博 士 （ 医 学 ） 川 原 田
陽
学位論文題名
Inhibitory Effects of the Antiang10genlCAgent TNP
・4700nEstablishmentandGrowthofHematogenouSMetaStaSiSOfHumanPanCreatiC CarcinomainSCIDBeigeMiceInVivo
（
SCIDbeige
マウスを用 いたヒト膵 癌の血行性 肝転移モデ ルにおける，血管新生阻害剤
TNP
・470
の，転移成立および転移増殖に対する抑制効果）学位論文内容の要旨
I
．目的膵癌は予後不良の癌として知られるが、その大きな原因として高率の肝転移があげられる。
よって膵癌の予後向上のためにはその転移増殖を抑制する新しい手段の開発が望まれてい る。一般に癌の血行性転移の形成過程において、転移先臓器に到達した腫瘍が微小転移巣 を形成し、さらに直径数
mm
以上の臨床的に検索できる結節径まで増殖するためには、腫 瘍血管の新生を必要としている。よって血管新生を阻害することは、転移結節の増殖を抑 制し新しい癌治療法のーっとなる可能性を秘めている。近年、腫瘍の血管新生機構につい て盛んに研究が行われており、血管新生を阻害することによる抗腫瘍効果が報告されてい る。そこで我々は当教室で手術材料より樹立したヒト膵癌細胞培養株(PCI‑43)
を用いて、血管新生抑制剤TNP‑470をSCIDbeigeマウス脾注肝転移モデルに投与して、転移抑制効果に ついて検討し新しい膵癌治療法としての可能性を模索した。
II
．材料および方法1
）膵癌肝転移モデルにおけるTNP‑470
の転移抑制効果ヒト膵癌細胞株PくニI‑43を6週齢から12週齢のSCIDbgマウスの脾臓にixi06個脾注して作成 した肝転移モデルに血管新生阻害剤TNP‑470を移植当日より30mg瓜g、隔日で皮下注した。
6
週後および10週後にマウスを犠牲死させて肝を摘出し、組織学的に肝転移結節を検索し た。肝転移結節数の評価には、肝組織切片上の肝転移結節数と結節径を顕微鏡下にカウン トし、Enzma
皿、Bannaschらが1987年に報告した計算式を用いて、単位体積あたりの肝転 移結節数を算出して比較検討した。2
）肝転移腫瘍細胞の増殖性とアポトーシスの評価転移結節に対し、pr01血
ra
曲gceunuclearandgen（以下PCNA）染色、およびTdトmemated
dUrPbiothlnickend
一labelhg（以下n贓L
法）を行い、PCNp染色において約500個カウン トした腫瘍 細胞中の染 色陽´陸細 胞の比率をPCNAindex
、およびn
贓L
染色において約1000
個カウントした腫瘍細胞中の染色陽性細胞の比率をapopto此indexとして比較検討した。3） inviuoにお けるTNPー470の 増殖抑 制効果
TNP‑470をHUVEC (Human umbilical vein endoffieLial cell)およびPCI一43の培養上清中に添加し、
各細胞の 増殖性をCell Counting KitsRを用いて 測定し た。
4） TNP・470のVEGF産生性に 対する 効果
PCI−43の 培 養 上 清 中 にTNP‑470を 添 加 し 、PCI‑43か ら 放 出 さ れ る 血 管 新 生 因 子 のー つ で あ るVEGFくvascular endothelial growth factor)の 産 生 性 をELISAを 用 い て 測 定 し た 。 5） In vivoに お け るPCI‑43に よ っ て 誘 導 さ れ た 新 生 血 管 に 対 す るTNP‑470の 抑 制 効 果 PCI‑43、1X107個をpore size 0.45メmのdiffusion chamberに い れ、SCIDbgマウ ス の 皮下 に埋 め 込 み 、TNP‑470、30mg/kgを 隔 日 で 皮 下 注 し た 。6日 後 に 皮 下 に 誘 導 さ れ る 新 生 血 管 を 観 察した。
III．結果
1）肝転移結節数におけるTNP‑470の効果
6週 投 与 群で は 、Control群 （n〓9） で371.0+287.7( /cm')で あ った の に 対し 、TNP‑470投与群
（n＝7）では23.2土8.8（／cm ）であった。10週投与群では、Control群（n＝6）で196.9土99.1（／弧っ、
TNP―470投与 群くn＝6） では36.0土24.6（/cm ）であ った。6週、10週いずれ の投与 群におぃ て も、TNP‑470投与によって著明な転移抑制効果が認められた。
2）肝転移結節最大径におけるTNP‑470の効果
6週 投 与 群 で はControl群 、TNP‑470投 与 群 の 間 に 差 を 認 め な か っ た 。 一 方 、10週 投 与 群 で は 、Control群 の 転 移 結 節 が6週 投 与 群 に 比 較 し て さ ら に 増 大 し て い た の に 対 し 、TNP‑470 投与群では転移結節の発育増大が抑制されていた。
3） PCNAindex、Apoptotic indexにおける検討
PCNA染 色 性 に お け る 検 討 で は 、6週 、10週 投 与 群 と もTNP‑470投 与 群 で 有 意 にPCNA index の 低 下 が 認 め ら れ た 。 一 方 、TUNE， 染 色 性 に お い て は 、PCNA indexと は 逆 にTNP・470投 与 群 に お い て 6週 、 10週 投 与 群 共 ， 有 意 に Apoptotic indexの 上 昇 が 認 め ら れ た 。 4） In‑vitroにおけるTNP‑470の増殖抑制効果
TNP‑470はO.lng／m1か ら1000n飢n亅 の 濃 度 範 囲 でHrVECの 増殖 を 有 意に 抑 制 した 。 し かし 、 同 濃 度 範 囲 で 、 膵 癌 細 胞 株PQ−43に 対 し て は 直 接 の 増 殖 抑 制 は 認 め ら れ な か っ た 。 5）TNP‐470のVEGF産生性に対する効果
nロ ‐ 470は4） と 同 様 の 濃 度 範 囲 で PCI‐43のVEGFの 産 生 に は 影 響 を 与 え な か っ た 。 6）Invivoに お け るnロ ‐470のPCI‐43に よ っ て 誘 導 さ れ た 新 生 血 管 に 対 す る 抑 制 効 果 Conロol詳 に 比 較 し 、nロ ‐470、30m凹 昭 を 隔 日 で 皮 下 注し た 群 ではPCI・43によ っ て 誘導 さ れる新生血管の抑制が認められた。
7）冊岬470の副作用
TNP‐470投与群では全例著明な体重減少が認められた。
IV.考 察
血 管 新 生 阻 害 剤TNP‑470は 各 種 の 動 物 、 ヒ ト の 固 形 癌 に お い て 転 移 抑 制 効 果 が 報 告 さ れ て い る 。 そ の 作 用 は 腫 瘍 血 管 の 新 生 を 阻 害 す る こ と に よ り 転移 先 臓 器に 到 達 し た腫 瘍 細 胞が micrometastasisの 状 態 を 越 え て 増殖 す る のを 抑 制 する 点 に あ る。 膵 癌 にお い て は臨 床 的 に 肝 転 移 が 術 前 、 術 中 に 認 め ら れ て い な い 症 例 で も 実 際 に は顕 微 鏡 レベ ル で の 転移 巣 は かな り の 高 率 で 存 在 し て い る と 考 え ら れ 、 そ の 微 小 な 転 移 巣 の増 大 を 抑制 す る 血 管新 生 阻 害剤 は 膵 癌 転 移 に 対 す る 有 効 な 治 療 法 と な る 可 能 性 を 秘 め て い る 。 今 回 の 検 討 で は 、TNP‑470 を 投 与 し た 群 で は 、 膵 癌 肝 転 移 が 抑 制 さ れ て 、 腫 瘍 細 胞 には 増 殖 の抑 制 と ア ポト ー シ スの
‑ 189―
亢進が生じていた。また、TNP‑470は、実験に用いた腫瘍細胞の増殖性や、VEGF産生能 に直接の抑制効果を持たず、In vivo実験において腫瘍細胞によって誘導される血管新生を 阻害したことから、今回観察された転移抑制効果は血管新生阻害作用を介したものである と思われた。これらから、実際の膵癌治療の臨床においても、血管新生阻害による転移抑 制効果が期待できると考えられた。
V
．結語膵癌細胞株PCI・43をSC]Dbgマウスに脾注した肝転移モデルにおいて、TNP‑470投与群では 肝転移結節数の減少および転移結節の発育増大抑制効果が認められ、腫瘍細胞の増殖の抑 制とアポトーシスの亢進が示唆された。
これらからTNP―470よる血管新生阻害は膵癌肝転移を制御する手段として有望であると考 えられた。
学 位論文審査の要旨
Inhibitory Effects of the Antiangiogenic Agent TNP‑470 0n Establishment and Growth of Hematogenous rvIetastasis of Human Pancreatic Carcinoma in SCID Beige INtIice In Vivo
(SCID beige
マウスを用いたヒト膵癌の血行性肝転移モデルにおける，血管新生阻害剤TNP‑470の，転移成立および転移増殖に対する抑制効果）
癌 の 血行 性 転 移の 形 成 過程 に お いて 、 転 移先 臓 器 に到 達 し た 腫瘍 が 微 小転 移 巣 を形 成 し 、 さ ら に 直 径 数mm以 上 の 臨 床 的 に 検 索 で き る 結 節 径 ま で 増 殖 す る た め に は 、 腫 瘍 血 管 の 新 生 を 必 要 と し て い る 。 よ っ て 血 管 新 生 を 阻 害 す る こ と は 、 転 移 結節 の 増 殖を 抑 制 し、 新 し い 癌 治 療 法 の ー っ と な る 可 能 性 を 秘 め て い る 。 そ こ で 我 々 は 当 教室 で 手 術材 料 よ り樹 立 し た ヒ ト 膵 癌 細 胞 培 養 株(PCI‑43)を 用 い て 、 血 管 新 生 阻 害 剤TNP‑470をSCIDbeigeマ ウス 脾 注 肝 転 移 モ デ ル に 投 与 し て 、 転 移 抑 制 効 果 に つ い て 検 討 し 、 新 し い膵 癌 治 療法 と し ての 可 能 性を模索した。
膵 癌 肝 転 移 モ デ ル はPCI‑43をSCIDbeigeマ ウ ス の 脾 臓 に1x106個 脾 注 し て 作 成 し 、 血 管 新 生 阻 害 剤TNP‑470 30mg/kgを 移 植 当 日 よ り 、 隔 日 で 皮 下 注 し た 。6週 後 およ び10週 後 に マ ウ ス を 犠 牲 死 さ せ て 肝 を 摘 出 し 、 組 織 学 的 に 肝 転 移 結 節 を 検 索 した 。 肝 転移 結 節 数の 評 価 に は 、 肝 組 織 切 片 上 の 肝 転 移 結 節 数 と 結 節 径 を 顕 微 鏡 下 に 算 定 し、Enzm annら が1987年に 報 告 し た 計算 式 を 用い て 、 単位 体 積 あた り の 肝転 移 結 節数 を 算 出 して 比 較 検討 し た 。ま た 、 転 移 結 節 に 対 し 、PCNA染 色 お よ びTUNEL法 を 行 い 、 染 色 陽 性 細 胞 の 比 率 を そ れ そ れ PCNA indexヽapoptotic indexと し て 比較 検 討 した 。 さ らに 、TNP‑470の 肝 転移 に 対 す る効 果 が 実 際 に 血 管 新 生 阻 害 に よ る も の で あ る か 否 か をin vitroで の 増 殖 抑 制 効 果 、VEGF (vascular endothelial growth factor)の産生抑制効果、およぴdiffusion chamberを用いたin vivoて の 血 管 新 生 抑 制 効 果 を 見 る こ と に よ り 検 討 し た 。 ま た 、TNP‑470の 副 作 用 と し て 体 重 変 化 についても検討した。
そ の 結 果 、 肝 転 移 結 節 はcontrol群 で は6週 投 与 群 で9頭 中8頭 、10週 投 与 群で6頭 中6頭 に 肝 転 移 結 節 が 見 ら れ た の に 対 し 、TNP‑470を 投 与 し た マ ウ ス で は6週 投 与 群 で7頭 中4頭 、 10週 投 与 群 で6頭 中2頭 と 肝 転 移 率 の 減 少 が 観 察 さ れ た 。 肝 転 移 結 節 数 は6週 投 与 群 で は 、 control群（n〓9）で371.0土287.7(／cm ）であったのに対し、TNP‑470投与群（n〓7）では23.2土 8.8（／cm ）であった。10週投与群では、control群（n〓6）で196.9土99.1（／cm ）、TNP−470投与 群（n＝6）では36.0土24.6（／cm ）で あった。6週 、10週のい ずれに おいても 、TNP‑470投与に よ っ て 転 移 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た 。 肝 転 移 結 節 最 大 径 に お け る 検 討 で は 、6週 投 与 群 で は
寛 敬
之
雅
紘
村 木
藤
今 吉
加
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
control
群、TNP‑470投与群の間に差を認めなかったが、10週投与群では、control群の転移 結 節が6
週投 与群 に比 較し てさ らに 増大 して いた のに対 し、TNP‑470
投与 群で は転移結節 の 発育 が抑 制さ れて いた。PCNA index
はTNP‑470
投与群 で6週、10
週 投与 群と も有意に低 下が認められた。ー方、apoptotic indexは、TNP‑470投与群において6週、10週投与群とも、有 意 に 上 昇 が 認 め ら れ た 。
In vitro
に お い てTNP‑470
は ヒ ト 臍 帯 静 脈血 管 内 皮 細 胞(HUVEC)
の 増殖 を 濃 度 依 存 性 に 抑 制 し た が 、 膵 癌 細 胞 株PCI‑43
に 対 して は 直 接 の 増 殖 抑 制 効 果 を 認 め ず 、PCI‑43
のVEGF
産生 性に 対し ても 影響 を与え なか った 。ま た、mvivo
に おい て、TNP‑470 30mg/kg
を 隔日 皮下 注し た群 ではPCI‑43によって誘導される新生血管 の 抑制 が認 めら れた ことから、本実験にて観察された転移抑制効果は血管新生阻害を介し たものと考えられた。副作用として、TNP‑470投与群全例に著明な体重滅少が認められた。以上 の結 果か ら、
TNP‑470
に よる 血管 新生 阻害 は膵癌肝転移を制御する手段として有望 であると考えられた。口頭 発表 にお いて 加藤紘之教授より肝転移モデルの転移結節数のぱらっきの大きさにつ い て、 すで に成 立し た転移 結節 にTNP‑470を 投与 した場合も効果があるか否かについて、
臨 床の 場に おい ての
