Replica Printing for Concentric Ring-like Colonies of Bacillus subtilis (Mathematical Aspects of Complex Fluids II)

Replica

Printing

for

Concentric

$\mathrm{R}\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{g}^{-1}\mathrm{i}\mathrm{k}\mathrm{e}$

Colonies

of

Bacillus subtilis

島田 群群, 脇田 順–, 伊藤 裕人, 渡辺 -彦, 松山 東平1,

松下 貢

(H.Shimada, J.Wakita, H.Ito, K.Watanabe,

T.Matsuyamal

, M.Matsushita)

中央大学理工学部物理学教室 1新潟大学医学部細菌学教室

(DepartmentofPhysics, ChuoUniversity,Kasuga, $\mathrm{B}\mathrm{u}\mathrm{n}\mathrm{k}\mathrm{y}_{\mathrm{o}\mathrm{k}}- \mathrm{u}$, Tokyo $112\cdot 8551$)

$($DepartmentofBacteriology,Niigata University SchoolofMedicine,Niigata $951\cdot 8510)^{1}$

序

私たちは、 バクテリアが寒天培地表面上につくる、2次元的パターンの形成 を調べている。特に、Becillus subtilisがつくるパターンのなかで、同心円状リ ングコロニーについて注目している。 . このパターンは、 コロニーが広がる $\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{g}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}\text{、}$ パターンの拡大が止まって増 殖する consolidation が交互に周期的に起こることによって形成される。 今回の実験はこの周期成長のサイクルタイムが何によって決まるかを知りた いということから始めた。

実験

使用した菌

B. subtilis

枯草菌とよばれる、納豆菌と非常に近い菌種である。 株は OG-O1株を使用。 細長い棒状で、周囲に鞭毛が生えており、 これを使って水中を泳ぐことが出来 る。 また、環境条件が悪化すると芽胞と呼ばれる、-種の胞子の状態に成るこ とが出来る。 実験方法 $-$_{培地の作り方} $\mathrm{N}\mathrm{a}\mathrm{C}1_{\text{、}}\mathrm{K}_{2}\mathrm{H}\mathrm{P}\mathrm{O}_{4}$をそれぞれ0.5%の水溶液をつくり、 それに PePtone(栄養)

と、Agar(寒天)を適量くわえて、オートクレーヴで滅菌し、 固まる前に滅菌状 態で内径 $88\mathrm{m}\mathrm{m}$ の滅菌シャーレに $15\mathrm{c}\mathrm{c}$ つつ分ける。室温で冷却し固化、乾燥 機で約15時間乾燥する。 $-$菌液 緩衝液 $\mathrm{P}\mathrm{A}10_{\mathrm{X}}$ に菌をとかし、$\mathrm{O}\mathrm{D}$ が0.5になるように溶かす量を調節する。 この菌液を、培地の中央に $3\mu 1$接種する。 $\ovalbox{\tt\small REJECT}$ 培養条件 室温35℃、湿度90%の恒温恒湿機内で培養する。 今までわかっていること [1] 寒天濃度と栄養濃度をパラメーターとして、変化させて実験をした結果、図1 のような、morphological diagram がえられた この図は、横軸に寒天濃度の逆数を取っていて、右に行くほど寒天培地が柔ら くなる、 つまり菌が培地上を運動しやすくなる。 縦軸には、栄養濃度の対数を とっていて、上に行くほど栄養が多く、 増殖しやすい条件である。 $\mathrm{A}_{\text{、}}\mathrm{B}_{\text{、}}\mathrm{C}_{\text{、}}\mathrm{D}_{\text{、}}\mathrm{E}_{\text{、}}$ の5種類のパターンができることがわかっている。

A

領域にみられるのは、DLA-like なパターンである。フラクタル次元は、約 1.7で、DLA モデルのフラクタル次元と–致する。 また、 遮蔽効果や反撲現象 など、DLA モデルのシミュレーションで得られるのと同じ現象が実験でも得ら れたことから、DLA と考えて間違いないだろうと思われる。

$\mathrm{B}$領域にみられるのは、Eden–like なパターンである。Eden モデルのクラス

ターに近いだろうと考えている。但し自己アフィン指数は0.7以上になり、Eden

モデルの計算機シミュレーションで得られる値 0.5 より大きくなる特徴がある。

$\mathrm{C}$ 領域が、今回私が調べた同心円状のリングコロニーが出来る領域である。冒

頭で述べたように、 周期成長によって形成されるパターンである。

$\mathrm{D}$ 領域で見られるディスク状のパターンは、 Fisher 方程式で説明できるパタ

$-\backslash \nearrow$ である。Fisher 方程式は集団に適応度の高い変位個体が出現した時、それ

が空間的に広がっていく過程を記述する集団遺伝学のモデルとして、Fisher が’37年に提出した。成長界面の広がる速度や菌の密度など、実験結果は

Fisher

方程式の解の振る舞いと矛盾しない。 $\mathrm{E}$ 領域には

DBM-like

なパターンが現れる。成長界面はきれいな円状なのだ が、 パターン内部は、 細かく枝分かれしていて、 枝の太さと枝と枝の間隔がほ ぼ 1 対 1 であるという特徴がある。

$\Re \mathrm{O}$ $\theta \mathrm{f}\mathrm{f}\mathrm{i}\mathrm{r};\iota \mathrm{w}\mathrm{f}\mathrm{f}\mathrm{l}\mathfrak{x}$

図1

Morphological Diagram

of Bacterial Colonies for Bacillus

subtilis

横軸は寒天濃度の逆数、縦軸は栄養濃度の対数をとっている。右に行くほど菌 の易動度が高く、上に行くほど増殖しやすい環境になっている。 5種類のパターンが得られて、$\mathrm{A}_{\text{、}}\mathrm{B}_{\text{、}}\mathrm{C}_{\text{、}}\mathrm{D}_{\text{、}}\mathrm{E}$ 領域と名前をつけている。斜線 部分はそれらの中間的パターンの領域で、 上下に走る破線は能動的運動を行っ て出来るパターンとそうでないパターンの境界線である。 これを見てすぐ分かるように、$\mathrm{C}$ 領域のリングパターンは寒天濃度に対して非 常にせまい領域でしかあらわれない。

結晶成長や、 同じバクテリアでは、

P.

mirabllisなどが知られている。

レプリカプリンティング[2] [3]

今までの実験で、 一回の migration の続く時間、

consolidation

の続く時間、

それらを足した–つのリングが出来るのにかかる時間 (cycle time) とリング

-

つの幅の寒天濃度依存性、栄養濃度依存性を調べた実験がある。その結果は、

cycle

time

は寒天濃度にも栄養濃度にも依存しないで–定であった (グラフ $1_{\text{、}}$

$2)$_{。この結果は、 コロニーの周期成長のリズムは菌内部のプログラムによるの} ではないかということを連想させる。 しかしそれでは生物学の問題になってし まうので、 物理の問題にならない。 それについて調べるためにレプリカプリン ティングという実験を行った。 レプリカプリンティングは、簡単に言うとコロニーの移植である。 ある程度成長したコロニーを寒天培地ごとメスで切り取り、それを台の上に乗 せて、新しい新鮮な培地を上からかぶせるようにして、新しい培地に菌だけは りつける (図2)。 こうして、切り取られた方のコロニーの成長サイクルと貼り付けられたコロニ 一の成長サイクルを比べる。 もしサイクルがずれるようなことがあれば、 菌自 身のプログラム説は否定されることになる。

実験結果

マイグレーション中のコロニーのレプリカプリンティング 結果から言うと、マイグレーション中のコロニーをレプリカプリントしてもそ のままマイグレーションを続ける。ただし、 レプリカプリントされたほうのコ ロニーが新しい培地で広がった部分は、元のコロニーのフロント部分が中心で なく、外側から2番目のリングのフロント部分が中心に広がっているように見 える (写真1)。 顕微鏡で観察してみると、マイグレーション中だった–番外側のテラスの菌は レプリカプリントされるとまばらになりまったく動かず$($写真 $2)_{\text{、}}$ その代わり、 つ内側のテラスの先端から活発な菌が湧き出しているのがみえた。 そこで、切り方をかえてレプリカプリンティングを行った。 まずひとつは、$-$ 番外側のテラスだけを切り取る方法。 もうひとつは、 外側から2番目のテラス の先端部分までを切り取る方法である (図3) 。前者では、 レプリカプリンティ ング後はマイグレーションが続かなかったのに対し、後者は、 そのままマイ

$\not\in \mathrm{c}\mathrm{v}^{\mathrm{n}}\circ \mathrm{I}\mathrm{e}l\mathrm{i}|||\mathrm{e}(^{\mathrm{n}\mathrm{t}}\circ l\mathrm{n}\mathrm{o}^{9t\mathrm{a}}\mathrm{i}\mathrm{s}\circ|\mathrm{t}|_{\mathrm{d}}^{\mathrm{o}\mathrm{t}}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}’\urcorner l||\mathfrak{n}\mathrm{P}|.:_{1}^{i}\mathrm{i}\mathfrak{n}\mathrm{e}(\mathrm{h}\mathrm{h})\dot{\eta}_{J}^{\backslash }’)$ 8 7 $—\ldots\dot{.}\phi$ -. $–\cdot\Phi..’.\cdot-.-\psi.-,’.\cdot-\cdot\cdot-\cdot\cdot\cdot.\cdot\sigma\Phi.\cdot..--$

.

.

.

.

6. . . . $-\cdot.$.-. . . . : $-$ -. $—.$.-. . . _$–$

.

. . . . . ’

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5 $—$ , $–.\Psi_{\wedge^{-}-}-$

-.m

$l.$

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$-.- \mathrm{m}-.\cdot’.-$

a

$—.\cdot.$

E

$–$ $\mathrm{E}\omega$ 4 $-$ -.-.

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3 $-$ -. . .

..

$—$ -. $-$ :. . . $—.\cdot-$ -. . _$-=-$ -. . $-$

.

.

2 $—- \cdot\text{。}----\oplus^{:}\cdot.’-\cdot--\oplus\cdot-\cdot.,\cdot---.\cdot.\Phi-\bigotimes_{----}.-\cdot$ $\mathrm{t}$ 25 30 35 40 45 50

Cn

$(\mathrm{g}/1)$ グラフ

1

成長サイクルの栄養濃度依存性

$\ovalbox{\tt\small REJECT} \mathrm{C}\mathrm{v}\mathrm{c}\mathrm{I}\ominus \mathrm{t}^{\mathrm{d}}\mathrm{i}\circ 0\cap \mathrm{S}\mathrm{o}|\mathrm{n}\mathrm{i}\mathrm{g}_{\Gamma}\mathrm{a}_{\mathfrak{l}}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\cap \mathrm{e}_{\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}}i\mathfrak{n}\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{a}\mathrm{s}\mathrm{e}\mathrm{e})\mathrm{e}\mathrm{i}\mathrm{m}\mathrm{e}$

$- 8$ 7 $—\cdot\cdot,,\cdot’-.--.\cdot.\cdot.----\cdot$”$.–\cdot-,$ ” $.’—-.\cdot---.\cdot’.--’-\dot{\Phi}.,\phi_{-}.\cdot,\cdot--$ $\phi$

.

_.

$\cdot$

.

6 . $–\mathrm{g}.’$. $.–.\cdot.\cdot$. $–\cdot‘"’--\cdot.,\cdot.’\ldots..\cdot.\ldots-.."---.\cdot:,’---$

$\mathit{2}$

.

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$\cdot$

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$\underline{.\underline{\mathrm{E}\omega}}5\cdot-$ . $l..\cdot’-.-..\cdot.\cdot.--..\cdot."----,‘$”$—-,\cdot...-\Phi-,\cdot’.\cdot----\dot{\mathrm{m}.\cdot.}\cdot--$ 4 $.–\cdot.’.--\cdot\cdot.\cdot.-\cdot\cdot\dot{\mathrm{m}}\mathrm{c}.---.,,\cdot.--..,--.-.\cdot,\cdot-\cdot-,\cdot.$. $.–$ $\dot{\mathrm{m}}$

.

’

.

3 . . $-,$

.

$\cdots-.\cdot.-\Phi\cdot\cdot\cdot\varphi.’\cdots-,\cdot$ ”$.-$ .

$-.\cdot--$$.\cdot’\dot{\otimes^{-}}\iota$. . . $..-\cdot$ .

2 645 65 655 66 665 67 675 68 6.85

Ca

gハ グラフ

2

サイクルタイムの寒天濃度依存性 多少左下がりだが、 中心からの方向によってサイクルタイムには、 多少の誤差 があるので、 ほぼ–定とみなした。

サンプル$\mathrm{A}\uparrow$ サンプル $\mathrm{B}\downarrow$ 図2 レプリカプリンティング ある程度成長したコロニーを、 メスで培地ごと 切り取りそれを台の上に乗せる。その上から新 しい新鮮な培地をかぶせるようにして、菌だけ 新しい培地にはりつける。 切り取られた元のコロニーと、 貼り付けられた 新しいコロニーの成長サイクルを比較する。 サンプル$\mathrm{A}\uparrow$ サンプル $\mathrm{B}\uparrow$

マイグレーション中のレプリカプリンティング

写真1 マイグレーション中のコロニーをレプリカプリンティングした実験。 マイグ レーションは、そのまま続いているのが分かる。 しかし新しく広がったりング は、 もともとの成長先端ではなく、 -つ内側のリングの先端を中心に広がって いるように見える. (写真中の黒い点が、元の成長先端に印をつけたもの)。

マイグレーション中のレプリカプリンティング 顕微鏡写真 レプリカプリントしたコロニーの

–

番外側のリングと、– つ内側のリングの 境目付近 (下図の網掛け部) _{の顕微鏡写真。右上のまばらで動かない菌が見え} る部分が外側のリングで、_{左下の密に見える部分が一つ内側のリングから湧き} 出してきた菌。 _{湧き出してきた菌がまばらな菌を覆っていく様子がわかる。}

マイグレーション中のレプリカプリンティング 写真 3 上の二つの写真は図3の左のように切った実験。 下の二つの写真は図3の右の ように切った実験。 上の写真ではマイグレーションが続いているが、 下の写真 はマイグレーションが続いていないことが分かる。 図3 左が–つ内側のリングまで、 右が–番そと側のリングだけ切った例

グレーションが続いた (写真3)。 このことから、マイグレーション中のコロニーは、外側から2番目のテラスの 先端から、菌が次々に供給されてマイグレーションが続いていることが分かっ た。 しかし、 -番外側のテラスの菌はレプリカプリンティングによって密度が 下がり動けなくなってしまうので、その

–

番外側のテラスの振る舞いは良く調 べられなかった。 コンソリデーション中のコロニーのレプリカプリンティング コンソリデーション中のレプリカプリンティングの実験は、コンソリデーショ ンが始まってから、 レプリカプリンティングするまでの時間によって結果が少 しずつ変わってきた。 まず、 コンソリデーション開始直後の実験では、レプリカプリンティングされ たコロニーの側面の、 -番外側のテラスの–番後方 (成長方向を向いて) 部分 からプリント直後にマイグレーションが開始された。 さらにフロント部分から $\text{も元_{のコロニ^{ー}}より早く_{マ}イグレーションが始ま_{った}}$ (写真4)。 コンソリデーション開始1時間経過後の実験でも同様に、側面からマイグレー ションが開始するが、 開始直後の場合より始まる場所がすこしフロント方向に ずれている。 さらに広がった後の写真を見ても -番外側のテラスの真中当たり を中心に広がっているようにみえる (写真5)。 コンソリデーション開始2時間後の実験では、更にフロントに近いところがら マイグレーションが開始している。広がった後の写真もテラスの前方部分を中 心に広がっているように見える(写真 6)。 コンソリデーション開始から3時間半後はマイグレーション開始直前で、この ときはフロント部分からしかマイグレーションは起こらなかった(写真7)。 また、マイグレーション中の実験でやったように

–

番外側のテラスのみを切り 取った実験を行った。その結果、 コンソリデーション初期の実験では後方部分 から、 コンソリデーション末期の実験では前方からマイグレーションが開始さ た。 さらに、初期の実験では時間をおいて前方からもマイグレーションが開始 した。そしてその時間差がそのまま続いてコロニーが成長していった(写真8)。

まとめ

以上の実験からまとめると

.

_{周期成長は、} 1/_{プリカプリントによって培地がかわることで影響を受ける。}

.

マイグレーション中の実験では、 レプリカプリントにより外側のテラスの菌 が活動できなくなった。

コンソリデーション開始から1時間後のレプリカプリンティング

コンソリデーション開始から2時間後のレプリカプリンティング

コンソリデーション開始から3時間半後のレプリカプリンティング

コンソリデーション中のレプリカプリンティング

写真 8 プリントするもとのコロニーは図3の右のように切った。 この写真では元の コロニーでフロントだった部分は上を向いている。 上の左の写真は、 コンソリ デーション初期の実験である。 フロントと逆の方からマイグレーションが始ま っている。 上の右の写真はコンソリデーション後期で、 フロントからしかマイ グレーションが始まらなかった。 下の写真は、 コンソリデーション初期の実験 で、 約1 日後の写真である。 後方からマイグレーションが始まったのち、時間 差をおいてフロントからもマイグレーションが始まった。 そして、 ずれがその ままにリングパターンが成長している。

コンソリデーション中の実験では、 カットした側面部分からレプリカプリン ティング直後にマイグレーションが始まる。 フロント部分についても、 元のコロニーより早くマイグレーションが開始す るが、 直ちに開始するような大きな影響ではない。 これらの結果から考察されることは、コンソリデーション中コロニーの

–

番外 側のテラスにはレプリカプリンティングされることによって直ちにマイグレー ションを開始できる部分がある。 この部分は始めテラスの–番後方にあるが、 時間と共に前方へ移動していき、 フロント部分に達した時マイグレーションが 開始される (図4) 。いいかえると、テラス内部に構造がありそれが時間的に変 化していき、ある構造になるとマイグレーションが開始されるということであ る。 今後、 この構造をミクロな視点で観察することが重要である。 初期 中期 終期 図4 まるで囲んだ部分がすぐにマイグレーションを開始できる部分。時間と共にフ ロント部分へ移動していく。

参考文献

[1]

_M.

Ohgiwari,

M.

Matsushita and T.

Matsuyama:

J.

Phys.

Soc.

Jpn.

61

(1992)

816.

[2] J. Wakita, _H. Shimada,

H.

Ito, T. Matsuyama,

and

M.

Matsushita:

submitted

to

J.

Phys.

Soc.

Jpn.

[3]

_T.

Matsuyama, $\mathrm{Y}$ Takagi, $\mathrm{Y}$ Nkagawa,

H.

Ito,

J.

Wakita,

and

M.