博 士 （ 歯 学 ） 竹 山 禎 章
学位 論 文 題名
Low calcium envlronmenteロ ． ・ ． eCtSOSteoprotegerin ligand/OSteoClaStdif瞻rentiationfaCtor
（ 低カル シウム環 境におけ る破骨細 胞誘導因 子の遺伝 子発現につ いて）
学位論文内容の要旨
【目的】
破骨細胞は骨吸収を担っている細胞で、由来は造血幹細胞であり、分化して形成さ れた多核細胞である。その分化は、in vitroにおいて、骨芽細胞などのストローマ細胞 と、骨髄細胞との共存培養が必要であり、骨芽細胞をはじめとするス卜口―マ細胞や 骨髄の単核球などから分泌される各種のサイトカインによって制御されていることが 報告されている。
我々は低カルシウム環境下で生じる硬組織石灰化抑制機構の解明を目的に研究を行っ ているが、これまでに低カルシウム食飼育ラッ卜の大腿骨骨形成不全、特に骨梁の脆 弱化、骨密度の低下などを報告している。この現象は骨芽細胞の骨形成抑制や破骨細 胞による骨吸収亢進を示唆している。そこで、低カルシウム環境における破骨細胞形 成 に 及 ぼす 効 果を 最 近 報告 さ れ た、 破 骨細 胞誘導 因子であ るosteoprotegerin ligand/osteoclast differentiation factor (OPGUODF)の低カルシウム環境における mRNAの発現を検討した。また、甲状腺や腎臓に存在するカルシウムイオンを認識す るカルシウムセンシングレセプタ―が骨芽細胞に存在することが報告されている。そ こ で 、 この レ セプ夕―と 破骨細胞 発現との 関連につ いてもあ わせて検 討した。
【材料と方法】
破 骨細胞の発現は共存培養系を使用した。細胞は骨芽細胞様細胞MC3T3―El細胞 (El細 胞）を通 法に従い 、10％牛胎 児血清を 加えたaMEMで24穴 プレートで培養し た 。骨髄細胞は、4週齢のC57BL/6マウスの大腿骨から無菌的に採取し、1wellあた り 、106個を播 種した。 共存培養 開始後培 養液は、培 養液中の カルシウム濃度を 0.34mM（ 低カ ル シウ ム ）1.87mM（ 対 照） と 、lOOnMのデ キ サメ サ ゾ ン(dex)と lOnMの 活性型ビタミンD3（ビタミンD3）を加えた添加群と無添加群の4種類（低カ ルシウム群、低カルシウム十添加群、対照群、対照十添加群）の培養液で培養した。培 養液は、共存培養開始後、1日おきに交換を行った。
破骨細胞の発現の評価は、破骨細胞のマーカ―酵素である酒石酸耐性酸性ホスファ ターゼを用いた、TRAP染色にて陽性でかつ多核細胞を破骨細胞とし、その数をカウン 卜した。
破 骨細胞形成因子であるOPGL/ODFmRNAの発現をRTーPCRにて検討した。E1細胞を共
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存 培 養 と 同 様 の ス ケ ジ ュ ー ル で 培 養 しtotal RNA回 収後 逆転 写、PCRを 行っ た。
カルシウムセンシングレセプ夕―の発現はEl細胞をlysis bufferにて回収後80ルgを特 異的抗カルシウムセンシングレセプター抗体で免疫沈降を行い、10％アクリルアミドゲ ル にて 電気 泳動 後、PVDF膜に 転写 した。検出はenhanced chemiluminecense法にて 行った。
また、dexとビタミンD3の存在下でカルシウムセンシングレセプターのアゴニス卜で あるガドリニウムとネオマイシンを50 u.Mまたは100ルMの最終濃度で刺激し、OPGL/
ODF mRNAの 発現 と破 骨細 胞の 発現 を検討した。OPGL/ODF mRNAはアゴニストで24時 間刺激後上記と同様に行った。共存培養はアゴニストを添加し上記方法と同様に行っ た。
【結果・考察】
破骨細胞の発現はdexとビタミンD3の添加群にのみ認められた。低カルシウム十添加群 で139土33個/well (n=3）、対照十添加群で88士27個/well (n=3）であり、この発現 した2群を比較すると低カルシウム環境のほうが破骨細胞形成を有意に増加していた
（pく0.05）。
OPGL/ODFmRNAはdexとビタミンD3の添加群にのみ発現していた。この発現していた2 群を比較すると低カルシウム環境の方がより強く発現していた。また、破骨細胞抑制因 子であるosteoprotegerin/osteoclastogenesisinhibitoryfactor (OPG/OCIF) mRNA の発現はdexとビタミンD3の添加群で減少し、 この2群を比較すると低カルシウム環境の 方がより発現が減少していた。これら結果から、少なくとも骨芽細胞には細胞外カルシ ウム を認 識す る機 構が 存在 し、OPG/OCIFとOPGL/ODF mRNAをコントロールして、破 骨細胞の発現を制御していると推測できる。
細胞外カルシウムを認識する機構のひとつにカルシウムセンシングレセプターが報告 されている。そこで、このレセプターと破骨細胞発現について検討した。カルシウムセ ンシングレセプ夕一はグリコプロテインであり、分子量は約150kDaと報告されている。
全ての群にカルシウムセンシングレセプターの発現は認められ、発現には有意な差が認 められなかった。E1細胞の細胞膜には細胞外の環境に関係なく同程度のカルシウムセン シングレセプターが存在していたため、この結果は破骨細胞の発現は細胞外カルシウム イオンの量がこのレセプタ―を介した情報伝達に相違を生じている可能性を示唆してい る。
そこでカルシウムセンシングレセプターのアゴニス卜であるガドリニウムとネオマイ シンで刺激しOPGL/ODF mRNAと共存培養にて破骨細胞の発現を検討した。カルシウム センシングレセプタ―のアゴニストで刺激することでカルシウムイオンの代わりとな り、細胞外カルシウムのカルシウムイオンが増加した状態、っまり、細胞外カルシウム 濃度が上がった状態と同じ環境になると考えたためである。
低カルシウム群、対照群ともアゴニストで刺激した群は、刺激していない群より OPGL/ODF mRNAの発現は滅少をしていた。さらに、共存培養においては低カルシウム 群、対照群ともにアゴニストによる刺激群は刺激しない群に比較し、破骨細胞の発現は 有意に減少していた。
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【結諭】
骨芽細胞は細胞外のカルシウムをカルシウムセンシングレセプターで認識し、その情 報を細胞内に伝え、破骨細胞形成因子のOPGL/ODFを調節することにより破骨細胞発現 を制御していることが示唆された。
学位論文審査の要旨
学 位 論文 題 名
Low calcium envlronmentef［ ・ eCtSOSteoprotegerin ligand/OSteOClaStdifぬrentiationf・aCtor
（ 低カ ルシウム 環境にお ける破骨細 胞誘導因 子の遺伝 子発現に ついて）
提出論文の概要は以下の通りである。
く目的 ＞
低カル シウム環 境下で生 じる硬組織 石灰化抑 制機構を明らかにする目的で、低カルシウ ム 環境 が 破骨 細 胞 形成 に 及ぼす効 果を破骨細 胞誘導因 子であるosteoprotegerin ligand / osteoclast differentiation factor (OPGL/○DF)のmRNAの 発 現に つ い て検 討 し た。ま た、骨芽 細胞に存 在するカル シウムセ ンシング レセプターと破骨細胞発現との関連 につい ても検討 した。
く材料 と方法＞
破 骨 細 胞の 発 現は 、 骨 芽細 胞 様細 胞MC3T3ーEl細 胞(El細 胞 ） とマ ウ ス骨 髄 細 胞と の 共 存培 養 系を 使 用 した 。 共存培養 開始後、培 養液は培 養液中の カルシウ ム濃度を0.34mM （ 低 カ ル シ ウ ム ）1.87mM（ 対 照 ） と 、lOOnMの デ キ サ ヌ サゾ ン(dex)とlOnMの活 性 型 ピタ ミ ンD3（ ビタ ミ ンD3)を 加 えた 添 加 群と 無 添加 群 の4種 類の 培 養液 で 培 養し た。
破 骨細 胞 の発 現 の 評価 は 、TRAP陽性で 、かつ多核 細胞を破 骨細胞と し、その 数をカウ ン トした 。OPGL/ODFmRNAの発現 をRT一PCRにて 検討した。
カ ル シ ウム セ ンシ ン グレ セプター の発現は免 疫沈降ーwestern blot法にて行 った。ま た 、dexと ピタ ミ ンD3の 存 在下 で カル シ ウ ムセ ン シン グレ セプター のアゴニ ストであ る ガ ド ル ニ ウ ム と ネ オ マ イ シ ン を50uMま た は100ルMで 刺 激 し 、OPGL/ODF mRNAの 発 現と破 骨細胞の 発現を検 討した。
く結果 と考察＞
1）破 骨 細胞 の 発 現はdexと ピタ ミ ンD3の 添加 群 にの み認め られ、こ の発現し た2群を 比 較す る と低 カ ル シウ ム 環 境の 方 が破 骨 細 胞形 成 は有 意 に 増加 し てい た （pく0.05)。 2）OPGL/ODFmRNAはdexと ピ タ ミ ンD3の 添 加 群 に の み 発 現 して お り 、発 現 して い た2群 を比 較 する と 、 低カ ル シウ ム 環 境の 方 が より 強 く発現し ていた。1）2）の結 果か
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ら 、 少 な く と も 骨芽 細 胞 に は 細 胞 外 カ ル シ ウ ム を 認 識 す る 機 構 が 存 在 し 、OPGL/ODF mRNAを コ ン ト 口 ー ル し て 、 破 骨 細 胞 の 発 現 を 制 御 し て い る と 推 測 で き る 。 3）細胞 外カ ルシ ウムを認識する機構にカルシウムセンシングレセプターがあり、この レセプターと破骨細胞発現について検討した。全ての群でカルシウムセンシングレセプタ ーの発現には有意な差が認められぬかった。この結果は細胞外カルシウムイオンの量によ る レ セ プ タ ー を 介 し た 情 報 伝 達 に 相 違 が 生 じ て い る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。 4）そこ で、 アゴ ニストで刺激することでカルシウムイオンの代わりとなると考え、カ ル シ ウ ム セ ン シ ン グ レ セ プ タ ー の ア ゴ ニ ス ト で刺 激 し 、OPGL/ODF mRNAと 共存 培 養 にて破骨細胞の発現を検討した。低カルシウム群、対照群ともアゴニス卜の刺激群は、非 刺 激 群 よ りOPGL/ODF mRNAの 発 現 は 減 少 し て い た 。 さ ら に 、 共 存 培 養 に お いて は 低 カルシウム群、対照群ともにアゴニストによる刺激群は非刺激群に比較し、破骨細胞の発 現が有意に減少していた。
く結論＞
骨 芽 細 胞 は 細 胞 外 の カ ル シ ウ ム を カ ル シ ウ ム セ ン シ ン グ レ セ プ 夕 一 で 認識 し 、 OPGL/ODFを 調 節 す る こ と で 破 骨 細 胞 発 現 を 制 御 し て い る 経 路 が 明 ら か に なっ た 。
審 査は 、ま ず、 論文 提出 者から 提出 論文 の概要の説明を受けた。続いて、本研究の背 景、実験法および実験結果に関する詳細について質問した他、破骨細胞に関する基礎的事 項、カルシウム代謝に関連する情報伝達機構について、さらに、がんや炎症による骨吸収 など臨床との関連など、本論文を中心に、種々口頭で試問した。論文提出者はそれらの質 問に対してそれぞれ明解に回答した。さらに、後日、久保木副査により、一般的知識につ いて筆記試験が行われ、成績が優秀であった。
本論文提出者は本論文を中心に広い学識を有し、また、本論文の内容も高く評価され、
博士（歯学）の授与に値するものと判断された。
な お 、 本 論 文 は 、Biochemical and Biophysical Research Communications 276:
524〜529，2000.に掲載されている。
