綿骨の網目状の配列は力学的に対応し得る構造をしており，基本的には外力に抗することができるような配向をとっていると考えられている. 海綿骨はハパース系を持たないので，骨基質内の骨細胞は骨小管を通して物質交換を行う. 海綿骨骨梁を組織切片として観察すると，表面から三日月状に層となった微小領域が認められる(図1.4)・これは骨吸収が行われた部位に新しく層板骨が形成されたもので骨リモデリングの結果として観察される構造である.

皮質骨のオステオンに相当し，パケット(Packet)と呼ばれる.

骨質は骨膜(Periosteum)と呼ばれる結合組織で覆われている.外層はコラーゲン線維 (Collagen fiber)と線維芽細胞(Fibroblast)からなり，内層には多分化能を有する細胞が存在する. この細胞は，骨成長や骨修復時に分化して骨芽細胞(Osteoblast)となり，骨の付加的形成を担う. 骨膜には血管，神経が豊富に分布しており，これらはフオルクマン管を介して骨質中へ入る.この骨膜は関節面，靭帯や膿の付着部には存在しない.

方，髄腔側は，骨芽細胞等の連結体で覆われている. 生理的状態では皮質骨内側に膜性線維は存在しないが骨折時等には骨形成能を有する線維性の細胞が分化・増殖し，膜性となる. これを骨内膜 (Endosteum)と呼ぶ.

1.2.2

生体骨組織の構成成分

骨は，骨芽細胞(Osteoblast)，骨細胞(Osteocyte) ，破骨細胞(Osteoclast)等の細胞成分と細胞聞を埋める細胞外基質(Extracellular matrix)から構成されている(図1.5). さらに細胞外基質は，有機性基質であるコラーゲン線維(あるいは謬原線維 )，その他の多糖類(Polysaccharide)および非コラーゲン性タンパク(Non-collagenous protein)，無機成分のハイドロキシアパタイト(Hydroxyapatite)からできている(図卜6).

骨芽細胞は骨基質形成や石灰化に直接関与する細胞で，多分化能を持つ未分化問葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell)に由来すると考えられている. 未分化問葉系幹細胞は骨形成タンパク質(Bone morphogenetic protein， BMP)，レチノイン酸(Retinoic acid)，デキサメ夕、ノン(Dexamethasone)等の働きによって骨芽細胞系細胞への分化の振り分けを受け，前骨芽細胞(Preosteob las t)を経て骨芽細胞となる. 骨芽細胞は分化の段階に応じ

Osteocyte σb nし e ， •• 且咽・・EA

園n帽箇.，EA困・m 園L

Fig.l.3 Optical micrograph of a lamellar bone (Left) and schematic representation of an osteon (Right).

Osteocytic lacuna Extracellular matrix

Bone cana1iculus

Fig.1.5 Schematic representation ofbone cells and matrix.

r Cell components (Osteoblast， Osteocyte， Osteoclast)

Bone

イ

I Collagen f加 í Prot叫lycan

L Extracellular matrix

寸

Ground substance

→

Polysaccharide

L Hydroxyapatite ^LOther non-collagenous proteins Fig.l.4 Optical micrograph of a廿abecular bone (Left) and schematic representation

of a packet (Right). Fig.l.6 Component substances ofbone tissue.

- 4 - - 5 -

(9)

て， 1型コラーゲン(Type 1 collagen)，オステオポンチン(Osteopontin)，骨シアロタンパク質(Bone sialoprotein， BSP)，オステオネクチン(Osteonectin)，デコリン(Decorin)，バイグリカン(Biglycan) 等の骨基質タンパク質やTGF-ß(Transforming growth factor-ß)，

IGF-I ， -II(Insuhn-like growth factor-I， -II)， FGF(Fibroblast growth factor)， BMP 等のサイトカインを合成・分泌する. これらの合成は，骨芽細胞の分化段階やホルモン等の液性因子によって調節されている. さらに骨芽細胞は，骨基質の石灰化に関しでも重要な働きを担っている. つまり，分化によって細胞極性が明瞭になった骨芽細胞は，基質タンパク質を産生して未石灰化骨(類骨(Osteoid))を形成しながら，同時に骨基質側へ基質小胞(Matrix vesicle)を分泌する. 基質小胞内ではリン酸とカルシウムが濃縮してハイドロキシアパタイト結晶が形成される. 石灰化球となった結晶が基質小胞の膜を壊して小胞外へ出ると，近接して局在するコラーゲ、ン細線維(Collagen filament)へ石灰化が波及し，連続した石灰化基質が形成されるようになる. これを基質小胞性石灰

化と呼ぶ. 以後，骨芽細胞による添加的な骨基質形成と石灰化前線での石灰化が続いていく. 骨形成を盛んに行っている骨芽細胞は方形あるいは球形状であり，血管側細胞膜における強いアルカリホスファターゼ(Alkaline phosphatase)活性の局在，発達したゴルジ体(Golgi body) や粗面小胞体(Rough-surfaced endoplasmic reticulum) の存在で特徴づけられる. 一方，骨基質形成を終えた骨芽細胞は次第に肩平化し，休止期骨芽細胞(Bone lining cell)となって骨表面を被覆する. あるいは，骨基質中に埋め込まれて骨細胞となる.

骨細胞は，骨芽細胞が自ら分泌した骨基質中に埋め込まれたもので，骨中に骨小腔を形成してこの中に存在する(図1.5). 形態学的に形成型骨細胞，吸収型骨細胞，変性型骨細胞の3種類に分けられている.多数の細い細胞質突起を基質中に伸ばし，ギャップ結合を介して骨細胞同士あるいは骨表面の骨芽細胞と連結した細胞性ネットワークを形成する. 細胞質突起の中にはアクチン(Actin) の微細線維が局在しており，突起の収縮や物質輸送細胞内シグナル伝達に関与していると思われている. 骨細胞は，力学的負荷によって骨基質の変形が生じた際の骨小管内の液流や静水圧等を検知可能な位置に存在しており，細胞質突起による三次元ネットワークによってこのシグナルを他の細胞に伝達し得る構造を有している. さらに三次元ネットワークは，それ自体の変形をひずみとして検知するのにも好都合な構造である. このようなことから，骨細胞は機械的刺激の受容伝達細胞であると見なされている. 一方，基質に埋め込まれた骨細胞が再び破骨細胞によって掘り出されること骨吸収の最中に破骨細胞に取り込まれて変性・消化される場合があること，骨細胞と破骨細胞の聞に細胞膜の裏打ち構造を介した細胞間接着構造が観察されることなどから，骨細胞と破骨細胞の問にはなんらかの情報伝達があると考えられている. さらに，骨細胞は，骨芽細胞とともに骨細胞性骨溶解(Osteocytíc osteolysis) と呼ばれる骨溶出を行うことが指摘される(Rao

et al. 1981)なと骨基質の支持や機械的刺激の受容伝達細胞としての機能だけでなく，

骨吸収の調節機構にも関与するとして注目されている.

破骨細胞は， 2 ""数十個の，時には100個以上の核を有する多核の巨細胞で，石灰化した骨基質の破壊・吸収を担う. 破骨細胞は造血幹細胞(Hematopoietic stem cell) に由来すると考えられている.この幹細胞が頼粒球・マクロファージ系の芽球(Granulocyte

macrophage colony-forming unit， GM-CFU)を経て破骨細胞前駆細胞(Osteoclast progenitor) に分化した後，前破骨細胞(PreosteocIast)へと分化して類骨層を持たない石灰化基質表面に定着し，さらに多核化されて形成されると言われている. この破骨細胞への分化

には，骨芽細胞/間質細胞(Stromal cell) との直接接触が必須であることが最近明らかになった(Jimi et al. 1996b)・骨芽細胞/間質細胞は，活性型ビタミンD3( 1，25 dihydoroxy

vitamin D， 1，25(OHhD3)，副甲状腺ホルモン(Parathyroid horrnone， PTH)，プロスタグランジンE2(Prostaglandin E2)， IL-ll (Interleukin-ll)等の骨吸収因子の刺激によって細胞膜表面に破骨細胞分化因子(Osteoclast differentiation factor， ODF，あるいは， TNF-related activation-induced cytokine(TRANC E)， Receptor activator of NF-KB ligand( RANKL)，

Osteoprotegerin lígand(OPGL)，以下孔生NKL)を発現する. 一方，破骨細胞前駆細胞は細胞膜表面に膜レセプタRANK(Receptor activator of NF-KB)を発現しており，これは RANKL受容体である(Anderson et al. 1997; Wong et al. 1997; Yasuda et al. 1998). つまり，破骨細胞前駆細胞のRANKは，骨芽細胞/間質細胞との直接接触によってRANKL からのシグナルを受け，これによって単核の前破骨細胞へと分化する(図1.7). さらに，

1.1竺但!!È.D�^{1 I PTH}1

! _IL-l1 RANK

γA

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+ーー Activated osteoclast

Fig.l.7 Osteoclastogenesis mediated by RANKL-RANK binding.

- 6 - ー7 -

(10)

単核前破骨細胞の融合にも RANKL-RANKによる分化制御機構が関与していると言われている. 破骨細胞の分化・活性化の促進あるいは抑制には，このような骨芽細胞/

間質細胞との直接接触の他に，カルシトニン(Calcitonin)，マクロファージコロニー刺激因子(Macrophage colony stimulating factor， M-CSF)， INF-'Y(Inte巾ron-y)， TNF-ß(Tumor necrosis factor-ß)， IL-6， IL-ll等の体液性ホルモンおよびサイトカインが直接的あるいは間接的に関与している. 分化した破骨細胞は偽足様の細胞突起を出した複雑な外形をしており(図1.8)，明瞭な細胞極性を示す. 細胞質には強い酸ホスファターゼ(Acid

phosphatase， ACP)，酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(Tartrate-resistant acid phosphatase，

TRAP)活性が認められる.破骨細胞ではアクチン，タリン(Talin)，ピンクリン(Vinculin) 等の細胞骨格と連鎖したインテグリン

(Integrin)等のアンカータンパク質が，細胞膜を通って細胞外へ伸び、ている. 骨吸収を ^l骨行うとき，このインテグリンは，骨基質中のオステオポンチン，フィブロネクチン等の RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid) 配列を介して骨基質と強く接着する. 骨吸収は，アクチン線維の発達した明帯(Clear zone)で骨表面を取り囲み，その内部に複雑な細胞質突起よりなる波状縁 ( R u f f l e d

border) を形成して行われる(図1.9). 破骨細胞に吸収されつつある骨表面は不規則に

⑮

⑮ ⑮

Fig.l.8 Optical micrograph of an osteoclast with TRAP staining.

ø

Fig.l.9 Schematic diagram of osteoc1astic bone reso中tion， ion transport， and cell adhesion.

- 8 -

へこんでおり，これはハウシップ禽(Howship lacuna)と呼ばれる. 波状縁の細胞膜には wの輸送に関与する液胞型 H+/K七ATPaseが局在しており，このプロトンポンプによって分泌されるwは波状縁下のハウシップ寵内を pH4'"'-' 5程度の酸性に保っている. 骨の無機成分は，この酸によって溶解される. 一方，有機基質の分解には，破骨細胞によって分泌されるリソソーム酵素(Lysosomal enzyme)が関与している. 中でもシステインプロテアーゼ(Cysteine protease) のひとつであるカテプシンK(CathepsinK )は，コラーゲンを酸性下において小断片に分解することができるとして注目されている. 酸や酵素によって破壊された骨基質は，エンドサイトーシス(Endocytosis)によって破骨細胞内に取り込まれ，トランスサイトーシス(Transcytosis)という形で小胞輸送されて細胞外へ放出される(Hal1een et al. 1999; 2000)・

骨の有機性基質のひとつであるコラーゲンは骨芽細胞や線維芽細胞によってプロコラーゲン(Procollagen)として合成される. 末端のテロペプチド(Telopeptide)が細胞外で切断され，トロポコラーゲン(Tropocollagen)となり，凝集・架橋形成によってコラーゲン線維となる. トロポコラーゲンは，3本のらせんα-ペプチド鎖から構成されている直径1.5nm，長さ30nmの棒状タンパク質である. 電子顕微鏡レベルでは直径50 '"'-'

1 00nmのコラーゲン細線維(Collagen filament)が観察される. ここでは，トロポコラーゲンが線維方向にずれて配列するために生じる周期的横縞(周期67nm)が認められる.

細線維は架橋されて集まり，光学顕微鏡で観察される直径2�lOμm程度のコラーゲン原線維(Collagen fibril) となる. さらにこれらは太いコラーゲン線維 (Collagen fiber) となるが，骨組織においては無定形質や無機質で覆われているために線維形態を観察できない. コラーゲンは骨の有機成分の約90%を占め，その大部分は皮膚や健と同じ遺伝子によって作られる I型コラーゲンである. しかしながら軟組織のコラーゲンと違った翻訳後修飾を受けるため，硬組織のコラーゲン線維は分子間架橋の種類や方向性が軟組織のものとは異なっている. このコラーゲンは，無機塩であるリン酸カルシウム，炭酸カルシウム，リン酸マグネシウムなどの沈着の場として働く. 幼若な骨基質のコラーゲン線維は比較的に疎で，不規則に交叉して配向している. このような骨は叢状骨(Woven bone)あるいは繊維性骨(Fibrous bone)と呼ばれ，ヒトでは主に骨の発生の途中にだけ現れる. 一方，成熟した骨のコラーゲン線維は高度に組織化された配列を示し，密である. 層板骨のハパース系では，コラーゲン線維は長軸に対して斜めの傾きをなして走行し，しかも隣接する骨層板では線維の方向が交差している(図 1.2). このような構造によって，骨は，引張り，圧縮，ねじり等の複雑な荷重に対して高い機械的強度を示すことができる.

骨有機成分の残りの約10%は，糖タンパク等の非コラーゲン性タンパク質で占められている. オステオカルシン，オステオネクチンオステオポンチン，骨シアロタンパク質等のタンパク質やTGF-ß， BMP等の増殖因子が含まれている. さらに，グリコ

- 9 -

ーヨ

(11)

サミノグリカン(Glycosaminoglycan)糖鎖の共有結合からなるデコリン，パイグリカン等のプロテオグリカン(Proteoglycan)が存在する.これらのタンパク質は単に構造タンパク質として骨基質を支持するのみならず先述のようにサイトカインと呼ばれる生理活性物質として細胞の分化・機能調節や骨リモデリング等に関係しており，骨動態、

に対して非常に重要な働きを担っている.

骨形成の過程においてはじめに形成されるのは，上述のコラーゲン線維および非コラーゲンタンパク質等からなる有機基質つまり類骨である. これにリン酸カルシウムが沈着して石灰化骨が形成される. 骨の無機成分であるリン酸とカルシウムは，石灰化を通してハイドロキシアパタイト(Cal0(P04)6(OH)2)と呼ばれる複雑かつ微細な結晶構造をとって骨に貯蔵される.結晶の大きさは20nm X 3"-' 7nmと小さく，これに対して重量あたりの表面積(比表面積 )は非常に大きい. アパタイト構造は，原子配置にゆとりがあるために元素置換を生じやすい. このため， Mg2+， Na+， C O/-， H Pol-等の異種イオンを置換し，同時に多くの格子欠陥を含んでいる. このような大きな比表面積および格子内組成の不均一性は，アパタイトの反応性を高めている. 骨組織を構成するアパタイトは単なる結晶構造物ではなく，生理的に，あるいは病的過程によって強い影響を受けながら組成や物性を変化させている.

4ρM脱I凶ymal討em cell

F ig.l.12 Linkage of cell functions in bone remodeling.

1.2.3

骨組織のリモデリング機構

大型R甫乳動物の皮質骨や海綿骨では外力に応じて形態を変化させるため，さらに血中Ca2+イオン濃度維持(Calclum homeostasis)のために，破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成とが繰り返されている.生涯を通して行われているこの骨の作り替え，骨の再構成のととを骨リモデリングと呼ぶ. 骨の形態や強度を維持するには骨の吸収と形成とが動的平衡を保つ必要があり，このような機能的共役はカップリング (Coupling)と呼ばれる. 骨粗影症(Osteoporosis)等の骨量減少は，両者のアンカップリング、(UncoupIing)によって発生する.骨リモデリングでは，骨吸収が先行し，吸収された部位に続いて骨形成が起こるという代謝様式をとる. このリモデリングを行っている骨組織と細胞群との最小単位を BMU(Bone multicellular unit)と呼ぶ. 皮質骨ではオステオン(ハパース系)(図l.10)，海綿骨ではパケット(図l.11)がとれに相当する.

Fig.l.10 Schematic representation of haversian remode1ing.

Fig.l.l l Schematic representation of surface remodelíng of trabecula.

方，ある部位では骨吸収のみを生じ，ある部位では骨形成のみを生じて，リモデリングのようには骨吸収から骨形成へのカップリングが起こらない代謝様式がある.これはリモデリングと区別して骨モデリング(Modeling) と呼ばれ，主に成長期に観察される.

BM Uにおける骨リモデリングは，組織学的にいくつかの相に分けて考えることができる(図l.12). 骨吸収や骨形成が行われていない骨表面は，扇平な休止期骨芽細胞によって覆われている(休止相). PTH， 1，25(OHhD3， IL- l 1 等の骨吸収促進因子が作用すると，休止期骨芽細胞は活性化されて方形を呈する(活性化相). これらの骨吸収促進因子の受容体は破骨細胞ではなく骨芽細胞に存在する. 次いで、骨芽細胞から破骨細胞前駆細胞へのシグナル伝達により，破骨細胞の分化・遊走が行われる. 先述したように，この破骨細胞の分化や活性化には，骨芽細胞と破骨細胞前駆細胞あるいは前破骨細胞との直接接触を介したRANK.L-RANKによる制御機構が関与している. 骨吸収では，破骨細胞による無機基質の溶解に先立つてまず骨芽細胞が産生・分泌する中性コラゲナーゼによって類骨の分解が行われる. この中性コラゲナーゼの産生を促進させるPTH やプロスタグランジンによって，同時に骨芽細胞は形態変化させられ，

骨表面には細胞に覆われていない部分が生じる. つまり，骨吸収を行う場が作り出される. 次いで，破骨細胞による骨基質の吸収が始まる(吸収相). 骨吸収機能の調節にも先のRANKL-RANKによる制御機構が関与しており，骨吸収活性を冗進させるとい

ハU4EE--

-11 -

(12)

う知見が得られている. 同様に， IL-lは破骨細胞に存在するレセフタによって受容され，アポトーシス (Apoptosis)の抑制や骨吸収の活性化に作用する. 反対に，破骨細胞の分化とともに発現するカルシトニンレセプタによって全身性のホルモンであるカルシトニンが受容されると，骨吸収は強力に抑制される. このように，破骨細胞の分化・

活性化の促進あるいは抑制には，骨芽細胞/間質細胞との直接接触の他に，ホルモンおよびサイトカインが直接的あるいは間接的に関与している. 骨吸収の停止に関しては，破骨細胞内の細胞骨格タンパク質の解離や破骨細胞のアポトーシス等が原因であるとする仮説があるが知見は非常に少ない. 骨細胞の細胞質突起との接触によって破骨細胞の収縮やアポトーシスが起こること，破骨細胞近傍に存在する骨細胞は破骨細胞の運動能に大きな影響を与えることから骨吸収によって露呈した骨細胞が骨吸収停止に関与しているという指摘もある. 骨吸収停止後，単核マクロファージ (Mono

nuc1ear phagocyte)が出現する時期(逆転相)を経て，骨吸収部位では前骨芽細胞が増殖する. 前骨芽細胞の遊走や分化には，骨吸収によって基質から放出されたり，骨吸収部位に露呈させられたりしたTGF-ß， IGF-I， -II， BMP等の因子が関与していると言われている. TGF-ß， IGF-I， -IIは，骨形成が行われたときに骨芽細胞によって分泌されたもので，骨基質中ではいくつかのタンパク質と結合した不活性型で存在する. 骨吸収によって結合タンパク質から切り離されるとこれらは活性化して骨芽細胞に作用する. TGF-ß は前骨芽細胞や骨芽細胞の増殖，オステオポンチンやオステオカルシンの産生促進に作用し，IGFは骨芽細胞の増殖やコラーゲン合成を促進する.TGF-ßスーパーファミリーであるBMPについては多くの遺伝子がクローニングされているが，この中でBMP-2は未分化問葉系細胞から骨芽細胞への分化決定に関与していると言われている. このようにして分化した骨芽細胞は類骨形成と石灰化を行う(形成相). 骨形成が完了すると，骨表面は再び肩平な休止期骨芽細胞に覆われて休止相に入る.

以上のように，骨リモデリングは多くの細胞ホルモン，サイトカインが関与する非常に複雑な現象である. さらに通常のリモデリングでは骨吸収量と骨形成量はほぼ等しく，吸収と形成の巧妙なカップリングによって骨量の維持が行われている. このカップリングのためには，破骨細胞と骨芽細胞との間の情報伝達が不可欠であると考えられる. 先にも述べたが，骨吸収に関しては， PTH， 1，25(OH)2D3' IL・11等の骨吸収促進因子の受容体が骨芽細胞に存在しておりこれらの因子の作用によって骨芽細胞に発現したRANKL が破骨細胞系細胞のRANKで受容されて情報伝達が行われるということが明らかになった. 一方，骨形成に関しては，骨芽細胞によって産生され骨基質中に埋め込まれていたTGF-ß や IGF が，骨吸収によって活性化されて骨芽細胞に作用するというメカニズムが考えられている . 骨芽細胞は，いったん基質中に蓄積されるサイトカインの他に，分泌後に遊離して自らの活性を調節するオートクライン (Autocrine，自己分泌 )・パラクライン (Paracrine，傍分泌)因子を多く産生する. 先の

ー12 ^-

IGF-Iはオートクライン・パラクライン因子としても作用する. 脂肪酸誘導体であるプロスタグランジン E2は骨芽細胞によって産生され，骨芽細胞の増殖・分化のいずれに対しても促進と抑制の二相性の作用を示す. さらに，パラクライン的作用によって破骨細胞の形成を直接抑制する一方，間接的に破骨細胞の形成を促進することになる間質細胞に対して作用することによってRANKLを発現させることが指摘されている.このようにオートクライン・パラクライン的に作用するフロスタグランジンは，リモデリングに大きく関与するシグナル伝達系として注目されている.

ホルモンやサイトカイン等の液性因子に加えて細胞聞の接着や細胞-基質問の接着が骨系細胞の機能調節に大きく作用している. 骨芽細胞系細胞同士の接着装置にはアドヘレンス結合 (Adherens junction)とギャップ結合 (Gap junction)，タイト結合 (Focal tight junction)が同定されている (図1.13)・いずれも単に力学的な結合にとどまらず細胞間情報伝達をも担っていると考えられており特にギャッフ。結合はCa2+等のイオンや低分子量物質を透過させることが可能である. 骨芽細胞ー基質問の接着には，基質中コラーゲンの D GEA(Aspartic acid- Glycine-Gluta mic acid-Arginine)配列，フィブロネクチンやオステオポンチン等のRGD(Arginine-G lycine-Aspartic acid)配列を介したインテグリン (Integrin)による強固な接着とヘパラン硫酸フロテオグリカン (Heparan sulfate proteoglycan， HSPG)を介した電荷による弱い接着がある. 接着部位の細胞内ドメイ/

は細胞骨格へ連結しているため，接着のシグナルは細胞骨格へ伝達されて，細胞分化や機能発現に対して重要な役割を果たすと思われる. 一方，破骨細胞が多核化される際の破骨細胞同士の認識については，細胞膜癒合に関する膜タンパク質の関与が指摘されているが明らかではない. 破骨細胞.基質問では，明帯の細胞膜を通って細胞外へ伸びているインテグリンが，基質中のオステオポンチン，フィブロネクチン等の RGD( Argini ne-G lycine-Aspar-

tic acid)配列を介して基質と接着している(図1.14). さらに，破骨細胞において形態学的に認められる指状突起部では， 1型コラーゲンやフィブロネクチン等のリガンドを有する接着因子CD44 が局在することが知られている. これが CD44 - モエシンーアクチンフィラメント機構を形作り，細胞骨格や細胞極性の形成に対して作用

Preosteo blast

Fig.l.13 Cell-cel1 and cel1-matrix adhesions of osteoblast

like cells.

ー13^-

「ーー竺 ^{ーーーーーーーーー} ーーーーーーーーーーーー

(13)

しているのではないかと指摘されている. 骨芽細胞系細胞と破骨細胞系細胞の細胞間相互作用では， RANKL-RANKによる制御機構の他に細胞膜の接着分子と細胞間に存在する細胞外基質を介した接着機構が考えられている(図1.15)・この機構では，細胞同土が異なる接着分子を発現していてもリガンドとなる細胞外基質が共通していれば異種細胞聞の接着が可能となる. ヘパラン硫酸プロテオグリカンは，フィブロネクチン等の接着タンパク質やFGF等のサイトカインを保持することによって破骨細胞系細胞ー骨芽細胞系細胞聞の相互作用を可能にすると指摘されている.

骨リモデリングでは，ホルモンやサイトカイン細胞間の相互作用によって細胞分化・機能の促進あるいは抑制を受け，骨吸収および骨形成が調節されている. しかしながら，長期臥床や微小重力下での生活は骨量を減少させることから，正常な骨リモ

@

⑮

⑫

⑮

⑮ @

Fig.L14 Cell-ma仕ix adhesions of osteoclast

Osteoclast

轡信審

⑮ 争

⑮ 健診 @

Fig.l.15 Osteoclast-osteoblast interactions through HSPG.

- 14 -

デリングには，これらに加えて機械的刺激の受容が不可欠なのは明らかである. 先に述べたように，骨細胞が基質内に形成する細胞質突起の三次元ネットワークは，基質の変形，骨小腔内の液流，静水圧等を感知するのに合理的な構造と見なされている.一方，骨芽細胞系細胞や破骨細胞系細胞は，細胞膜を通って細胞外へ伸び、ているインテグリンを介して骨基質と強固に接着している. つまり基質の変形はインテグリンによって細胞骨格に伝達され，細胞骨格の再構築を惹起させるシグナルとなり得る. さらに，基質の変形や細胞外液(Extracellular fluid)の液流によって，細胞のイオンチャネル(Ion channel)が開閉して細胞機能を変化させるとも言われている. 機械的刺激の受容は，細胞の増殖・分化，タンパク質や液性因子の産生・分泌に変化をもたらし，結果として骨リモデリングに影響を与えていることが考えられる. しかしながら，脅がいかなる種類の機械的刺激をどのように受容して骨リモデリングに反映させるのか，

そのメカニズムについては明らかになっていない.

機械的刺激による骨形態や骨量の変化，機械的刺激が組織や細胞に受容伝達される分子機構等を解明するために，動物を用いたzn νiνo実験や培養細胞を用いたin vitro実験が行われてきた. 以降に，これまでに行われた研究について概説する.

1.2.4

機械的刺激に対する骨組織の適応に関する従来の研究

骨の構造を力学的な視点から考察したのは，スイスの Culmannであると言われている. 19世紀の半ば， Culmannは，解剖学者Von Meyerが描いたヒト大腿骨海綿骨のスケッチを見て，骨頭部分の骨梁構造が主応力の作用方向によって形状が決まる Culmann 's craneと呼ばれるクレーンの構造と類似していることに気付いた. この CulmannとVon Meyerの研究によって，海綿骨骨梁の構造は，大腿骨が荷重を受けたときに生じる主応力の作用方向(Trajectory) と一致しているということが指摘された (Cu]mann 1866; Meyer 1867). 一方， Wolffは，膨大な臨床例をもとにして，外傷，疾病，生活パターンの変化等によって骨の機械的ストレス環境が変化した場合，新しい環境に合わせて骨梁構造も再構築されるという骨の変形法則を提案した (Wolff 1870;

1986). これは，骨の機能が変化すれば形態もそれに応じて変化するという経験則であり，ウルフの法則(Wol百's law)と呼ばれている. さらに， Rouxは，生体が外力に対して機能的に適応する(Functional adaptation)という概念を一般化するとともに，生体が最大の効果を最小の材料やエネルギで達成するという最大-最小の法則 (Maximum

minimum law)を提案した(Roux1885)・この仮説によれば，骨では最大の強度を最少の材料で実現しているということになる. しかしながら Wolffや Rouxの仮説を証明するための実験方法や装置がその時代になかったために，さらにこれらの仮説が一見して非常に妥当であるように捉えられたため，およそ100年にもわたって再検証が行わ

- 15 -

ーーーョ

(14)

れることがなかった. 1950年代になってようやく，光弾性モデルを利用した実験を行ったPauwelsによって骨梁の配向と主応力の作用方向との関係に再検討が加えられた(Pauwe]s 1954; 1980).

機械的ストレス環境と骨構造との関係についての研究は，以上のように骨の構造を力学的に解釈することから始まった. Pauwels以降，現在までこのような研究は続けられており，最近では，マイク口C T等の非侵襲計測機器で骨梁の三次元構造を計測し，

これをもとにした三次元応力解析からウルフの法則の検証が行われるまでになった (Van Ríetbergen et a1. 1999)・その一方で，動物モデルを用いることによって生体骨の機械的ストレス環境に対して積極的な変化を与え，このときの骨の応答を調査するという研究アプローチもとられている . このようなm νivo実験系による研究では，歯列矯

正力を与えたときの歯槽骨の応答(Waldo 1953; Martinez and Johnson 1987)(図1.16)，

運動や過負荷(Overload)の影響(Shaw et a1. 1987; Jee et al. 1991; Bourrin et a1. 1992;

Yeh et al. 1993)，神経切断や固定によって作り出された廃用(Disuse)の影響(Li and

Jee 1991; Bagi et a1. 1993; Chow et a1. 1996) を調べることが多かった. これは，生体骨に対して外部から定量的な機械的刺激を与えることが困難であったという理由による . 例えば， Jee et a1.(1991)は，ラット右後肢をゴムバンドで不動化 (Immobilization)することによって左後肢に対して過負荷を与えるような動物モデルを作製し，負荷の増大による骨外径の拡大促進，骨髄腔径の拡大抑制を報告している . さらにBagi et a1.(1993)は，同様の動物モデルにおいて不動化された後肢を対象とした形態計測を行い，不動によって骨膜面での骨形成速度の減少および骨内膜面での骨減少が生じることを示した. この結果，髄腔の拡大と皮質骨の非薄化が認められた.一方，Mo町re)

佃d Wronski(198 1)はラツト尾部をワイヤ

Fig.l.16 Diagram of tooth movement.

で吊り下げて後肢の免荷を行う尾部懸垂 Fig.l.17 Diagram of rat tail suspension model.

- 16 -

モデル(図1.17)を開発した. この実験系は，宇宙での微小重力環境を地上で模擬する簡便なzn νivoモデ、ルとして利用されている(Simske et a1. 1992; Bourrin et a1. 1995; Zhang et a1. 1995).

その後，生体骨に対して外部から定量的な機械的刺激を与えることが可能な動物モデルがいくつか確立されるにおよび，機械的刺激の大きさ・周期・時間等のパラメータの相違と骨形態変化との関係を検討した研究が行われるようになった. 長管骨骨幹に挿入した2本のピンを介して負荷を行うモデル(Rubin and Lanyon 1984)，皮膚の上から腔骨(Tibia)に対して曲げを与えるモデル(Tumer et a1. 1991)，尺骨(Ulna)の両端を皮膚の上からパッドで挟み軸荷重を与えるモデ、ル(Torrance et a1. 1994; Hil1am and Skerry

1995)，ラット尾椎に挿入した 2本のピンを介して負荷を行うモデル(Chambers et a1.

1 9 9 3 ) ，シリンダを有するデバイスを骨にインプラントして負荷を与えるモデル (Goldstein et a1. 1991)等の動物モデルが開発された.

Rubin and Lanyon(1984)は，鶏(Rooster， Avian)あるいは七面鳥(Turkey)の尺骨を外科的に両骨端で切断し，切断端にステンレススチールキャップをかぶせた後，キャップと骨を貫いてピンを挿入するという動物モデルを開発した(図1.18). 機械的刺激の負荷は，周囲から孤立させられたこの尺骨に

対して行われた.彼らのグループはこのモデルを利用して，機械的刺激の負荷形態・

大きさ・回数・周期・ひずみ分布等のパラメータと骨形成・吸収との関係について多

くの調査を行った(Rubin and Lanyon 1987)・ Fig.l.18 Diagram of mechanical loading to 例えば， 525N( 皮質骨表面ピークひずみ ulna shaft.

2000μE)の圧縮荷重を， 100cycles/day， 1Hz

の動荷重，あるいは静荷重として 8週間負荷したとき，動荷重と静荷重の影響の差異について検討した. 無負荷では皮質骨内膜側での骨吸収および皮質骨内部の空孔の増加を，静荷重では廃用時に見られるような皮質骨内径の拡大および皮質骨内部の空孔の増加というリモデリングを，動荷重では骨膜表面での骨形成をそれぞれ報告した (Lanyon and Rubin 1984). この結果，静荷重は骨形成を誘導する刺激(Osteoregulatory stimulus)として認識はされないということを指摘した. さらに，刺激回数の影響に関する実験(Rubin and Lanyon 1984)では，生理的な活動時に見られるひずみ量 2050μεを生じさせる負荷では，わずか 4cyclesの刺激で骨量が維持され， 36cyclesの刺激では新生骨形成が増加した. この反応は 360， 1800cyclesと回数を増しでも同程度であることを報告した. 同時に，ひずみの大きさの影響について調べるために行われた100cycles/

dayの一定回数負荷実験(Rubin and Lanyon 1985)では， 1000μεを生じる荷重によって骨断面積が維持され，1000"""'4000μの範囲ではひず、み量に正比例した断面積増加を生

ー17 ^-

(15)

じることを示した. とれらの研究の中で，皮質骨骨膜面に観察された新生骨はwoven boneであった. 一般に，woven boneは骨折治癒過程や炎症部位に認められる骨である.

そこで，この新生骨が病的に形成されたものなのかあるいはモデリング，リモデリング過程の一段階として形成されたものなのかを検討するために，2000μ，100cycles/day の機械的刺激を16週間にわたって負荷する実験が行われた(Rubin et a1. 1995). この結果，woven boneは機械的ストレス環境の急変に対する適応現象として生じたものであること，一旦適応が完了すれば成熟した lamellar boneにリモデリングされていくことを示した.

Rubinらの動物モデルは観血的な外科処置を施しており，出血の影響や観察対象骨そのものにピンを挿入する影響など機械的刺激以外の因子を含むことが避けられない.

さらに，骨幹を切断して周囲から骨を孤立させるという方法を採用しているために，

このモデルによって正常(Intact)な生体内で、の骨動態を再現することができているのかどうか疑問が残る.

この一方で，外科処置を全く施さず骨に対して非観血的に機械的刺激を与える動物モデルが提案された. Turner et a1.(19 9 1)は，ラット腔骨に対して皮膚の上からパッドを押し当て四点曲げを与える動物モデルを開発した(図1.19)・彼らは刺激回数を変化させて37N， 2Hzの曲げ負荷を与えたとき，刺

激に対する適応現象として，高ひずみ部位においてwoven boneの形成が認められることを指摘した.このとき腔骨表面に生じる最大ひずみは，骨断面形状をもとに純粋曲げを仮定した計算を行って， 1000-- 3000μと見積もられた. さらに， 27 "-' 64Nの範囲で荷重を変化させて

emur

36cycles/day， 2Hzの曲げを負荷する実験から， Fig.l.19 Diagram of four-point bending 骨膜側ではwoven boneが支配的に形成されて for rat tibia.

おり，その形成量はひずみの大きさに無関係で

あること，骨内膜側では 1050με以上のひず、みにさらされた部位で lamellar boneが形成され，その形成速度はひずみ量に正比例することを報告した(Turner et a1. 1994; Forwood

and Turner 1995). とれらの研究によれば， woven boneの形成は一旦関値を超えると最大限にまで誘導される応答(All-or-nothing response) であり， lamellar boneの形成はひずみ量 1050μ を閥値として発動される.

同様に外科処置を全く施さないモデルとして，手根骨(Ca中us) と肘頭(Olecranon)聞をパッドで挟み，軟部組織の上からラット尺骨に軸圧縮荷重を与えるモデルが開発された(To汀如ce et a1. 1994; Hillam and Skerry 1995)(図1.20). Hillam and Skeπy( 1995) は，

若齢ラットの尺骨に 4000 -- 4500με のひずみを生じさせる機械的刺激を負荷し，若齢

ー18^-

ラットでは尺骨骨内膜面の骨吸収によって成熟ラットの骨形状へのモデ、リングが行われなければならないが，この負荷によって正常な骨吸収が妨げられ骨形成が観察されたと報告した. さらに， Mosley et a1.(1997) は，骨表面に与えるひずみ量を 500"-'4000μ の範囲で変化させ， 1200cycles/day， 2Hzの

Carpus

Humerus Radius

Ulna Soft pad

Fig.l. 20 Diagram ofaxial loading to ulna.

機械的刺激を成長期のラットに対して与える実験を行った. その結果， 2000με程度の生理的ひずみ範囲の刺激を与えたときは骨形成の減少によって生理的ひずみよりも大きな4000μの刺激で、は新生骨形成を増加させることによって，成長期の尺骨の形態が形成されることを指摘した.

皮膚の上から非観血的に機械的刺激を与えることが可能なこれらのモデルはいずれも外科処置を一切必要としない. さらに荷重負荷時以外の日常活動を妨げることがないために，骨の応答は機械的刺激のみによって誘導されたものと考えることが可能である. しかしながら，これらの動物モデルではひずみ量と負荷荷重との関係は，骨形態観察を行う個体とは別の個体においてひずみゲージを用いて予め計測しておくという方法，あるいは機械的刺激負荷後の個体の骨断面形状をもとにして梁の曲げ問題として計算するという方法によって求められている. このために，個体によって違いが大きい軟部組織を介しての間接的な負荷では，予め計測あるいは計算されたひずみ量と実際に骨表面に発生するひずみ量との聞に大きな差が生じる.これらの理由から，

骨のひずみ量と骨の応答とを定量的に結びつけるには困難が伴う.

上記の3タイプの動物モデルを用いた研究ではその対象が皮質骨形態の力学応答に限られる. 一方，三次元的な網目構造を有する海綿骨は非常に活発な骨代謝回転を示し，はじめて Culmannが指摘したように外部からの力に対して合理的な形態をなしている. 荷重支持や衝撃的荷重の分散等の重要な力学的機能を担っていると考えられており，海綿骨の骨梁構造と機械的ストレス環境との関係については非常に興味が持たれている. 海綿骨に対して機械的刺激を与えることが可能な実験系のひとつに，

Chambers et a1.(1993)によって開発されたラットの尾椎(Caudal vertebra) を用いた動物モデルがある(図1.21). 観察対象とする第8尾椎の両隣の椎体に 2本のステンレス鋼製ピンを挿入して機械的刺激を負荷するモデルである. 彼らは，このモデルにおいて大きさ・回

数等の条件を変化させた圧縮荷重を負荷し， Fig.l. 21 Diagram of mechanical loading to 骨動態を定量した(Chow et a1. 1993).例えば， rat caudal vertebra.

- 19 -

(16)

150N( 皮質骨表面ピークひずみ750μE)，

3 '""-' 300cycles の負荷を1度行った場合，

刺激回数と骨形成量との聞に高い相闘が認められた. 荷重の大きさを変化させた実験群においては， 15N， 50Nの負荷と比較して150N負荷での骨形成量の

C二コ

Fig.l.22 Diagram of asymmetrical compressive 激増を報告した. 形態計測から明らか loading to rat caudal vertebra. ^{O '}^{_ ._}^- ^-^--0

になった骨形成量の増加は，石灰化速度の増加よりもむしろ骨形成が行われている骨表面積の増加によるものであるとの考察から機械的刺激が骨芽細胞のリクルートメント(Recruitment) を

促進するように作用すると指摘した.

さらにMente et al.(1999)は，このラット尾椎を用いた動物モデルを応用し，尾椎体を轡曲させるような静荷重をピン

に与えることによって尾椎の機械的ス Fig.l.23 Diagram of compressive loading to the トレス環境を変化させる研究を行った( trabecular bone of distal femoral metaphysis.

図1.22). この静荷重負荷は尾椎のくび

れ角度を増加させたがその後響曲を逆向きに修正するような静荷重を与えることによって尾椎形態は矯正された. この結果から彼らは機械的刺激の負荷がヒト椎体の変形等を治療する方法としても将来有望であると示唆した.

同様に海綿骨の力学応答を対象として， Goldstein et al.(1991)は，イヌ大腿骨遠位骨幹端を切断して海綿骨を露出させ，ここに水圧で駆動可能なシリンダをインプラントするという動物モデルを開発した(図1.23)・海綿骨と接触する部分は形状を違えた多孔質のプレートでこのプレートによって定量的な機械的刺激が与えられた. 彼らはこの動物モデルを利用して，プレートに向かつて配向する骨梁が増加すること，骨梁の連結性が減少すること(Goldstein et al. 1991)，骨梁の形態変化がプレートの形状に依存すること(Guldberg et al. 1997) 等の知見を報告している.

以上の多くの研究では，骨リモデリングに関与する機械的刺激パラメータの検討，

つまり，機械的刺激の負荷形態応力やひずみの大きさ・変化速度・分布・履歴，刺激の回数，ひずみエネルギ密度等の因子の中で，いずれが骨形成・骨吸収を促進させる信号として作用するのかについて検討が行われてきた. その結果，機械的刺激として重要なのは骨組織のひずみ( 変形) であること(Lanyon 1984; Frost 1987; Sun et al.

1995)， 1000 '" 2000μ程度のひず、み量が骨形成と骨吸収の応答を分ける関値であるこ

- 20-

と(Rubin and Lanyon 1985; Turner et al. 1994) が指摘されている. しかしながら，組織レベルのひずみが細胞レベルでどのように受容されるのかについては未だ明白でなく，多くのメカニズムが提案されている(第1.2.5項参照). さらに，骨形成と骨吸収の関値となるひずみ量は，皮質骨表面に生じるひずみで代表した値であり，皮質骨内や骨梁表面での力学状態、までは考慮されていない.骨膜表面での骨代謝様式と皮質骨内(ハパース系) あるいは骨梁表面での骨代謝様式の差違についても検討されなければならない.

成熟した骨組織の力学応答研究に加えて，最近

Tibia

Fig. 1.24 Diagram of compressive loading to the tissue entering through the ingrowth holes.

では，未分化問葉組織(Undifferentiated mesenchymal tissue)に対して機械的刺激を与え，

刺激と組織分化の関係をin νivo実験系で検討する研究も行われている. Tägil and Aspenberg( 1999)は，骨を誘導するための開口部を有した骨誘導チェンバーをラット腔骨近位骨幹端にインフラントし，中に誘導された組織にピストンで圧縮負荷を与える実験系を開発した(図1.24). 4N の荷重を3秒負荷， 3秒除荷， 40cycles/day の条件で 7 週間与えたとき，ピストン下に軟骨組織層その下方に軟骨下骨層が認められた. 骨格形成期の未分化問葉組織や骨折治癒過程で現れる仮骨(Callus)は機械的ストレス環境に応じて異なる組織へと分化すると言われている(Carter et al. 1988; 1998; Wong and Carter 1990; Claes and Heigele 1999). 例えば， Carter et al.( 1988) は，応力が比較的小さいときには骨組織へ，高いせん断応力下では線維様組織へ，高い静水圧下では軟骨組織へ分化するというモデルを示している. このような検討は，生体由来の細胞から組織や臓器を再生する生体組織工学(Tissue engineering)を視野に入れたものであり.今後の研究が期待される.

皮質骨や海綿骨に機械的刺激を負荷した多くの研究では，骨の応答に対して形態学的な評価が行われている. つまり適当な染色を施した薄切切片を作製して光学顕微鏡で組織観察する方法，テトラサイクリン(Tetracycline)，カルセイン(Calcein)等の蛍光マーカーによって骨に二重標識を施し骨動態を計測する方法，軟 X線撮影像によって骨形態を計測する方法等が用いられてきた. 骨の力学応答研究に限らないが，近年では，X線マイクロCT 等の非侵襲計測機器を利用した骨形態計測も有用な方法として利用されている(Feldkamp et al. 1989; ^Kuhnet al. 1990; Goldstein et al. 1991; Odgaad 1997).

一方，形態学的評価にとどまらず， in vivo動物モデルにおいて機械的刺激が受容伝達される分子機構を解明することを目指した研究が盛んである(Le組et al. 1995; Sun et al.

1995; Zhang et al. 1995; J agger et al. 1996). 例えば，ラット尾椎に軸荷重を与える実験

ー21 -

(17)

系では，海綿骨の骨形成部位においてI型コラーゲンやオステオカルシンの mRNA発現を認めるとともに，骨細胞ではIGF-I のm RNA発現が冗進していた(Lean et a1. 1995)・

この結果は，骨細胞が機械的刺激の受容細胞として働き IGF を介した情報伝達を行っていることを示唆するものである. タンパク質の産生や mRNA 発現の変化をin situ hybridization やin s itu RT-PCR(Reverse transcription - Polymerase chain reaction)で評価するこのような研究は，骨組織内部における細胞の応答を明らかにするものである. これまで行われてきた骨形態のマクロな変化および骨組織の力学状態の評価に加えて，

細胞レベルでの応答を関連づけることによって骨組織の力学応答メカニズムに関して新たな知見が得られると期待される.

1.2.5

機械的刺激に対する骨系細胞の応答に関する従来の研究

実験動物の骨に対して機械的刺激を負荷するin vivo実験系を用いた研究が行われる一方，培養細胞を用いた inνitro実験系において，機械的刺激が骨系細胞に受容伝達されるメカニズム，骨系細胞の機能に与える影響を解明しようという研究が盛んである.

現在のところ，骨基質中あるいは骨表面に存在する細胞が生体内でいかなる機械的ストレス環境にさらされるのか明白でないために，多種多様な実験系において様々な条件の機械的刺激が負荷されている. その結果は細胞レベル，分子レベルで詳細に解析され，機械的刺激によって産生・分泌が促進あるいは抑制される分子が多数発見された. 機械的刺激の受容伝達メカニズムについてもそれぞれ多く提案されている.

骨系細胞を用いた実験に限ると，連続的静水圧(Ozawa et a1. 1990; Imamura et a1. 1990伐;

Ru由I巾bin et ^a叫1. 1997)あるいは問欠的静水圧(Ro閃elof:白sen et al 1996; Klein

の付与，細胞あるいは細胞膜の伸張(σYeh and Ro“da如n 1984引;Haおse句ga仰wa et al. 1985; Binderman et a1. 1988; Brighton et a1. 1992刈Tang et a1. 1993; Duncan and Hruska 1994; Harter et a1. 1995;

Mikuni- Takagaki et a1. 1996; Rawlinson et a1. 1996; Zaman et a1. 1997; Yoshikawa et a1. 1997;

Fermor et a1. 1998; Meazzini et al . 1998; Hara et al . 1999; Miyauchi et a1. 2000)，流体によるせん断応力付与(Williams et a1. 1994; Hung et a1. 1996; Sakai et a1. 1998)，高重力(Lange et al . 1994， N emoto et a1. 1999)あるいは微小重力下(Burger and Klein-Nulend 1998; Carmeliet and Bouillon 1999; Hughes-Fulford and Gilbertson 1999; Ingber 1999; Marie et a1. 2000)での培養，磁場(Fitzsirnmons et a1. 1994; 1995; Mcleod and Collazo 2000)，電場(Binderman et al. 1985; Ozawa et a1. 1989; Zhuang et a1. 1997)あるいは超音波(Naruse et a1. 2000) の付与

等が報告されている. 多くの実験では，樹立株が確立されている骨芽細胞様細胞(Os

teoblast- Iike cell)の力学応答を対象としており，細胞増殖，骨基質タンパク質や液性因子の産生等の骨形成に関わる機能を評価している. さらに近年，機械的刺激を受容伝達する細胞(Mechanosensor， Mechanoreceptor)として注目される骨細胞に関する研究が

- 22 -

「国 � . _ -

^-�'::;;;;::;"""，T= ---

盛んに行われるようになった. 一方，骨吸収を担う破骨細胞に関しては未だ樹立株が確立されていないために，骨髄細胞(Marrow cell)の初代培養系や間質細胞との共存培養系を用いた報告が散見されるのみである (lmamura et a1. 1990; Rubin et aI . 1997)・

静水圧負荷を行う実験系では，チェンパー内において培養細胞に対する連続的あるいは間欠的な加圧，

減圧が行われる(図1 .25). 装置が単純であり，空間的に均質な刺激を与えることが容易であるために，

-・・・・・・・・ 0・

... .

細胞の力学応答研究にしばしば利用されてきた. 機 Fig. 1.25 Diagram of hydrostatic 械的刺激の負荷に際して細胞との直接接触がないの pressure applied to cells .

で物質交換が妨げられず，さらに細胞と基質の嬢着

状態によらない負荷が可能であるという利点を有する. 気相を介した負荷ではO2•

CO2の分圧変化によって培養液の組成も変化してしまうため，液相( 培養液)に対して直接圧力を与える方法が用いられることもある. 例えば. Ozawa et a1.( 1990)は，歯科矯正時に圧迫側歯槽骨に生じる圧力と同程度の連続的静水圧を骨芽細胞様細胞MC3T3・

E1 に対して負荷し，アルカリホスファターゼ活性の允進やプロスタグランジンE2産生の増加を報告した. さらに，同じ研究グループの Imamura et a1.(1990)は，同様の連続的静水圧をラット骨髄由来細胞に負荷する実験系において，破骨細胞の分化や骨吸収能の変化を調査した. その結果，静水圧負荷によってプロスタグランジン E2 産生や TRAP陽性細胞の増加が認められた. これらの実験から，静水圧がプロスタグランジン E2産生のメカニズムを介して新しい破骨細胞を誘導し骨吸収を増加させるという仮説を提案した. 一方• Klein-Nulend et al.(1997)は，マウス頭蓋冠(Calvaria)由来の骨細胞および骨芽細胞様細胞MC3T3-Elに対して間欠的静水圧を負荷したとき，オステオポンチン産生の増加を報告した. オステオポンチンはインテグリンを介した細胞接着と深く関わっていることからオステオポンチン産生の増加は細胞接着の増加に対する応答であると推察した.

細胞あるいは細胞膜への伸張負荷の多くは，培養基質を変形させることによって行

われている. フレート状の基質に対して曲げを与えることによる表面の伸張，シリコーンゴム等のフレキシブルな基質に張力を与えることによる伸張が代表的な手法である. 前者の手法に関しては，プラスチック等の基質を三点曲げあるいは四点曲げする方法が一般的である(Owan et a1. 1997; Zaman et al . 1997)(図1 .26). Owan et a1.( 1997) は，プラスチック基質を四点曲げしたとき，骨芽細胞様細胞MC3T3-E1 におけるオステオポンチンmR1ぜA発現の変化を調査した. このような基質の曲げでは，培養液との相対運動によって細胞には流体せん断が生じる. 彼らは基質の厚みを変えることに

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機械的刺激に対する骨および骨系細胞の応答に関す る実験的研究

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

機械的刺激に対する骨および骨系細胞の応答に関す る実験的研究

蔵田, 耕作

https://doi.org/10.11501/3180274

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機械的刺激に対する

骨および骨系細胞の応答に関する 実験的研究

平成12年12月

蔵田 耕作

目次

第1章 緒論

はじめに

研究背景

生体骨組織の構造

と呼ばれる. 骨幹端は骨端と骨幹

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生体骨組織の構成成分

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骨組織のリモデリング機構

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機械的刺激に対する骨組織の適応に関する従来の研究

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機械的刺激に対する骨系細胞の応答に関する従来の研究

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細胞あるいは細胞膜への伸張負荷の多くは，培養基質を変形させることによって行

機械的刺激に対する骨および骨系細胞の応答に関する実験的研究

機械的刺激に対する骨および骨系細胞の応答に関する実験的研究

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骨および骨系細胞の応答に関する実験的研究

蔵田耕作

第1章緒論

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