マイクロア レイによるニワ トリ性的二色性の分子基盤の解析

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マイクロア レイによるニワ トリ性的二色性の分子基盤の解析

Microarrayanalysisshedslightonthemolecularbasisofsexualdichromatism inchickens

床尾 彩加 ･中岡 実乃里 ･高橋 純夫 ･竹内 栄 AyakaFukao,MinoriNakaoka,SumioTakahashi,SakaeTakeuchi

岡山大学大学院 自然科学研究科生体統御学 グループ

GraduateSchoolofNatu1･aLScienceandTechnology,OkayamaUniveL･Sity は じめ に

性 成 熟 の過 程 で生 じる性 差 ,即 ち, 第 2次性 徴 (secondarysexualchal･aCtel･istics)の うち,形態 的 な 性差 を性 的二形(sexualdimolphism)とい う｡

ヒ トの 皮I帯や皮周 付 属器 (毛 や汗腺 ,皮脂 腺 な ど) は性 的二形 を示 し,性 ホルモ ンに よる制 御 を受 け る

【1,2】｡ 毛の タイプの決 定 や成 長 には女性 ホ ルモ ンと 男性 ホ ルモ ンの両者 が密接 に関与 す るが[3】, その作 用 は複 雑 であ り,体 の 部位 に よって異 な る｡ た とえ ば ,男性 ホルモ ンは男性 毛 と呼 ば れ る特 定 の部 位 の 毛(ひけ.胸毛 ,上肢 や下肢 の毛 .脇 の毛,陰毛 な ど) の成 長 を促 進す る一･万 で,

前t

il'lI部 やii打頂郡 にLl=̲え る 毛の成 長 を抑 制す る ､また

,

後頭部 の毛 や まゆ毛 な どはリ川=.ホルモ ンの形轡 をr‑1･け ない と され る【4】J こ の こ と ,.ri, 女性 に お け る ア ン トロ ゲ ン過 剰1J‑'L‑: (hypel･androgcnisnl)が卿 ､′律 J̲多 毛 症(hirsutism)r'i‑ 示す こ と,50%以上 の LP,性 が50歳 まで に男性型 脱 毛 症(之Indl･Ogenicalopecla;AGA)を発 症 す る こ と と密 接 に閑 適 してい る【5】｡

男性 ホルモ ンに応答 す る毛 色は,す べ て同 じア ン ドロゲ ン受容 体(AR)を持 つ に も拘 らずt4】,上述 の よ うに 異 なる反応性･+i･示 すL.その 原 凶 の ‑‑3i二して, テ ス トステ ロ ンを よ り強力 な ジ ヒ ドロテ ス トステ ロ ン(DHT)に変換 す る ロ型 5cL還 元酵2,‑き(5crreductase type2)の 発現 差 が示 唆 され て い る【6】,,実 際,AGA 治 療 に お いてⅢ型 5α還元 酵 素 の 阻 害 剤 で あ る フ イ ナ ステ リ ド(finastel･idc)が 有 意 な効 力と,Ji‑もた らす こ

とが報 告 されてい る[7,81｡ しか し,DHTのr冊 貞部 や

現

頂 郡 の毛 包 に対 す る作用徽

序

, 体 の他 の 部位の 毛 包 で逆 の効 果 を示 す 仕組 み な ど,性 ホ ルモ ンの 毛 包 に対 す る作 用の詳細 は今 なお不 明 な点 が 多 く残 され てい る〔5】1‑,

鳥郷 の羽 はu併し媒l:の 毛 と同 様 に,表皮 細 泡に由来 す る皮 璃 付属器 であ る∪ ニ ワ トリの 羽 色は主 に羽 JA メ ラ ノサ イ トが 産 生 す る畢 ‑褐 色 の メ ラニ ン色 差 (ユ ‑ メラニ ン)と蔚‑赤 色の メラニ ン色基(フェ オ メ

ラニ ン), お よび羽の 微 細け推道 が 創 り出す 光 沢(柄 退 色)に起 皆す る｡ ニ ワ トリで は,羽 色に性 的二 形 が 見 られ,鞍 に生 じる;];=ま,雛 と成鶏 雌 では くす んだ褐 色を里 す るの に対 し,成現価 では 蔚金 色(光沢の あ る 黄 色)を呈 す る,,一万 ,胸 ,･L,.17)に生 じる羽 では,経 と成 鶏雌 が ク リー ム 色 をjia=,す るの に対 し,T'X鶏 雄 は黒 色 の混 ざった暗色 を呈す る,,成鶏 雄の 羽 色が雌雄 に共 通 な発生 に おけ るデ フ ォル トであ り,成 払雌の 羽 色

は卵 鵜Ei｣束の エ ス トロゲ ンの作用 に よ り創 IiJ.され る こ とか ら【9】,エ ス トロゲ ンは鞍 と胴の三J;]Jaでは メラ ニ ン産'=I=J.に関 して正 反対 の作 用 を示す こ とになるL･, 従 っ て , ニ ワ トリの 羽 色性 的 二形 (件 的 二 色性 ; sexualdlChl･｡matlSm)創出の しくみ を解析す る こ と は, ヒ トの毛 /Aに対 す る性 ホルモ ンの作 用 俄序 を

考

える とで も重 要 な知 見 を与 えて くれ る こ とが期 待 で きる(′

本 研 究 では,性 的二 色性 の分子)1鰹 を明 らか にす るEH炉ぐ,おか寸'ま地 と りの 焼酎 二生 じたlt儲 型 丑 成親雄11;L‑!札 お よびエ ス トロゲ ンの一 種 であ るエ ス

トラジオール 17β(E2)存 在 下 で̲/‑F.じた成鶏州は 辞職 ･

}川に党肝 うる遺 伝子 をマ イ クロア レイ に よ り網 羅 的 に解 析 した..

材料 と方 法

実験動物 と羽包 の採取

本 実験 で は ,畜 産研 究所 (岡 山県 久 米 郡 美 咲 町北 2272)か ら譲 り受 け た雄 の おかや ま地 ど りを用 い た｡

おか や ま地 ど りは遺伝 的 に不均 一 なため,羽包 サ ン プル(5週 齢鞍 の 中雛型 羽包 ,8週 齢鞍 の成鶏雄型 羽 也,E2処理 した11週 齢鞍 の成鶏雌型梯 羽包)はす べ て同一個 体 か ら採 取 した｡ す べ ての実験 は岡山大学 動物実験 ガ イ ドラ イ ンに従 って行 われ た｡

E2処理

8週 齢 のお かや ま地 ど りの蕨 に生 えた羽包 をエ ー テ ル 麻 酔 下 で 抜 い た 後, estl.adiol 17･β (E2;

Sigma･Aldrich,St.Louis,MO,USA)を詰 め た2.5 cmの silastictube(0.062in.

I

D x0.125in.OD;

Dowco工･ning,Midland,MI,USA)を皮 下移植 した｡

RNA抽 出

羽包 サ ンプルか らTRIzoIReagent(Invitrogen)を 使 用 して仝 RNAを抽 出 した｡抽 出 したRNAに含 ま れ る メラニ ン色 素 を除去す るため , チ オ シア ン酸 グ アニ ジ ン/塩 化 セ シウム勾 配超 遠心 法rlO,11】に よ り 全RNAを更 に絹製 した｡得 られた仝 RNAはDEPC 処理 した蒸留 水 に溶 か して‑80℃で保存 した^｡ マ イ クロア レイ解析

タカラハ イオ(樵)ドラ ゴ ンシェノ ミク スセ ンター (三重 県LigEL市 市桜 町7870番地15)のChlCken(V2) を用 いたAgilentan･ay発 現解析受託 サ ー ビスを利

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用 した. また,デー タの解析 にはGeneSpl･ingGXll (アジ レン ト･テ クノロジー株式会社)を用いた｡

RT･PCR解析

仝 RNA 1.5LLg を Deoxyl･lbonuclease I, Ampllfication Gl.ade(Invitrogen)で処 理 した 後 . TheL･mOScriptRT‑PCR System (Invitrogen)を用 い て逆転写反応 を行 った｡PCR反応 は,PlatlnumTaq DNA polymerase(InvltrOgen)を用 いて GeneAmp PCRSystem 9600仏ppuedBiosystems)で行 った.

PCRのサ イクル数は,ASUP,OCH2,0C43,Gapdh がそれぞれ,24,24.20,18サ イクルであ った｡

ASTPとGapdhのプライマー対 は報告 されている も の[12】を用い,OC42とOC43の プライマー対は以 下の通 りであった｡OC42(FP:5'‑AGA TGC TCC TGAGGAAGAAGC‑3',RP:5'･TGTCAATCACAG ACG AGG CCAl3'), OCA3 (FP:5'‑CTG GAA ATGTrGCACGGCCTAl3',RP:5'‑GCTGTATCC CAGGm TTC甘GGTGC‑3')

｡

結果 と考察

雄鞍羽 の成長 に伴 う変化 とE2の効果

おかや ま地 と りは, ロー ドアイラ ン ドレッ トと横 斑 プ リマ ス ロックとの かけあわせ で生 じた雌(ゴー ル ドネ ック)と,白色プ リマ スロックとの交配で作出 古れる (三元交配鶏)｡遺伝 的に不均一 な品種であ り, 黒色拡張遺伝子座 に関 して も優性対立遺伝子 E を も つ個体 ともたない個体 があ り,その結果,黒色羽裳 と野月:.型様 羽裳が混在す る｡野生型様 羽裳 も多様性 に富 んでお り,羽色の個体 間比較 は難 しい｡ おかや ま地 ど りでは羽色 を引 き抜 くと2‑3週間で羽色が 再生 される｡本研究ではこの再生羽形 成能 を利用 し, 中雛型 羽 と成鶏型羽 との比較,お よびE2処理の羽形 質に及ぼす影響 については同一個体 で行 った｡

図1に示す ように,中雛型 羽は先端 が丸い形状で, 白色横斑 以外の部分 は黒 や茶のユ ー メラニ ンが優位 であ った｡ これに対 し,成鶴雄型鼎 ま先端 が尖が っ た師羽であ り, 白色横 斑以外 の部位 は光沢のあ る弟 金色 を呈 した.一方,E2存在 下で誘導 した再生7日は 中雛型 羽 と同様 に先端 が丸 く, 白色横斑 以外の部分 は黒 や茶のユー メラニ ンが優位 であ った｡成鶏雄型 羽の光 沢は構造色 による もので,羽根軸 に小羽根 を 欠 く構造 に起因す る｡E2処理 によ り生 じた成鶏の羽 は光沢 を失 い, くす んだ色 を里す るが,その羽では 小 羽枝 が観察 された｡ この特徴 は成鶏雌型 羽の特徴

と一致す る｡

白色構成 はZ染色体 に位置す る伴惟横斑迎伝子座 (sex‑linkedbarring)の優性対立遺伝子 に担囚す る｡

性 染色体 に関 して雄 ホモ雌ヘテ ロであるため, 白色 横斑 の度合いに雌雄差 が生 じる｡本研 究 では雄 を用 いてい るため,図 1の羽の横斑 は鮮明で雄型 を示 し てい る｡ しか し,白色横斑 を除 く形 質においては, E2処理 に より生 じた成鶏の羽は,成鶏雌型羽に酷似 してい たO この ことは,成鶏雄型 羽が成鶏型羽の デ

̲ . I. i ‑ さr

基 ?

Juv e ni l l e Adl l l t E2 ̲ t i e a t e d

図1 雄鞍羽の成蚊変化 と羽形成に及ぼすE2の効果 おかや ま地 ど り雄骸都 に生 じた中経型羽Guvenlle),皮 鶏雄型羽(adult),お よびE2処理に よ り生 じた成鵠雌

ft'

J̲羽械 羽(E2‑treated)を示す｡すべて同一個体にFR束 す る｡

フオル トであ り,E2が成鳥雄型羽形成 を成鶏雌型羽 形成 に変 更す る とい う説【9】を強 く支持す る｡ 以降, E2処yF̲L二よ り生 じた成鶏羽 をE2処埠 成規雌型羽様 羽 と呼ぶ｡

中雛型 羽,成鶏雄型羽,お よびE2処理成鶏雌型羽 梯羽の遺伝子発現 プロフィール

マ イクロア レイ解析 によ り得 られた羽における遺 伝子発現 プ ロフ ィール を図2に示 したO成鶏雄型LJLJ における発現 と比較 し,中雛型羽 もしくはE2処理成 鶏雌型別様 羽で 30倍 以上の発現変化が観察 された 遺伝子は38i削云子 あ り,中触型羽で特異的 に高発現 している迫伝子が9つ(図2A‑a).E2処 理成鶏雌型羽 棟 羽 で特 異 的 に高発 現 して い る遺伝 子 が 5つ(図 2A･b)同定 された｡興味深いことに,中雛型羽 とE2 処理成鵜雌型羽根 羽で,共 に5倍以上の発現変化 を 示 した迫伝子 を調べ た ところ284遺伝 子が同正 され たが,そのすべ てが 中馳塑羽 とE2処理成鶏雌型羽様 羽で同 じ発現動態 を示 した(図2B)｡ この ことは,那 の形態視察の結果(図1)と符合 し,中雛型羽 とE2処 理成鶏雌型 羽横 羽が遺伝子発現の レベ ルで もよ く似

ているこ とを強 く示唆す る｡

羽色遺伝子 の発現比較

成鶏雄型羽 における発現 と中経型羽, E2処理成 鶏雌型羽様 羽 における羽色遺伝子発現 レベ ルの比較 を図3に示 した｡ ヒ トの眼皮庸 白皮症1(OCAl)の原 因遺伝子 であ り, メラニ ン産生の鍵酵素チ ロシナー ゼ をコー ドす る Tlノア は大 きな発現差 を示 さなかっ たが .ユ ー メ ラニ ン産 生 に働 く遺伝 子群(OC42, OCA3,0C44,DCT,PMEL)が中雛型羽 とE2処 理成鶏雌型羽様 羽で高発現 し,成鶏旗型羽 で発現 レ ベ ルが低 い ことがわか った｡ この結果 は, 中雛型羽

とE2処理成鶏雌型羽様 羽では黒や茶のユ ーメラニ ンが優位 であ り,成鶏雄 型羽はフェオメラニ ンの黄 金色 を里 していたこと(図1)と符合す る｡フェオメラ ニ ン産生 はアグーチ シグナル タンパ ク(ASIP)が メラ ノサ イ ト膜表面 の メラノコルチ ン 1受容体(MCIR)

4 2

A

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E2‑IreatetJ JtJVenile

AdlJIt E21treilted JLIVenile 凶 2 中雛型札 成鶏鹿 型札 およびE2処理成鶏雌型 LJ=Jl,糾.)の遺伝子発現プロフィール

成規雄型羽(adult)における発現 と中経型羽Uuvenue), E2処FJi成功雌型羽様朋(E2ltreated)における発現の比 較｡縦軸はlog2比 を衣わす｡Aは成功雄型羽における 発現 と比 して,中捷塑羽 またはE2処理成功雌型羽梯 羽で 30倍以上の発現差がみ られる退任子 をプロッ ト

した もので,a,bは中雛型羽またti E2処理成功雌型 羽梯羽に特異的に権現 レベルが高い遺伝 子を示す｡B は成鶏排型羽における碓規 と比 して,中経型羽 とE2 処理成功雌型ココ様利で5倍以上の発現差がみられる退 任子 をプロ ノトしたものである｡

Genes Juvenile E2‑treated (loE2ratio) (log21.atio) OCAJ/TY77 0.68 0.81 OCA2/p‑pJ.0由J'D 5.17 6.08 OCA3/TY7lP1 8.OLl 6.43 OCA4:SLC45A2 1.03 1.1.l DCT.'TY77Pg 3̲98 3.43 PMEL 1.19 1.04 SLC24A5 2.92 3ー32 l

図3 羽色遇伝子の発現比較

成親雌型羽(adult)における発現 と中牡型羽Guvenue), E2処理成鶏雌JE川,l根羽 (E2‑treated)における発現の 比較｡数値はlog2比を表わす｡

に作 用 す る こ とで 誘 導 され る【10]oASJPの 発 現 が 中 経 型 羽 や

E2

処 理 成 鶏 雌 型 羽様 羽 と比 して成 鶏雄 型 羽 で高 い こ と,ASLPを過 剰 発 現 す る黄 色 ウ ズ ラ に お い て 発 現 低 下 が 報 告 され て い る .gLC24A5の 発 現

洩

♂

A

^S

I P■

■■■■■⊂=コ■ =

O

^C

^A2ヒさ ･

^一

一 一 一 一

O

^{CA 3}

E L ･ ･ ‑ ‑ ･1

G

^apd

J I F‑ 一 二‑

図4 中綻型札 成鶏碓型札 およびE2処理成鶏雌型 羽様羽における羽色遺伝子の発現

おかや ま他どり雄鞍部に生 じた中経型羽 Guveniユe). 成tEI雄型羽 (adult),およびE2処理成#fl,雌砂川様羽 (E2ltl･eated)におけるASIP,OCn2およびOCA3 のmRNA党規のRT‑PCR解析.それぞれのRTLPCR 反応産物の電気泳動像を示す｡左の レーンは分子蕊マ ーカ‑として用いた100bpラダーであるo

l 1 3

】が 成鶏雄 型 羽 で 低 い こ とか ら, 中

雛型羽 ,E2

処 理 成 規 雌 型 羽 様 羽 と成 鶏 雄 型 羽 の 羽 色 の 違 い は , ASJPの 発 現 レベ ル の 違 い に起 因す る可 能性 が 強 く 示 唆 され た｡

マ イ ク ロ ア レイ デ ー タの 評 価

上 述 の マ イ ク ロア レイ デ ー タの 妥 当 性 を検 証 す る ため , 各 羽 に お け る ASIP,OC42,0C43の 発 現 を RT‑PCRに よ り調 べ た｡ 図 4に示す よ うに, そ れ ぞ れ の 発 現 は マ イ ク ロア レイ デ ー タに符 合 したC この 結 果 は , 本 研 究 で の 考 察 の 信 懸性 を保 証 す る もの と 考 え られ る｡

最後 に

本 研 究 に よ り, 中 雛 型 羽 と成 鶏 雌 型 羽 (正 確 に は

E2

投 与 下 で 生 じる成 鶏 雄 の 羽)は , 表 現 形 質 に お い て も. 遺 伝 子 発 現 に お い て も斬 似 して い る こ とが 明 らか と な っ た｡ この こ とか ら, 中 雛 型 羽 形 成 に卵 巣 以外 の 組 織 に 由 来 す る

E2

,あ るい は羽 包 内 で局 所 産 生 され る

E2

が関 与 して い る可 能性 が 初 め て示 唆 さ れ た｡ また

,E2

に よ り直接 的 に,あ る い は間 接 的 に 発 現 制 御 され る遺 伝 子 群 を同定 す る こ とが で きた｡

これ らの 遺 伝 子 群 の 詳 細 な発 現 解 析 は , ニ ワ トリに お け る性 的 二 色性 の 分 子 基 盤 を解 明 す る だ け で な く, 皮 府 付 属 器 の 性 ホ ル モ ン制 御 機 構 の 基 本 原 哩 を解 明 す る手 掛 か り とな る もの と期 待 され る.

本研 究 は ,学 術研 究 助 成 基 金 助 成 金 (基 丑餅汗究(C))

｢羽 色 の 性 差 と加 齢 変 化 を創 出す る分 子 機 構 の 解 明 ｣ (誰超符 号23570078)を受 け て行 わ れ た｡

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