日本消化器外科学会雑誌第29巻第9号

日消外会誌 29(9):1900∼ 1910,1996年

RT‐PCR法

_{を用 いた biological response modhersに}

_よる

サイ トカイン mRNA誘

導の解析

岡山大学第 1 外 科

上 平

裕

樹

Blological response modiners(BMR)によるサイ トカイ ン誘導機序 を解明す る目的で,ヒ ト末梢 血 単核球 を OK‐432あるい は polysaccharide K(PSK)で 束」激 し, サイ トカイ ン mRNAの 発 現 を reverse transcription polymerase chain reacdon(RT PCR)を_{用 いて経時的 に解析 した.IL‐lβ,} IL‐6,TNF‐ α mRNAは 1時 間以 内に発現が増強 した。IL‐2,IFN‐γ mRNAは OK-432で は 3時 間後

よ り誘 導 されたが,PSKで は24時間 まで誘導 されなかった。サイ トカイン蛋 白は mRNA誘 導 よ り 1 ∼ 3時 間のタイム ラグをもって産生 された。次 に BRMに 対する感受性の個体差 を検討す るため,臨 床症例 に OK‐432を投与 し,末 梢血単核球 にお けるサ イ トカイ ン mRNAの _{発現 を解析 した。皮 内投与} で は多種 のサ イ トカカイ ン mRNAが 強 く誘 導 され る症例 (high responder)が34例中 4例 あ り,こ の ような症例 が BMR療 法奏効例 にな る もの と推察 された。

Key words: cytOkine mRNA, OK‐ 432, PSK, responder to BRM, RT― PCR

は じめに

O K ‐4 3 2 とp o l y s a c c h a r i d e K ( P S K ) は 広 く臨床 で 用 い ら れ て い る biological response modillers

(BRM)で あ るが, これ らは種 々の作用 によ り抗腫瘍 活性 を発揮 す る。 なかで もサイ トカイ ン誘 導能 は重要 と考 え られ, これ らの BRMが どの ようなサイ トカイ ンを どの ような順序で誘導 してい くか は興味 ある とこ ろであ る。そ こで OK‐432と PSKの inィtrOにお ける IL‐lβ,IL‐2,IL‐_{6,TNF‐ 2,IFN―γの誘導 を,reverse} transcription‐p01ymerase chain reaction(RT‐PCR)

を用 い て mRNAレ _{ベ ル で経 時 的 に解 析 し,イ ム ノ} ア ッセイによる蛋 白レベルでの結果 と比較検討 した. これ らの BRMの 臨床応用で は,当 初期待 され てい た ほ どの 臨 床 成 績 が得 られ て い な い のが 現 状 で あ る1としか し一 方で は,BRMの 投与 に よ り腫瘍 の著 明 な縮小 や消失り∼り,QOLの 改善DO,さ らには予後 の延 長の-1いをみ る症例 が 少 数 なが らあ る こ と も事 実 で あ る。この理 由の 1つ として,BRMに 対 す る感 受性 に個 体差 が あ る ことが考 え られ る。そ こで臨床症例 に OK‐ 4 3 2 を投 与 し, 末 梢 血 単 核 球 ( p e r i p h e r a l b 1 0 0 d m o n o n u c l e a r c e l l s : 以下, P B M C と 略記) にお けるサ <1996年 5月 8日 受理>別 刷請求先 :上平 裕 樹 〒700 岡 山市鹿 田町 2-5-1 岡 山大学 医学部 第 1外 科 イ トカイ ン mRNA誘 導 の個体差 を検討 した。 対象 と方法 1.in vitroで の BRMに よるサ イ トカ イ ン誘 導 の 経時的解析 1)対 象 5人 の健常人の PBMCを 対 象 とした. 2)PBMC分 離 と BRM添 加培 養

健 常人末梢I血よ り Ficoll‐COnray溶 液 による比重遠 心法 にて PBMCを 分離 した.こ の PBMCを 血清無添 加 RPMI-1640液 で106個/mlの 濃 度 に調整 し,こ れ に OK‐432(中 外 製 薬)を 0.005,0.05KE/mlあ る い は PSK(三 共製薬)を 0,01,0.05mg/mlの 各濃度 に添加 して37°C, 5%C02下 に培養 した。 なお OK-4320.05 KE/mlは 3例 で,OK‐ 4320.005KE/mlお よび PSK O.01mg/ml,0.05mg/mlは _{各 1例 で培養 を行 った。} 3)全 RNAの 抽 出 と電気泳動 培 養 前 お よび培 養 後 1,3,6,12,24時 間 の 各 PBMCよ りそれ ぞれ ISOGEN(ニ ッポ ンジー ン)を 用 い た A G P C 法1 1 ) によ り全 R N A を 抽 出 し た。各 PBMc 107個 に対 しlmlの ISOGENを 用 い,得 られた RNAの _{沈澱 を水 に溶解 して吸光 度計 によ り濃度 を調} 整 した.こ の各 RNAを アガ ロースゲルで電気泳動 し て18Sと 28Sの バ ン ドを確認 した。 4)RT‐ PCR

1996年 9月

各 R N A を ラ ンダムヘ キサヌ ク レオチ ド( 宝酒造), M ‐M L V リ _{バ ー ス トラ ン ス ク リプ ターゼ (GIBCO} B R L 社 ) と ともに3 7 °C , 6 0 分 反応 させ, c D N A を 作成

した。続 いて PCRに よ り,IL‐lβ,IL‐2,IL 6,TNF‐2, I F N γの 5 種 の サイ トカイ ン と内部 コ ン トロール と

した β‐a C t i n の各 遺 伝 子 を増 幅 した. P C R 反 応 は c D N A に プ ラ イ マ ー, T a q D N A ポ リ メ ラー ゼ

(Promega社 )を カロえ, Thermal Cycler(PERKIN ELMER CETUS社 )を 用 Vゝ, denaturation 94°C, 30 秒,annealng 55°C, 1分 ,extension 72°C,2分 の条 件 で行 った1り.PCRサ イ クル数設定 のた めに各 サイ ト カイ ンご とに数種類 のサイクル数 で PCRを 行 って, プ ラ トー に達 しない最適 のサイクル数 を決定 した。 5)オ リゴヌ ク レオ チ ドプ ライマー とイ ンターナル プロー ブ PCRの 増幅領域 が少 な くとも 1つ 以上 のイ ン トロ ンを また ぐようにプライマーを設定 し,DNAシ ンセ

サイザー (Mode1 380B,Applied B10systems社 )を 用 いて20merの 一対 の オ リゴヌ ク レオ チ ドを合成 し た。また,PCR増 幅領域 内 にハ イ ブ リダイズ させ るプ ローブ として20merの オ リゴヌ ク レオ チ ドを同様 に 合成 した (Table l). 6)増 幅遺伝子 の検 出 PCR反 応液 をポ リアク リル ア ミ ドゲルで電気泳動 後,エ チ ジウムブ ロマイ ド染色 し,紫 外線 トランスイ ル ミネー ター上 で写真撮影 した。サイズマーカー には ,X174/Hae III digest(TOYOBO社 )を 用 い,目 的 とす る増幅遺伝子 のバ ン ドは増幅遺伝子の大 きさによ り判定 した。 4 5 ( 1 9 0 1 ) 7)サ ザ ンブロ ッ ト OK‐4320.05KE/mlの 症 例 の PCR産 物 に つ い て 行 った。PCR反 応液 をアガ ロースゲルで電気泳動後, ゲル を変 性液,中 和 液 で処理 した。続 いで ゲル 中 の DNAを _{ナ イ ロ ン フ ィル ター (HybondN十 ,Amer‐} s h a m 社) ヘ トラ ン ス フ ァー した 後, フ ィル ター を r a p i d h y b r i d i z a t i o n b u f f e r ( A m e r s h a m 社_{) に てプ レ} ハ イブ リダイズ した。Table lに 示 した合成 オ リゴヌ ク レオ チ ドイ ンターナル プ ロー プ を T4ポ リヌ ク レオ チ ドキナーゼ (TOYOBO社 ),〔γ‐32P〕dATP(7,000 Ci/mmol,ICN社 )と ともにイ ンキ ュベ ー トして32Pで 標識 した後,ハ イブ リダイズ した19.ハィブ リダイズ後 の フ ィル ター はイメー ジ ングプ レー ト(フジフィルム) を用 い て オー トラ ジオ グ ラ フィー を行 い,バ イオ イ メー ジアナ ライザー (BAS2000,フ ジフィルム)に て バ ン ドの radioactivityを測定 し,経時的変化 を定量的 に解析 した, 8)培 養上澄 中のサイ トカイ ン蛋 白量 の測定 各培養上澄 中の IL‐_{lβ,IL‐2,IL・6,TNF‐ 2,IFN‐ γ} 蛋 白量 を測 定 した。大 塚 ア ッセ イ に よ り,IFN‐ γは IRMA法 ,他 は ELISA ttlりで測定 した。 2.OK 432投 与症例 の末梢血単核球 にお けるサイ ト カイ ン mRNA誘 導 の検 討 1)対 象 悪性疾 患42例,良 性疾 患 1例 ,健 常人 4例 を対象 と した。悪性疾患 は胃癌33例,肺 癌 4例 ,膵 癌 2例 ,食 道癌 2例 ,肝 細胞癌 1例 で あった。年齢 は悪性疾患で は44歳か ら82歳で平均63.0歳,良 性疾患お よび健常人 で は33歳か ら67歳で平均42.2歳,全 体 の平均 は608歳

Table 1 Oligonucleotide primers used for RT-PCR and internal probes used for Southern blot hybridization

Cytokine Primer Sequence (5'-3') Size of PCR

product (bp) IL 1 1 3 ) IL‐214) IL‐61" TNF‐ αl句 IFN‐γJ" 5 ' 3' Internal probe

s'

3' Internal probe 5 ' 3' Internal probe

s'

3' Internal probe 5' 3' Internal probe ACCTCCAGGGACAGGATATG TCCAGCTCTACAGTGGGCTT CAAGGCCACAGGTATTTTGT ACTGGACCATTTACTGCTCG CTGATTAAGTCCCTCGGTCT GGCCTTCTTGGGCATGTAAA TCGGTACATCCTCGACGGCA CCAGATTGGAAGCATCCATC CTCCCAGTGCCTCTTTGCTG GTGACAAGCCTGTAGCCCAT GAGACGAGGTTCACCTTCGT CTGGTTATCTCTCACCTCCA GGTCATTCAGATGTAGCGGA TGGTCTCCACACTCTTTTGG GACAATTTGGCTCTGCATTA 222

4 6 ( 1 9 0 2 )

Table 2 Characteristics v o l u n t e e r s w i t h O K ‐4 3 2

of patients and healthy injection

RT‐PCR法 を用いた biological response modiners 日 消外会誌 29巻 9号

Disease No. of cases (i.d.*cases)

Fig. I Time course of mRNA expression for IL-l B, lL-z, IL-6, TNF-a and IFN-7 in PBMC stimulated by OK-432 (0 .OsKE/ml) or PSK (0. 05 mg/ml) (a)OK-432 c u t t u r e t i m e 0 1 3 6 12 24(h) 1 lに β 車 l L - 2 l L - 6 Malignant disease ( a ^ ^ r - : ^ ^ ^ ^ ^ ^ -I e d i l r r L L d r r L c r I LunB cancer I Pancreatic cancer I Esophageal cancer I Hepatocellular carcinoma Benign lung tumor

Healthy volunteer 42(29) 33(25) 4 ( 2 ) 2 ( 0 ) 2 ( 1 ) 1 ( 1 ) 1 ( 1 ) 4 ( 4 ) (b)PSK culture time 0 1 3 6 12 24(h) Total 47(34) TNF― d Age(mean)i33∼ 82(608)

(

I Malisnant disease 44-82(63.0)

I BeniSn disease and Healthy volunteer 33-67 Q2.2) M a l e : F e m a l e - 3 8 : 9

*i.d : intradermal injection

で あった。性別 は男性 3 8 例, 女 性 9 例 であった ( T a b l e 2 ) . 2)方 法 OK‐432 2KEを 上腕 の筋 肉内あ るいは皮 内 に投与 し た。悪性 お よび良性疾 患症例 で は,術 前未治療時 に投 与 した.筋 肉内,皮 内 とも投与前 と投与後 12時間 あ る い は24時間 に採血 し,PBMCを 分離 した。投与後 の採 血 を12時間後 にす るか24時間後 にす るか は症例 をラ ン ダム に選択 した。前記 と同様 に全 RNAを 抽 出 し,RT‐ P C R を 行 って O K 4 3 2 投与 前 後 の サ イ ト カ イ ン m R N A の 発 現 を検 討 した。I L ‐l β, I L ‐6 , T N F - 2 , I F N ‐γの 4 種 のサイ トカインについて検討 した. 内 部

コン トロール ヤ_{こは glyceraldehyde 3-phosphate dehy‐} drogenase(GAPDH)を 用 いた. PCRサ イ クル数 は GAPDHが 23サイ クル,IL‐6が28サイクル,他 はすべ て25サ イ クル とし,そ れ以外 の PCR条 件 は前 記 と同 じとした。皮 内投与 で IL・lβ と TNF α の両方 とも誘 導 のみ られ た 8例 につ いて PCR産 物 のサザ ンブ ロ ッ トを行 い,定 量的 に解析 した。 結 果 1.in vitroで の BRMに よ るサ イ トカ イ ン誘 導 の 経時的解析 1)RT‐ PCR P C R 反 応が プラ トー に達 しない最適 の P C R サ イ ク ル数 ヤま,IL-2が 45サ イクル,IL‐6が25サ イクル,他 が22 サ イクルで あった.RT‐ PCR産 物 を電気泳動後,エ チ ジウム プロマイ ド染色 した結果,内 部 コン トロールの ,L-lβ 1に-2 1に-6 TNF― g F N γ 中 , F N ―Y β―a c t i n ― β―a C t i n ― β‐aCtinのバ ン ドはほほ均一 で あ り, RT‐PCRに 用 い た RNA量 が ほぼ等 しい ことを示 した。IL‐lβ,IL‐6, TNF‐ α tt mRNAは OK‐432,PSKと も培養後速 やか に発現 が増強 した。IL‐2 mRNAは 他 のサイ トカイ ン と比 べて発現量 が少 な く,OK‐ 432で は PCRを 45サ イ クル行 うこ とによ り培 養 3時 間後 よ り発現 の増強 が検 出 さ れ た が,PSKで は検 出 さ れ な か った。IFN―γ mRNAは OK‐432で は培 養 3時 間後 よ り発 現 が増 強 した が,PSKで は24時 間 まで 全 く増 強 し な か った (Fig.1).OK 4320 05KE/mlで は 3例 とも同様 の結 果 を示 したが,OK‐ 4320.005KE/mlで は0.05KE/ml の場合 と比 べ,IL‐2と IFN‐γ mRNAの 誘 導が遅 れ, 培 養 6時 間後 よ りみ られ た.ま た PSKに つ い て は 0.01mg/mlの 場合 は0.05mg/mlの 場 合 よ リサ イ トカ イ ン誘 導 の程度 が弱 い ものの,経 時的 な誘 導パ ター ン は同様 で あつた。 2)サ ザ ンブ ロ ッ ト エチジウムブロマイ ド染色でのバ ン ドに特異的 にプ ロー ブがハ イブ リダイズ し,こ のバ ン ドが 目的 とす る サ イ トカ イ ン遺 伝 子 に 由来 す る こ とが 証 明 され た (Fig.2).IL-6,TNF‐ α,IFN― γで も同様 であった. このバ ン ドの定量的解析 では,IL‐lβ,IL‐6,TNF― αは いずれ も培養後 1時 間で急速 に発現が増強 し, 3時 間 で ピー ク とな り,以 後 減 衰 した。 ピー ク時 の radio・ acuvity値 を培 養前 と比較 す る と,こ の症例 で は IL‐1 β は3.2倍 ,IL‐6は 12.4倍 ,TNF‐ α は4.8倍 に増強 して いた,IL‐2と IFN‐γは培養後 3時 間で急速 に発現が増 強 し,以 後24時 間 まで増強 し続 けた.培 養前 と24時 間 後 を比較 す る と,IL‐2は4.9倍 ,IFN‐ γは14.7倍 に増強

1996年9月

Fig。 2 Southern blot hybridization of the IL‐lβ and IL‐2 PCR products shown in Fig.1(a)

Southern blot Ethidium bromide staining

〔lL-lβ〕

0 1 3 61224(h)

〔IL-2〕

していた (Fig。3).

3)培 養上澄 中のサイ トカイ ン蛋 白量

OK-432添力『培 養 で は IL‐lβ,IL 6,TNF‐″ はいずれ も培 養 3時 間後 よ り著明 な上昇 を認 め,IFN‐γは 6時 01 3 6 12 c u k u r e d m e 6 1 2 culture time 47(1903) 間後 よ り上昇 を認 めた。PSK添 加培養 で は IL‐lβ,IL― 6,TNF― ″ はいずれ も OK‐432同様 3時 間後 よ り上昇 を認 めたが,い ずれ も OK‐432に比 べ低値 で あった。 IFN‐γは PSKで は24時間 まですべ て低値 であった. IL‐2は OK-432,PSKと もすべて測定 限度以 下 で あっ た (Table 3). 2.OK-432投 与症例 の末梢血単核球 にお けるサイ ト カイ ン mRNA誘 導の検討 1)筋 肉内投与例 投 与 12時間後 をみ た 9例 で は 6例 に IL-lβの誘 導 を認 め, 3例 に TNF― αの誘 導 を認 めたが,IFN‐γが 誘 導 された症例 は 1例 のみであった.一 方,投 与24時 間後 をみた 4例 の うち 2例 に IFN‐γの誘 導 を認 めた (Fig,4). 2)皮 内投与例 全 くサ イ トカ イ ンの 誘 導 を認 め な い症 例 を nOn_ responder,それ以外 を responderとした ところ,皮 内 投 与 3 4 例の う ち1 4 例が r e s p o n d e r , 2 0 例が ■o n _ responderで あった。この14例の responderの 中で IL‐ lβ,IL‐6,TNF‐ 2の 3つ のサイ トカイ ンを他症例 と比 べ強 く誘導 している症例 を 4例 認 めた.そ こで この 4 例 を high responder,他 の10例 を low responderと し た (Fig.5).high responderと した 4例 と,low re― sponderの うち IL‐lβ と TNF‐ 2の 2つ とも誘 導が み

Fig. 3 Quantitative analysis of the PCR products shown in Fig. 1 (a) by Southern blot hybridization. Numerical values of the vertical line stand for relative radioactivity. ４   ＞ だ ＞ ， ｏ ０ 〇 一つ ｏ ﹂ ︵ ャ_ｏ ３ ０ ｏ ﹂ ０   に Ｏ Ｌ ︶ ＞ 主 ＞ 事 ｏ Ｃ ｏ 一Ｏ Ｑ ﹂ ４ ＞ ︼一_＞ 中 石 ● ｏ 一 Ｄ 母 6 1 2 culture time 24(h) 01 3 6 1 2 2 4 ( h ) c u h u r e d m e ４   ＞ ︼一_＞ 一 も Ｇ 氾 ０ ロ

48(1904)

られ た 4例 の合計 8例 につ いて RT‐PCR産 物 のサ ザ ン ブ ロ ッ トを行 って,OK‐ 432投 与 前 後 の IL‐lβ と TNF‐ α mRNA発 現 の変化 をみた。投与後 の radio‐ acdvity値 を投与前 と比較す る と,high responder 4 例 の平均 で は,IL‐lβが5,7倍,TNF α が3.9倍 に増強

してい るの に対 し,low responder 4例 の平均 は IL‐1 βが2.2倍,TNFセ が1.9倍であ り,high responderは いずれ も low responderより明 らか に強 くサイ トカイ ンが誘導 されていた (Fig。6). 悪性疾 患29例で は, 4例 が high responder, 7例が 29巻 9号 l o w r e s p o n d e r , 1 8 例が n O n _ r e s p o n d e r であ り, 悪″性疾 患 と健 常 人 の 間 に respOnseの有 意 差 は な か った (Table 4)。また 胃癌症例 で進行度2の別 に responseの 差 を見 た ところ,high responderは Stage I症例 のみ で あったが,統 計学 的 には進行度 による有意差 は認 め な か った (Table 5).平均 年 齢 もhigh responderが 63.0± 10.2歳 , low responderが 65.4± 12.5歳 , nOn_ r e s p o n d e r が6 3 4 ± 1 1 . 2 歳で差 が なか った。

考 察

B R M に よ るサ イ トカ イ ン誘 導機 序 を解 明 す るた R T P C R 法 を用 いた b i o l o g i c a l r e s p o n s e m o d i n e r s 日消 外会誌

Table 3 The amount of cytokine protein,IL‐ lβ,IL-2,IL-6,TNF‐ α and IFN‐ γ, in the culture supernatants from OK 432 or PSK stimulated PBArIC,the same case as Fig l

(a)OK 432 culture time 0 1 3 IL lβ IL‐2 1L‐6 TNF-2 1FN一γ

剣

制

３ ５

奄

１

剣

制

３ ３

７ ６

Ｈ

８ ６ ０

制

３ ５ ３

２ ， ２ ５ ０

_Ｈ

1 1 , 0 0 0 <50 1,430 8,890 4 5 7 , 4 9 0 <50 3,850 15,000 130 8,410 <50 5,430 19,400 970 (pglml) (pglml) (pglml) (pglml) (U/ml)

Fig.4 Change of the mRNA expresslon for IL‐lβ,IL 6,TNF―α and IFN‐γ in PBMIC from patients with OK 432 intramuscular inJection.

IL-lβ lL-6 TNF― α lFN―γ

E=コ・・・

Cases examined after 12hours(n=9)

2 ・ ・・c a s e s e x a m i n e d a f t e r 2 4 h o u r s ( n = 4 ) (b)PSK culture time 0 1 3 6 IL lβ IL‐2 1L-6 T N F ‐ α I F N ‐γ <10 <50 <25 く5 1 4 く10 <50 く25 17 0 7 41 <50 112 55 0 4

４ ５

制

３ ９ ６

５ ６

阿

1 3 4 <50 726 51 0 4

３ ３ ７

制

３ ， ８ ４ ０

５ ４

門

(pglml) (pglml) (pglml) (pglml) ( U / m l )

1ee6+

e tr

Fig. 5 Cases of high responder, low responder and non-responder determined by cytokine mRNA induction pattern in patients with OK-432 intradermal injection.

49(1905)

トカイ ンには, 1時 間以 内 に mRNAの 発現 が増 強 す る IL‐lβ,IL‐6,TNF-2と ,遅 れ て増 強 す る IL‐2や IFN‐γの 2群 が あった。 ここで IL‐2と IFN,γ の産 生 細胞 は T細 胞 系 に限 られ るの に対 し,IL‐lβ,IL‐6, TNF‐ α はいずれ も単球 あ るい はマ クロフ ァー ジが主 な産生細胞 であ る ことを考 える と,OK 432に よ りまず 単球 が刺激 され て IL-lβ,IL 6,TNF‐ 2な どが産生 さ れ,続 いて これ らのサイ トカイ ンが T細 胞 を刺激 して IL‐_{2や IFN‐γが産 生 され る とい うカ スケー ド}2のに合 致 していた。 石 田 ら281はOK‐432が in vivoで効 果 的 に作用 す る 場 合,ま ず好 中球,次 い で マ ク ロ フ ァー ジ,さ らに helper T細 胞,killer T細 胞 とい う順 序 でエ フェク ター細胞 が sequentialにテ ンポ良 く出現 し,サ イ トカ イ ンに関 して はマ ク ロ フ ァー ジ まで の段 階 で は IL‐1 β,IL‐6,TNF,2が 関与 し,T細 胞 の段 階で は IL‐2や IFN‐γが関与す る としてお り, この ような 「sequence とtempo」 に従 ったエ フェクター細胞 とサ イ トカイ ン の流れが必 要であ る と述 べ てい る.著 者 らの in vitro の実験 系で は好 中球 は除 いてあ り,OK‐432は単球 を直 接刺激 してサイ トカイ ンを産生 させ た と考 え られ る。 デー タは示 していないが,さ らに単球 を除去 した系で もサ イ トカ イ ンの誘 導 はみ られ た。 こ の よ うに OK、 432の場 合,in vitroでは sequentialなエ フェクター細 胞 の出現 が な くて もサ イ トカカイ ンの誘 導 は起 こる も の と考 え られ る.癌 性 胸 膜 炎 や癌 性 腹 膜 炎 に対 す る OK‐432の胸腔 内,腹 腔 内投与 に著効 例 が多 いめつの は 胸腔,腹 腔 とい う閉鎖腔 が in vitroの培養系 に近 い状 態 にな り,サ イ トカイ ンの産生 が起 きやす く,ま たサ イ トカイ ンを高濃度 に保 ちやすいため と考 え られ る。 2.PSKの サイ トカイ ン mRNA誘 導台ヒ

PSKで は IL‐lβ,IL‐6,TNF‐ α mRNAは OK‐432 同様速 やか な誘 導が確認 されたが,TNF‐ 2 mRNAの 誘 導 は軽微 で あった。IL‐2と IFN‐γ mRNAは 少 な く

とも24時間 まで誘 導が確認 され なか った。HirOseら 2の は PBMCを PSK添 加培養 し,ノ ーザ ンブロッ トにて IL‐12,IL‐lβ,IL‐6,IL‐8,TNF― α mRNAの 誘 導 を 1時 間 以 内 に 認 め て い る が,IL‐2と lymphotoxin mRNAの 発現 は少 な くとも72時間 まで認 めず,著 者 らの結果 と同様 であった。したが って,PSKは 単球 を 活″性化 す るが Tリ ンパ球 は活性化 しない としてい る. 上 回 ら3のは IL‐2は36時間後 の培 養 上 澄 に弱 く認 め ら れた と報告 し,阿 部 ら31)はIFN‐γは 2日 目の培養上澄 で は じめて検 出 された と報告 してい る.こ れ らの こと - a + \ a o . , o , ' c,s *' *' ol* C high responder low responder non - responder b i before injection a :after injection

arrow iinduced cytokine mRNA after injection

め,in vitroに お け る各 種 サ イ トカ イ ン誘 導 を RT, PCRお よ び イ ム ノ ア ッセ イ を用 い て mRNAレ ベ ル

と蛋 白 レベ ル の両 面 か ら経 時 的 に解 析 した。 1 . O K ‐4 3 2 のサ イ トカイ ン m R N A 誘 導能

OK、432はこれ まで に IL 121ちIL‐221),IL‐62り,TNF‐ α2め_,IFN‐γ2り_{,csF2Dな ど多 くのサ イ トカイ ンの誘 導} が確 認 され,ま さにマ ル チサ イ トカイ ンイ ンデュー サーで あ るが,今 回の著者 らの検討 で も検索 したすべ てのサイ トカイ ン mRNAの 誘 導が確認 され た2o.蛋 白 レベ ル で は IL‐2の み検 出で きなかったが,こ れ は IL2 mRNAが PCRを 45サイ クル行 って よ うや く検 出 された ことを考 える と,イ ム ノア ッセイの測定 限界 以下 の微量 な産生 であ り,RT‐PCR法 の源」定感度 の高 さが示 された.

本研究 で,OK-432に よ りin vitroで誘 導 され るサ イ

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ゴ

50(1906) _{RT-PCR i*Affiu)/c biological response} modifiers 日消外会誌 29巻 9号

Fig. 6 Southern blot hybridization and quantitative analysis of the IL-18 and TNF-a PCR products in 4 cases of high responders and 4 cases of low respon-der.

〔

tL-lβ 〕

〔

TNF― α〕

high responder / ＼ Casc h 1 2 3 4 low rssponder 5 6 ? 8 h19h 「esponder / ＼ Case h , 2 3 4 low responder 5 6 7 8 ︵ 中_ｏ ぅ Ｏ ｏ ﹂ａ   に Ｏ Ｌ ︶ ＞ 〓 ＞ ， ０ ゃ ｏ 一や Ｇ ﹂ ︵ 一_ｏ う Ｏ_ｏ ﹂ｏ   に ０ ﹂ ︶ ＞ 〓 ＞ ，_ｏ ｏ ｏ 一Ｏ ｏ ﹂

b: before iniection a : after injection

before after

><: high responder e4: low responder

Table 4 Case number of high responder, low responder and non-responder in patients and healthy volunteers with OK-432 intradermal injection

Table 5 Case number of high responer, low responder and non-responder in patients with gastric cancer

high responder low responder non-responder

Stage I Stage II Stage III Stage IV 3 Ｎ ﹁ ︱ ︱ □ N.S. : not significant より, I L ‐2 と I F N ‐γは誘導されに くい もの と考 えられ るが, 本 研究での P S K は 2 例 しか行 っておらず, l o w r e s p o n d e r のP B M C で あった 可 能 性 が あ り, ま た P S K 濃 度や培養時間の問題 もあるため断定 はで きな ↓ゝ. 3.サ イ トカイ ンmRNA発 現 とサイ トカイ ン蛋 白 産生の関係 mRNA発 現 と培養上澄中の蛋白量の経時的関係 を みると,IL‐lβ,IL:6,TNF‐ αなど1時 間後 にすでに mRNA発 現が増強 していた ものでは,蛋 白は 3時 間 後 より上昇 した。 また IFN‐γは OK、432添加培養 3時 間後 よりmRNA発 現が増強 していたが,蛋 白は 6時 間後 より上昇 した。これ らのことより,mRNA発 現か

high responder low responder non-responder

f after l2hours Malignant disease _| (n=23) L _{after 24hours} ( n = 6 ) Benign disease (n=1) Healthy volunteer (n=4) 2 2 7 1 2 Ｓ Ｎ ﹁ ︱ ︱ □ Tctal (■ =34) 4 N.S.: not significant

1 9 9 6 年9 月 ら 1∼ 3時 間の タイム ラグを もって蛋 白が産生 され る もの と考 え られた.ま た蛋 白がすべ て測定限界以下 で あった IL‐2を除 いて は,RT PCRの 結果 とイム ノア ッ セイの結果 とはタイムラグを考慮 すれ ばすべて一致 し てお り,血 清 の影響 のない in vitroの系 で は mRNA 発現 と蛋 白産生 はパ ラ レルであ った. 4.RT‐ PCRに よる mRNA定 量法 RT‐PCRに よ る mRNA定 量 法 につ い て は諸 家 の 報告3寡3りが ぁ る。絶対 的定量が可能 とい う点で注 目さ れ る の は ヽVangら 32)ゃGillllandら3めが 行 った com‐ petitive PCR法で あ るが,こ の方法 はイ ンターナル ス タ ンダー ドの作 製 が必 要 であ り手技 が やや煩 雑 で あ る。デー タは示 していないが,著 者 らは,RTに 用いる RNAの _{濃 度 と内 部 ヨ ン トロール で あ る β‐}actin, GAPDHの RT、PCR結 果 を比較 し,こ れ ら 3者 の結 果がパ ラ レルであ る こと,す なわ ち内部 コン トロール が RNA濃 度 を反映 してい る ことを確認 した上 で,内 部 ヨン トロールのバ ン ドが均― で あ る もの について, 目的サ イ トカイ ンのバ ン ドの濃度 を比較 した。 この方 法 で は,目 的サ イ トカイ ンの mRNAの 発現 が多量 で PCR反 応 が プ ラ トー にな る と定量性 が失 われ る とい う欠点が あ るが,簡 便 に相対 的定量が行 える。 目的バ ン ドの濃度の測定 にはデンシ トメーター を用 いる方法 が簡便 で あ るが,エ チジウムブロマイ ド染色 の発光 に 余 り定量性 が ないので,正 確 な定量 には RI標 識 プ ラ イマー に よる PCRや サザ ンブ ロ ッ ト法 な どに よ り, ゲル上 の特定バ ン ドの測定が必要である。今回の RT‐ PCR産 物 のサザ ンブロッ トによる定量 で は,in vttro の経 時 的解析 にお け るサ イ トカイ ンの PCR反 応 が プ ラ トー あ るい はプ ラ トー に近 い状 態 と考 え られ るた め,ピ ー ク時 には もっ と多量 の mRNAが 発現 してい る もの と推測 され る。臨床症例 の higll responderにつ いて も同様 である. 5.OK 432投 与症例 にお けるサ イ トカイ ン mRNA 誘 導 in vivoで は BRM投 与 に よ り誘 導 され るサ イ トカ イ ンを検 出す る こ とは従来困難 であ り,BRMの 効 果 を NK活 性,リ ンパ球 サ ブセ ッ トな どを もとに判断す る こ とが多 かった3D∼3ゆが,RT‐ PCR法 に よ り微量 の サイ トカイ ン mRNAを 測定 で きる よ うにな り3り,新 たや重要 なパ ラメー ターが加 わ った。臨床例 に通常用 い る程度 の量の BRMを 筋 肉内,皮 内あ るい は経 口で 投与 し,末 梢血 にお けるサイ トカイ ンの誘 導 を とらえ るこ とは BRMに よるその個体 の全身的 な免疫賦活状 51(1907) 態 をみてい る と言 え,BRM療 法 の効 果判 定法 として 現 実的で ある。佐治 ら4のは担癌患者 に PSK lgを 単回 経 口投与 し,PBMCに お ける IL‐6 mRNAの 誘 導 をみ てい る。 また星野 ら41)は担癌 患者 に OK‐432 5KEを 皮 下投与 し,IL‐lβ,IL‐6,M、CSF mRNAの 誘 導 をみて い る。著者 らは臨床症例 に OK・432 2KEを 筋 肉内ある いは皮 内に投与 し,各 種 サイ トカイ ン mRNAの 誘 導 をみた。 筋 肉内投与 は症例数 は少 ないが,投 与 12時間後 をみ る と IL lβ,TNF‐ αの誘 導 され る症例 が多 く,24時 間 後 をみ る と IFN―γの誘 導 され る症例が多かった。これ はあ る程度 in vitroの結果 を反映 してお り,そ の理 由 として,筋 肉内投与 で は皮 内投与 によヒベ,OK‐ 432の周 囲へ の拡散 が比較 的速 やかであ るため末梢血 へ その効 果が 出やす く,単 球 か ら T細 胞 とい うカスケー ドが起 きやす い ことが上 げ られ る。 この ことは皮 内投与 で は OK‐432投与後 の発熱が あ ま りみ られ ないの に対 し,筋 肉内投与 で は投与後数時間で ほ とん どの症例 に一過性 の発熱 をみ る こととも関係 してい る と思われ る。発熱 の あ る投 与 4∼ 5時 間 後 を み れ ば,サ イ トカ イ ン mRNAの 発現 は12時間後 や24時 間後 よ り強 か った可 能′性が あ る。 一方,皮 内投与で注 目すべ きは,多 種のサイ トカイ ンが強 く誘導 され る症例 (high responder)の存在 で ある。 その誘導 の強 さは IL‐lβ と TNF‐ 2で み る と, それ ぞれ投与 前 の5。7倍,3.9倍 (平均)で あ り,low respoderの22倍 ,1.9倍 に対 し明 らか に高値 で あっ た。high responder 4例の うち 2例 は24時間後 をみた も の で,24時 間 後 で も な お IL‐lβ,IL‐6,TNF‐ α mRNAの 強 い発現 が維持 され ていた。この ことは,皮 内投与 で は OK‐432の拡 散 が遅 く筋 肉 内投与 の ような 急速 な反応 はみないが,長 く局所 で抗原性 を維持 し, マ クロファージな どの抗原提示細胞 に とらえられ細胞 性免疫 を賊活す る421ため と思われ る。残念 なが ら24時 間以 降 はみてお らず,IFN γ の誘 導,言 い換 えれ ば T 細胞 の活性化 まで至 ったか どうか確認 で きてないが, この ような症例が実際 の臨床 での responder,す なわ ち BRM療 法が有効 な症例 で はないか と予想 され る。 しか し,サ イ トカイ ンが強 く長期 に誘 導 され る症例が BRM療 _{法 が奏効 す る とい う証 拠 はな く,こ の結論 を} 出す には多 くの BRM療 法施行 患者 でサ イ トカイ ン誘 導 と治療 効 果 とを詳 細 に検 討 す る こ とが,き要 で あ ろ う。 年齢 や癌 の病期 は宿 主 の免疫能 に とって重要 な因子

52(1908) RT、PCR法 を用 ↓ゝた biological であ ろ うが,本 研究で は OK‐432に対 す る responseと 年齢,胃 癌 の進行度 お よび悪性疾 患 の有無 とは相 関が なか った。 これ には症例数が少 ない ことが理 由 として 考 え られ るが,BRMに 対 す る responseに ついて は個 体差 も 1つ の重要 な因子 と考 え られた。 6.BRM療 法の今後 BRM療 法 は宿 主 の もつ免疫能 を修 飾 す る こ とに よ り抗腫瘍効果 を期待 す る治療法 で, この宿 主介在性 と い う点で,手 術,放 射線,化 学療法 な どの他の治療法 とは性格 を異 に してい る。 したが って BRM療 法 を行 う場合,BRMに 対 す る responseの個体差 や宿主 の免 疫抑制状 態 な ど宿 主要因 を考慮 しな けれ ばな らない こ とは当然 で あ る。 ま た宿 主要因 だ けで はな く,腫 瘍側 要因 も考 える必要が あ る。 多 くの腫場 が種 々のサ イ ト カイ ンを産生 す る事が判 ってお り43ち腫瘍 の産生 す る サイ トカイ ンに よ り悪液質が もた らされ る44)45)ことも よ く知 られ て い る。サ イ トカイ ンを産 生 す る腫場 に BRMが お よぼす影響 は複雑 で ある と想像 され,個 々 の腫瘍 ご とに BRMの 適応 を考 える必 要が あ ろ う。 し か しなが ら,現 在 BRMの 保険適応 は,例 えば PSKな ら胃癌,大 腸癌,肺 小細胞癌 といった ように主 に臓 器 に よって規定 され てい る。 これ は非合理的であ り,宿 主 お よび腫瘍側 要因 を考慮 した適応 にすべ きであ ろ う が,そ の判定法 の確立 こそ今後 BRMが 癌治療 におい て重 要 な地 位 を占 めて い くた めの鍵 にな る と思 わ れ る。RT‐PCRを 用 いた PBMCに お けるサ イ トカイ ン mRNA検 _{出法 は,宿 主要因 を判定す る有用 な方法 で,} BRMに 対 す る responder,non‐responderの 選別 のみ な ら ず,BRM療 法 施 行 患 者 の 免 疫 賦 活 状 態 の monitoring,さ らに はそれ を通 じて患者個々の投与 量,投 与 間隔 な どの至適投与法決定 に も役立 つ もの と 思 われた。 稿 を終 えるにあた り,御指導,御校閲を賜 りました折田薫 三教授ならびに田中紀章教授に深甚なる謝意を表 します。 また,直接御指導,御教示頂いた岡林孝弘博士に深 く感謝申 し上げます。 なお,本 論文の要旨は第94回日本外科学会総会 (東京)な らびに第32回日本癌治療学会総会 (岡山)に おいて発表 し た。 文 献 1)藤 本修一,新 田和男 :免疫療法でなぜ CR,PRが とれないか ? 癌 と化療 17:459-463,1990 2)岡 正 郎,硲 彰 一,内山哲史ほか :各種 BRM併 用 ( C o m b i n a t i o n l m m u n o t h e r a p y ) によりC R と なった術後早期再発肝細胞癌の 1症 例.日 癌治療 response modiiers 日 消外 会誌 29巻 9号 会誌 26:1425-1428,1991 3)加 藤 一哉 ,草 野 満 夫,小 野寺 一彦 ほか :ポ ー タカ ッ トに よ る OK 432の 胸 腔 内投 与 が有効 で あ った癌 性 胸膜 炎 の 1症 例 .診 療 と新 薬 26:171-174, 1989 4 ) 武 越 裕 , 吉 田 憲 一 , 森 永 正 二 郎 : I m m u n o ‐ chemotherapyで 寛 解 した癌 性 胸 ・腹 膜 炎 の 2症 例 .癌 と化療 19:1466-1469,1992 5)星 野 孝 :BRMと QOL.Ther Res ll:2609-2 6 ll:2609-2 ll:2609-2 , 1 9 9 0 6 ) 鈴 島 慎 吾 :OK 432の QOL改 善 作 用 と神 経 内 分 泌 系 に対 す る作 用. T h e r R e s 1 4 : 4 8 1 6 - 4 8 2 2 , 1 9 9 3 7)坂 部 孝 ,藤 井雅志 ,高 松 和郎 ほか :進 行 胃癌 に対 す る OK 432の 効 果 ― Randomized Controlled s t u d y によ る 再 検 討 ―. 医 と薬 学 1 8 : 1 9 0 7 -1 9 -1 2 , -1 9 8 7

8)ヽ Vatanabe Y,Iwa T: Clinical values of im― munotherapy with the streptococcal prepara― tion()K-432 in non small celllung cancer」 Blol Resp NIOdif 6: 169--180, 1987 9)江 端 俊彰 ,戸 塚 守 夫,内 野純 一 ほか :進 行 胃癌 に対 す る レ ンチ ナ ンの 臨 床 効 果 .Biother 5:721-7 3 3 , 1 9 9 1 1 0 ) 山 田 昌弘,塚 本 東明 :腫 瘍 切 除 と化 学 療 法 で 9年 間 生 存 中 の D 2 肺 腺 癌 の 1 例 . 肺 癌 3 3 : 1 0 7 1 -1 0 7 5 , -1 9 9 3 1 1 ) C h o m c z i n s k i K , S a c c h i N : S i n g l e ‐step method of RNA isolation by acid guanidium

thiocyanate‐ pheno卜 chloroform extraction Anal Blochen■ 162:156-159, 1987

12)Chelly J,COncOrdet JP,Kaplan」 C et ali 11-legitilnate transcription:Transcriptlon Of any gene in any cell type Proc Nat12生 cad Sci USA 86:2617--2621, 1989

1 3 ) C l a r k B D , C o l l i n s K L , G a n d y W I S e t a l i GenOImic sequence for human prointerleukin l beta: possible evolution from a reverse tran― scribed prOinterleukin l alpha gene,Nucl Acids Res 14:7897--7914, 1986

14)Fuiita T,Takaoka C,酌 Iatsui H et al: Struc‐ ture of the human interieukin 2 gene Proc Natl Acad Sci USA 80: 7437--7441, 1983

15)Yasukawa K,Hirano T,ヽ Vatanabe Y et ali Structure and expression of human B cell stimulatory factor‐2(BSF‐ 2/1L‐6)gene EMBO J 6 : 2 9 3 9 - - 2 9 4 5 , 1 9 8 7

16)Nedwin GE,Naylor SL,Sakaguchi AY et al: Human lymphotoxin and tumor necrosis factOr genes i structure, homology and chromosOmal localization Nucleic Acids Res 13:6361-6373, 1985

1996年 9月

17)Patrick ヽ VG, David VGi Structure of the human immune interferon gene Nature 298: 859--863, 1982

18)Southern EAII: Detection of specinc sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis J Attol Bib1 98:503-517, 1975 1 9 ) T a n a k a K , I s h i k a w a E , O h t o m o Y e t a l i

Sandwich enzyme in■ munoassay for human interleukin-lβ in urine Clin Chim Acta 166: 237--246, 1987

2 0 ) 胃 癌研 究会編 :胃 癌取 扱 い規 約 .改 訂 第 12版.金 原 出版 , 東 京, 1 9 9 3 , p 1 6 - 1 7

21)Ichimura O,Suzuki S,Saito M et al: Augmen‐

tation of interleukin l and interleukin 2 produc‐ tion by OK‐432 1nt J ImmunOpharmaco1 7:263 --270, 1985

2 2 ) F u k u i H , K o i s h i h a r a Y , N a g a m u t a い 江 et al: Production of IL-6 by human spleen cells stimulated with Streptococcal preparation OK‐ 432 1mmunol Lett 21:127--130, 1989

23)Fllili M, Abo T, Kumagai K: Cytokines

produced by blood mOnOnuclear cells stilnulat‐ ed、vith the streptococcal preparation OK‐ 432: ettect on production by supplementing the medium with xenogeneic serumo Cancer lm‐ munol lmmunOther 27:97-102, 1988

24)Noda T,AsanO M,Yo軌 ie O et al: IFN‐ γ induction in human peripheral blood mononu‐ clear cells by OK‐ 432, a killed preparation of Streptococcus pyogenes 帥 Iicroblol lmmunol 30:81--88, 1986

2 5 ) H i r a o k a A , Y a m a g u c h i N I , O h k u b o T e t a l i Effect of a streptococcal preparation, OK‐432, on lnurine hematopoietic sten■cells Cancer Res 41 :2954--2958, 1981 2 6 ) 上 平裕 樹 ,岡 林 孝 弘,中 谷 紳 ほか :RT‐PCR法 を用 いた OK-432に よ るサ イ トカ イ ン mRNA誘 導 の 経 時 的 解 析 .医 の あ ゆ み 163:701-702, 1992 2 7 ) 市 村 修 ,鈴 木清 吉,斎 藤元 男 ほか :OK 432に よ るマ ウス i n t e r l e u k i n l および i n t e r l e u k i n 2 の産 生増 強作 用.医 の あゆみ 127:296-298,1983 2 8 ) 石 回名香雄 ,斉 藤元 男 :OK 432の 作 用機 序 をわれ わ れ はいか に解 明 して きた か ?Blother 4:155 --165, 1990

29)Hirose K,Zachariae COC,Oppenheim JJ et al: Induction Of gene expression and production Of ilnlnunomodulating cytokines by PSK in human peripheral blood monOnuclear cells. Lymphokine Res 9:475-483, 1990 3 0 ) 上 田祐 二,山 岸 久 一 ,内 藤 和 世 ほか :OK 432, P S K の I n v i t r o にお け る と 卜末 梢 Itt Tリンクヾ球 53(1909) 活性化機序の検討.Blother 4:712-716,1990 阿部康人,三 宅正純,堀 内 淳 ほか :ク レスチ ン (PSK)に よるサイ トカイ ンの誘 導.医 の あゆみ 152:617--618, 1990

ヽVang AM,Doyle MV,Mark DF: Quantita_ tion of mRNA by the polymerase chain reac‐ t i o n P r O c N a t i A c a d S c i U S A 8 6 : 9 7 1 7 - 9 7 2 1 , 1989

Gllllland G, Perrin S, Blanchard K et ali Analysis of cytokine mRNA and DNA:Detec‐ tion and quantitation by competitive polymer‐ ase chain reaction PrOc Natl Acad Sci USA 87: 2725--2729, 1990

A/1akino R,Sekiya T,Hayashi K I Evaluation of quantitative detection of nュRNA by the reverse transcription―polymerase chain reac‐ tion Technique 2:295--301, 1990

福 島松 郎,合 地 明 ,鯉 江 久 昭 ほか :Adiuvant lmmuno、chemotherapyに お ける宿主要因 に関す

る検討。 日外会誌 92:1241-1245,1991

/Jヽ尾芳R再:Blological Response Modiller(BRNI) の胃癌病巣周囲への局在注射 による所属 リンパ節 内 リンパ球 の免疫能 の変動.日 外会誌 92:293-302, 1991 緒方 裕 ,磯本浩晴,自水和雄 ほか :直腸癌 に対す る OK 432の 腫場近傍投与 による NK活 性増強効 果.日 消外会誌 24:2990-2995,1991

Gotoh K,Gouchi A,Akura Y et a■ Augmen‐ tation of cytotoxicity of tumor‐ inaltrating lymphocytes by blological response modiflers lnt J ImmunOpharmacol 13:485--492, 1991 中尾光善 :Polymerase chain reactionを用 いた 新 しい方法 による末梢血液 中の単核細胞 のサイ ト カイ ン mRNAの 解析.久 留米医会誌 54:106-114, 1991 佐治重豊,梅本敬夫,杉山保幸 ほか :宿 主要因か ら みた PSKの 適応 と作用機序解 明 に関す る検 討. B10ther 5:1996-2004, 1991 星野泰三,鈴木泰伸,足立 匡 ほか :担癌患者への OK 432投 与 による末梢血単核球分 画細胞 のサ イ トカイ ン mRNA誘 導.医 と薬学 29:851-852, 1993 星野 孝 :筋注か ら皮 肉注へ.Ther Res 9:635-644, 1988

Pekarek LA,Weichselbaum RR,Beckett MA et al: Footprinting of individual tumors and their variants by constitutive cytokine expres‐ sion patterns Cancer Res 53:1978-1981, 1993 01ifF A, Defos‐Jones D, Boyer M et alt Tumors secreting human TNF/cachectin induce cachexia in mice Cel1 50:555--563,1987 Strassmann G, Fong A/1, Kenney 」 S et al:

54(1910) RT‐PCR法 を用いた biological response modiners 日消外会誌 29巻 9号

Evidence for involvement of interleukin 6 in experimental cancer cachexia. J Clin Invest

89: 1681--1684, 1992

Analysis of Cytokine mRNA Induction by Biological Response Modifiers Using the RT.PCR Method

Hiroki Johira

First Department of Surgery, Okayama University Medical School

In order to elucidate the mechanism of cytokine induction by biological response modifiers (BRM), the expression of cytokine mRNA in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) cultured with OK-432 or polysaccharide K (PSK) was serially analyzed by the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. _{IL'l P,IL-6 and TNF-a mRNAs were induced within one hour after stimula.} tion. IL-Z and IFN-7 mRNAs were induced three hours later in OK-432-stimulated PBMC, whereas they were not induced tp to 24 hours later in PSK-stimulated PBMC. Production of cytokine proteins increased 1 to 3 hours after mRNA induction. It is important to consider various host factors when BRM therapy is employed. To investigate individual differences in response to BRM, cytokine mRNA induction in PBMC from OK-432-treated patients was analyzed. In 4 out of 34 intradermally injected patients, multiple cytokine mRNAs were strongly induced. We speculate that these patients may have shown good responses to BRM therapy.

Reprint requests: Hiroki Johira First Department of Surgery, Okayama University Medical School 2-5 1, Shikatacho, Okayama, 700 JAPAN