博 士 （ 医 学 ） 竹 本 法 弘
学 ttL 論 文題 名 .
Low expression of reversion‑mducing cysteine‑rich protein with Kazal motifs (RECK) indicates a shorter survival after resection in patients with adenocarcinoma of the lung
（肺腺癌におけるRECK の発現低下は切除後の予後不良因子である）
学位論文内容の要旨
【緒言】
放射線療法や化学療法の進歩にもかかわらず，非小細胞肺癌の最も有効な治療法は根治的切除である．
病期IB以上の症例に対しては術前あるいは術後の補助療法を加えて予後を改善する試みがなされている が，肺癌切除術後の5年生存率は本邦の2006年の集計でも61.6％に留まっている．肺癌治療の進歩のため には肺癌の浸潤・転移の分子機構を理解することが重要である。
悪性度の高い腫瘍細胞は容易に周囲組織へと浸潤・転移を来たすが、この過程で細胞外基質の分解が 必要とな る。細胞 外基質 を分解する酵素のーっにマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)があるが、
これはコラーゲンなどの細胞外気質に対して広い分解活性を持っており，過去の報告でも癌の浸潤・転 移に重要 な役割を 持って いるとさ れてい る。生理 的環境 ではnMPなどのMMP抑制 因子がMMPの働きを 調整している． RevelIsion￣induc血gcystコeむleボch卩魍mwimぬZalmot砥凪ECK）はMMP抑制因子のひとっで あり、MMP‐2，MMP一9，Mへ佃‐14Mrl‐MMP）の活性を抑制し、腫瘍における血管新生や浸潤・転移を抑制 することが知られている。各種臓器癌におけるRECKの発現が研究されており、多くは予後との相関を 認めている。非小細胞肺癌においても、免疫染色によるRECKの発現と予後に関する研究はなされてい るが、RECKの標的であるMMP−2，MMP‐9，MMP−14との関係は不明である。そこで本研究でf弧也CKにく わえMMP一2，MMP一9，MMP114の発現を麒d‐timeRT‐PCRで定量的に解析し、様々な臨床病理学的因子や予 後との関連を検討した。
【対象と方法】
北海 道大学病 院腫瘍 外科およ びその 関連施設 において2001年5月から2005年5月までに組織提供の 同意が得られ治癒切除された、肺腺癌46例と肺扁平上皮癌37例および正常肺組織20例を対象とした。
すべての組織は癌細胞のみならず、その周囲組織における発現も含めて検討するために、マイクロダイ ゼク ションは 行わな かった。 得られた 切除組 織から全RNAを 抽出し、 逆転写 を行ってcDNAを得た。
対象 とする遺 伝子はRECK，MMP‑2，MMP‑9，MMP‑14の4遺伝子と し、こ れらに特 異的なプライマーを 設計した。この特異的プライマーを用いて定量的リアルタイムPCRを行った。得られた発現量は内因性 コン トロール として 用いたロ ‐アクチ ン遺伝 子の発現量に対する相対比とした。統計学的解析には
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StatView5.0 を用いた。各遺伝子の発現量によってそれぞ加低発現群と高発現群の二群に分けた。二群間 の比較にはStudents t‑test, Mann‑WhitneyUtest を用い、各臨床病理学的因子との比較にはthe 婬 test, Fisher seXactte 蚊を用いた。さらに、生存曲線はKapl 卸lMcicr 法を用い、予後の解析にはlog 瑚nkteSt を 用いた。予後因子の解析にはCox 珊 ivdab ーslon 孤alySis を用いた。
【結果】
RECK の発現は腺癌， 扁平上皮癌ともに正常組織よりも低発現であった（ p く 0.01 ）。 MMP‑2 での正常 組織と腺癌の聞を除き 、MMP‑2 ， MMP‑9 ，MMP‑14 では正常組織に比べて腺癌，扁平上皮癌での発現が高 くなっていた（p く 0.01 ）。また、腺癌と扁平上皮癌との比較ではRECK では発現に差が見られなかったが、
MMP‑2 ， MMP‑9 ， MMP‑14 で は 扁 平 上 皮 癌 で 発 現 が 高 く な っ て い た （ p く 0.01 ） 。 RECK の発 現量 で二 群に 分け て、 臨床 病理 学 的因 子と 比較 した とこ ろ、 腺癌においてINM 分類のT 因子と病期の進んだ群 とRECK 低値群に有意な相関が見られた（p く0.01 ）。扁平上皮癌では高齢者群と RECK 低 値群 に有 意な 相関 が認 めら れた （p く 0.01 ）が，他の因子とRECK に相関は見られな かった。
無再発生存期間を各遺伝子の発現量を含めて臨床病理学的因子を用いて単変量解析で検討したところ、
腺癌ではRECK 低発現群 （p 一く0.05) 、 MMP‑14 低発現群（ p く0.05) 、TMN におけるI2 群（ p く jo.05) が予 後不良因子であった。一方、扁平上皮癌ではいずれの因子も予後に差は見られなかった。また、腺癌に お い て RECK 高 発 現 群 が 低 発 現 群 に 比 し 無 再 発 生 存 率 が 高 か っ た （ p く 0 ． 05 ） 。 さら に、 MMP‑2 ， MMP‑9 ，MMP‑14 とその抑制因子であるRECK の発現量の比で無再発生存期 間にっい て 検討 した 。単 変量 解析 では 各MMP/RECK の 高 値群 と低 値群 との 間に 差は 見られず、扁平 上皮癌の MMP‑14/RE くニ K を除 き低値群での 無再発生存率が高い傾向にあったが、有意差は見られな かった。
【考察】
本研究では、肺腺癌・扁平上皮癌でのRECK の発現 が正常組織に比べ低発現となっており、さらには 肺腺 癌においては進行した 癌では RECK の発現が低下しており、RECK の発現が低いも ので予後が不良 であることを明らかにした。
各種臓器癌とRECK との報告でも正常組織に比べて 癌での発現は低下しており、発現が低下した群で の予後は不良となっていた。非小細胞肺癌でも同様の報告が免疫染色によりなされている。本研究では 定量性に優れるりアルタイム PCR を用いて同様のことを証明した。さらに加えて 、RECK の標的である MMP‑2 ， MMP‑9 ，MMP‑14 の発 現もあわせて検討し、RECK との関連も検討した。腺癌で は過去の報告同 様にRECK の低発現群での無再発生存率が低かったが 、扁平上皮癌では有意差は見られなかった。これ は、各 MMP の発現量が扁 平上皮癌では正常組織・腺癌よりも非常に高くなってお り、扁平上皮癌の高 発現 群に おい ても MMP を 阻害 する のに十分なRECK の発現がなかったためではないか と考えられた。
その こと を証 明す るた めに 、 MMP とRECK の発現量比での検討も加えた。その結果か らは有意差まで は見 られなかったものの、 各 MMP/RECK の低値の群での無再発生存率が高くなる傾向 を認めた。その 他の 要因 とし ては 本研 究で は mRNA で の発 現を 検 討し てお り、 RECK や MMP の 蛋 白発 現お よび活性ま では検討しておらず、m 賦 A の発現がこれらと相関し ていない可能性も考えられ、今後の検討課題であ る。
ま た、RECK と予後との関 連から、RECK の発現を増加させることで予後を改善でき る可能性も考え
ら れ る 。 d ） B2 は 珊） AC1 及ぴ Sp1 を 介し てRECK の 発現 を抑 制す る が、 この m へ C1 の 阻害 剤で あ る
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trichostatinA を用いることで、RECK の発現を増加さ せることが知られている。同様にNSAIDs もRECK の発現を増加させることが知られている．これらを用いることで予後の改善にっながる可能性がある。
し か し 、 こ れ ら に っ い て も ま だ 研 究 は な さ れ て お ら ず 、 検 討 が 必 要 と 思 わ れ る 。
【 結語】
RECK の 発現低下は肺腺癌切除例の予後不良因子である．
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学位論文審査の要旨
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Low expression of reversion‑inducing cysteine‑rich protein with Kazal motifs (RECK) indicates a shorter survival after resection in patients with adenocarcinoma of the lung
（肺腺癌におけるRECK の発現低下は切除後の予後不良因子である）
放 射 線 療法 や 化 学 療 法の 進 歩 に も かか わ ら ず ， 非 小細 胞 肺 癌 の 最も 有 効 な 治 療法 は 根 治 的切除 である 。 病 期lB以 上の 症 例 に 対 して は 術 前 あ るい は 術 後 の 補 助療 法 を 加 え て予 後 を 改 善 する 試 み が なされ ている が 肺 癌 切 除 術 後の5年 生 存 率は本 邦の2006年の集 計でも61.60'/0に 留まっ ている 。肺 癌治療 の進歩 のため には 肺 癌 の浸 潤・転 陟の分 子機構 を理解 する ことが 重要で ある。
悪 陸 度 の高 い 腫 瘍 細 胞は 容 易 に 周 囲組 織 へ と 浸 潤 し転 移 を 来 た すが 、 こ の 過 程で 細 胞 外 基質の 分解カ 泌 要 と な る 。 細 胞 外 基 質 を 分 解 す る 酵 素 の ー っ に マ ト リ ッ ク ス メタ ロ プ ロ テ ア ーゼ(MMP)が あ る が 、こ れ は コ ラ ー ゲ ンな ど の 細 胞 外 気質 に 対 し て 広い 分 解活性 を持っ ており ，過 去の幸 艮告で も癌の 浸潤 ・転移 に重 要 な 役 割 を 持 っ て い る と さ れ て い る 。 生 理 的 環 境 で はrIMPな ど のMMP抑 制 因 子 がMMPの働 き を 調 整 し て い る． Reversion‑inducing cysteine‑rich protein with Kazal motifs (RECK)はMMP抑制因子のひとつであり、
MMP‑2，MMP‑9，MMP‑14 (MTl‑MMP)の 濳 陸 を 抑 制し 、 腫 瘍 に おけ る 血 管 新 生 や浸 潤 ・ 転 移 を抑 制 す る こ と が 知 ら れ て いる 。 各 種 臓 器 癌に お け るRECKの 発 現が 研 究 さ れ てお り 、 多 く は 予後 と の 相 関を 認めて いる。
非 小 細 胞 肺 癌 に お い て も 、 免 疫 染 色に よ るRECKの 発 現 と予 後 に 関 す る研 究 は な さ れ てい る が 、RECKの 標 的 で あ るMMP‑2，MMP‑9，MMP‑14と の 関 係 は 不 明 で あ る 。 そ こ で 本 研 究 で はRECKに くわ えMMP‑2, MMP‑9 MMP‑14の発 現をreal‑time Rr‑PCRで 定； 丑的に 解析し 、様々 な臨床 病理 学的因 子や予 後との 関連 を検討 した。
北 海 道 大 学 病 ｜ 兜1圃 薨 外 科 およ び そ の 関 連施 設 に お い て2001年5月 か ら2005年5月 まで に 組 織 提 供の 同 意 が 得 ら れ 治 癒 切 除 さ れ た 、 肺 腺 癌46例 と 肺扁 平 上 皮 癌37例 お よ び 正常 肺 組 織20例 を 対 象 と した 。 す べ て の 組 織 は 癌細 胞 の み な ら ず、 そ の 周 囲 組織 に お け る 発現 も 含 め て 検討 す る た め に 、マ イ ク口 ダイゼ クシ ヨ ン は 行 わ な か っ た 。 得 ら れ た 切 除 組 織 か ら 全RNを 抽 出 し 、逆1云 写 を 行っ てcDNAを 得 た 。 対象 と す る 遺 伝 子 はRECK, MMP‑2，MMP‑9，MMP‑14の4泄 臨 汗 と し 、 こ れ ら に 特異 的 な プ ラ イ マー を 設 計 し た。 こ の 特 異 的 プ ラ イ マ ー を 用 いて 定 量 的 リ アル タ イ ムPCRを 行 っ た 。得 ら れ た 発 現埜 は 内 因 性 コン ト ロ ー ル とし て 用 い た ロ ．ア ク チ ン 遺伝 子の 発現量 に対す る相対 比とし た。 統計学 的解析 にはStatView5.0を用い た。各 遺 伝 子 の 発 現 量に よ っ て そ れ ぞれ 低 発 現 群 と高 発 現 群 の 二群 に 分 け た 。二群 間の比 較に はStudent's t‑test, Mann‑WmmeyU忙stを 用い 、 各 臨 床 病理 学 的 因 子 との 比 較 に は 出squaIe蠍鴫Fisher seXactteStを用 いた 。さ −301
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主
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ら に 、生 存 曲 線 はKapl紐 ．Meier法を 用 い 、 そ の比 較 に はlo餌anktestを 用 いた 。 予 後 因 子の 解 析 には（ 淑 uniVaria忙 瑚舛 蚓onanalys轟 を用い た。
RECKの 発現 は 腺 癌 ， 扁平 上 皮 癌 と も に正 常 組 織 よ りも 低 発 現 で あっ たQくO．01） 。Mへ 佃 ・2での 正常組 織 と 腺癌 の 間 を 除 き 、MMP‐2，MMPう，MMP＿14で は 正 常 組織 に 比 べ て 腺癌 ， 扁 平 上 皮癌 で の 発 現が 高くな って いた（pく0．01）。ま た、 腺癌と 扁平上 皮癌と の比較では心℃Kでは発現に差が見られなかったが、MMP−2． MM田．9，MMP．14では 扁平上 皮癌で 発現が 高く なって いた（pく0．01）。
心！CKの 発 現量 で 二 群 に 分け て 、 臨 床 病理 学 的 因 子 と比 較 し た と こ ろ、 腺 癌 に お いて 冊 瓜I分 類のT因子 で 病 期の 進 ん だ 群 と 心！CK低 値群 に 有 意 な 相 関が 見 ら れ た （pく0．01） 。 扁 平 上皮 癌 で は 高 齢 者群とRECK 低 値 群 に 有 意 な 相 関 が 認 め ら れ た （pくO．01） が ， 他 の 因 子 と 耻 ℃K発 現 量 に 相 関は 見 ら れ な か った 。 無再 発 生 存 期 間を 各 遺 伝 子 の発 現 量 を 含 め た臨 床 病 理 学 的因 子 を 用 い て単 変 量 解 析 で検 討 し た ところ 、 腺癌 では耐 ミ（ニK低 発現群 （pく0．05） 、MMP‐14低発 現群（pく0．05）、n噺に おけ るT2群（pく0．05）が予 後 不 良因 子 で あ っ た 。つ 亨 、 扁 平 上皮 癌 で は い ずれ の 因 子 も 予後 に 差 を 認 め なか っ た 。 ま た、 腺 癌に おい て魁 巛高発 現群が 低発 現群に 比し無 再発生 存率 が高か った（pくO．05）。
さ ら に 、MMP‐2，MMP一9，MMP‐14とそ の 抑 制 因 子 であ るRECKの 発 現 量 の比 で 無 再 発 生存 期 間 に つ い て 検 討 し た 。 単 変 量 解 析 で は 各Mヘ ロ 侭I三 （ ニKの 高 値 群 と 低 値 群 と の 間 に差 は 見 ら れ ず、 扁 平 上 皮 癌の MMP−1伽 也 （ ニKを 除 き 低 値 群 で の 無 再 発 生 存 率 が 高 い 傾 阿 に あ っ た が 、 有 意 差 は 見 ら れ な か っ た 。 本研 究 で は 、 肺腺 癌 ・ 扁 平 上皮 癌 で の 甜 ミCKの 発 現 が正 常 組 織 に 比 ベ低 発 現 と な って お り 、 さら には肺 腺 癌 に お い て は 進 行 した 癌 で は 心 ミ （Xの 発 現 が 低下 し て お り 、心KXの 発 現が 低 い も の で予 後 が 不 良 であ るこ とを明 らかに した 。
各 種 臓 器 癌 とRECKと の 報 告 で も 正 常 組 織 に 比 ぺ て癌 で の 発 現 は 低下 し て お り 、発 現 が 低 下 した 群 で の 予 後 は不 良 と な っ て いた 。 非 小 細 胞肺 癌 で も 同 様の 報 告 が 免 疫染 色 に よ り な され て い る 。 本研 究 では 定量 性 に 優れ る り ア ル タ イムP（ 沢 を用い て同様 のこ とを証 明した 。さら に加 えて、 心！CKの 櫟的 であるMMP‐2、 MMP・9．MMP．14の 発現 も あ わ せ て検 討 し 、 触 ℃Kと の 関 連 も検 討 し た 。 腺癌 では 過去の 報告同 様に心 ミ（X の 低 発 現 群 で の 無 再 発 生 存 率 が 低 か っ た が 、 扁 平 上 皮 癌 で は 有意 差 は 見 ら れな か っ た 。 こ れは 、 各MMP の 発 現量 が 扁 平 上 皮 癌で は 正 常 組 織・ 腺 癌 よ り も非 常 に 高 く なっ て お り 、 扁 平上 皮 癌 の 高 発現 群 にお いて もMMPを 阻 害 す る の に 十 分 な 心 ミCKの 発 現 が な か っ た た め で は な い かと 考 え ら れ た。 そ の こ と を 証明 す る た め に 、MMPとRECKの 発 現 量 比 で の 検 討 も 加 え た 。 そ の 結 果 か らは 有 意 差 ま では 見 ら れ な かっ た も の の 、 各MMP｜ 侭ECKの 低 値の 群 で の 無 再 発生 存 率 が 高 くな る 傾 向 を 認め た 。 そ の 他の 要 因 と し て は本研 究で はmRNAで の 発 現 を 検 討 し て お り 、 心 ミCKやMMPの 蛋 白 発 現 お よ び 活 性 ま で は 検 討 し て お ら ず 、mRNA の発 現がこ れらと 相関 してい ない可 能陸も 考え られ、 今後の 検討課 題であ る。
また 、RECK発 現 ， 冊 と予 後 と の 関 連 から 、RE（Xの 発 現 を 増加 さ せ る こ とで 予後を 改善で きる 可育旨 陸も 考 え ら れ る 。e出B2はHDAC1及 びSp1を 介 し て 魁 ！ （ ニKの 発 現 を 抑 制 す るが 、 こ のHDAC1の 阻害 剤 で あ る mchom曲Aを 用 い る こ と で 、 心 ニ （Xの 発 現 を 増 加 さ せ る こ と が 知 ら れ て い る 。 同 様 にNS´ ゆsも 耻 巛の 発 現 を増 加 さ せ る こ とが 知 ら れ て いる 。 こ れ ら を用 い ること で予後 の改 善にっ ながる 可育旨 陸があ る。 しか し 、 こ れ ら に つ い て も ま だ 研 究 は な さ れ て お ら ず 、 さ ら な る 検 討 カ ミ 必 要 と 思 わ れ る 。 口 頭 発 表 に 続 い て、 副 査 今 村 教授 よ り 、MMP‐14にお け る 過 去 の 報告 と の 差 異 、扁 平 上 皮 癌 と腺 癌 で の 結 果 の角 袖fkさ らに 細 か し ゝ 病期 分類で の心三CKの発 現jltとの相 関につ いて 質問が あった 。副査 近蕨教 授よ り 、 扁 平 上 皮 癌 で のMMPの 発 現 亢 進 、MMP． 恥 ミCKの 生 体 内 で の 漕 陸 に つ い て 質 問 が あ っ た。 ま た 、 副 査 守 内 教 授 よ りRE（Xの ヒ ト と マウ ス の ア ミ ノ酸 配 列 の 相 同性 、 他 の 報 告 での 解 听 方 法 、今 回 検 討 の 因子 以 外 の予 後 関 連 因 子 、心 ！CKの発 現 を 亢 進 さ せる 方 法 に つ いて 質 問 が あ った 。 最 後 に 主査 秋 田 教 授より 、 RECKの 正 常 肺 お よ ぴ 囈 に お け る 由 来 細 胞 、REくKの 癌 に お け る 発 現低 下 機 序 、Mヘ ロ ・ 心 ℃Kの 発 現 量 の ス コ ア化 と 予 後 の 関 係に つ い て の 質問 が あ っ た 。い ず れ の 質 問に 対 し て も 、 申請 者 は 主 旨 をよ く 理解 し自
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らの研究データと文献 的時察を混じえて適切に回 答した。
審査員一同は、これ らの成果を高く評価し、大学院課程における研鍛や取得単位なども併せ申請者が博 士（医笥の学位を受け るのに充分な資格を有する と判定した。
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