博 士 （ 理 学 ） 荻 原 克 益 学位論文題名
Studies on the mechanism of follicle rupture during ovulation in the medaka
（メダカ排卵における濾胞破裂のメカニズムに関する研究）
学位論文内容の要旨
排卵は、受精可能な成熟した卵母細胞が卵巣から放出される過程である。排 卵が起きるためには卵母細胞を取り囲む濾胞の破裂が不可欠である。濾胞破裂 にはある種のプロテアーゼが関わることが示唆されているが、その同定には至 っていない。本研究は、メダカの利点を生かして、濾胞破裂に関わるプロテア ーゼ（排卵酵素）の同定を目指して実施された。
第1章メダカ生体外排卵評価系の確立と種々のプロテアーゼ阻害剤の排卵へ の効果
適切な環境下で飼育された雌メダカ卵巣から排卵の数時間前に単離した濾胞 は、生体外でも首尾良く排卵する。申請者は、この系を本研究が目的とする排 卵酵素の同定に利用できるよう改良し、種々のプロテアーゼ阻害剤の排卵に及 ばす影響を調査した。その結果、マトリクスメタロプロテア．ーゼ(MMP)の特 異的阻害剤による排卵抑制が観察された。また、排卵はアクチノマイシンDお よびシクロヘキシミドによっても抑制された。これらの転写および翻訳阻害剤 の排卵に及ぼす効果とEDTAによる排卵抑制効果の詳細な解析から、排卵実行 に必要なMMPが、排卵期に合わせて濾胞組織において生合成されることが明ら かになった。
第2章メ ダカ卵 巣に 発現 する マトリ ック スメ タロ プロテアーゼのcDNAクロ ーニング、発現および生化学的解析
排卵直前の濾胞組織には少なくとも7種のMMPが発現しており、本研究では、
6種 のMMPに つ い てcDNAク ロ ー ニ ン グ を 行 っ た 。7種のMMPの う ち 、5種 のMMPのmRNAは 小 濾 胞 の 卵 母 細 胞 の 細 胞 質 に 、 他 の2種MMPのmRNAは 排卵後の濾胞細胞層に存在した。活性型リコンビナントgelatinaseAおよび gelatinaseBは ウシ4型コラーゲンを分解し、MT2‑MMPはメダカ1型コラーゲ ンを分解した。また、MT5‑MMPを除くMT‑MMPは不活性前駆体のprogelatinase Aを 活 性 化 し た 。 免 疫 学的 解 析 か らMT3‑MMPを 除 く6種 のMMPが 卵 巣 に 発 現しており、それらの局在はmRNAの局在と一致した。以上の結果に基づき、
4種 のMMP (gelatinaseA、gelatinaseB、MT1ーMMP、MT2‑MMP)がメダカ排卵 に関与する可能性があることが示された。
第3章メダカ排卵時の濾胞破裂におけるマトリックスメタロプロテアーゼの 関与
第2章において、排卵時にgelatinaseA、gelatinaseB、MTl‑MMP、MT2‑MMP タンパク質が発現していることが明らかにされた。本章では、これら4種のMMP の排卵への関与を調べるために、特異的抗体を用いて排卵前後における発現部 位、消長、プロセシングパターンをタンパク質レベルで解析した。メダカ生体 外排卵評価系を用いた実験では、gelatinaseB抗体以外について排卵抑制効果が 確認された。また、MTl‑MMPに対する抗体を用いた実験から排卵前の時期に MTl‑MMPがprogelatinaseAを活性化し、活性型となったgelatinaseA活性は内 在性MMP阻害因子TJMP‑2bによって調節されていることが明らかにされた。
以上の結果から、gelatinaseAおよびMT2‑MMPが濾胞壁を溶解する実質的な排 卵 酵素 で あり 、 排卵 時 のMMP活性 調 節にMTl‑MMPお よぴTIMP‑2bが関 与し ていることが明らかになった。
第4章 メダカ排卵 におけるtPA/plasmin系、ADAMTS‑1、およびCathepsinLの 役割
哺乳類の排卵においては、tPA/plasmin系、ADAMTS‑1、およびCathepsinLの 関与が示唆されている。そこでメダカ排卵にこれらの分子が関わるかにっいて 検討した。Northern blot解析の結果、ADAMTS‑1およびCathepsinLmRNAは卵 巣において検出されたが、tPAおよびplasminは検出されなかった。ADAMTS‑1 およびCathepsinLは小濾胞の卵母細胞の細胞質に発現していたが、CathepsinL については成熟した濾胞の濾胞細胞層および排卵後の濾胞細胞層にも確認され た。これら4種のりコンビナントタンパク質は1型および4型コラーゲンのい ずれも分解できなかった。さらに特異的抗体による排卵抑制効果は見られなか った。以上の結果から、これら4種のプロテアーゼはメダカの排卵には関与し ないと結諭した。
以上、本研究によって、メダカ卵巣に発現するMMPのタンパク質レベルでの 性質が明らかになったばかりでなく、排卵に関与するMMPが同定された。さら に排卵時における個々のMMPの役割を明らかにすることによって、メダカの排 卵のメカニズムが解明された。これらの成果は、過去一世紀にわたって生殖生 物学の分野で解明が待たれてきた課題に初めて明快な解答を与えるものである。
よ っ て本 研 究は 、 生 殖生 物 学研 究 の発 展 に大 きく貢献 するもので ある。
学位 論文審 査の要旨
学位論文題名
Studies on the mechanism of follicle rupture during ovulation in the medaka
（ メダ カ排 卵に おけ る濾 胞破裂のメカニズムに関する研究）
排卵は、受精可能な成熟した卵母細胞が卵巣から放出される過程である。排卵が起 きるためには卵母細胞を取り囲む濾胞の分解が．不可欠である。濾胞破裂にほある種の プロテアーゼが関わることが示唆されているが、その同定には至っていない。本研究 は、メダカの利点を生かして、濾胞破裂に関わるプロテアーゼ（排卵酵素）の同定を 目指して実施された。
第1章 メ ダ カ 生 体 外 排 卵 評 価 系 の 確 立 と種 々 の プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤 の 排 卵 へ の 効 果
適 切な 環境 下で 飼育された雌メダカ卵巣から排卵の数時間前に単離した濾胞は、生 体外 でも 首尾 良く 排卵する。申請者は、この系を本研究が目的とする排卵酵素の同定 に利用できるよう改良し、種々のプロテアーゼ阻害剤の排卵に及ぼす影響を調査した。
そ の 結 果 、マ ト リ ク ス メ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ(MMP)の 特 異 的 阻 害 剤 に よ る 排 卵 抑 制 が観 察さ れた 。ま た、 排卵 はア クチ ノマ イシ ンDおよびシクロヘキシミドによっても 抑制 され た。 これ らの 転写 およ ぴ翻 訳阻 害剤 の排 卵に及 ぼす 効果 とEDTAに よる排卵 抑制 効果 の詳 細な 解析から、排卵期に合わせて排卵を実行する酵素が濾胞組織で生合 成されることが明らかになった。
第2章 メ ダ カ 卵 巣 に 発 現 す る マ ト リ ク ス メ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ のcDNAク ロ ー ニ ン グ 、発 現お よぴ 生化 学的 解析
排 卵 直 前 の 濾 胞 組 織 に は 少 な く と も7種 のMMPが 発 現 して お り 、 本 研究 では 、6 種 のMMPに つ い てcDNAク ロ ー ニ ン グ を 行 っ た 。7種 のMMPの う ち 、5種 のMMP のmRNAは 小 濾 胞 の 卵 母 細 胞 の 細 胞 質 に 、 他 の2種MMPのmRNAは 排 卵 後 の 濾 胞 細 胞層 に存 在し た。 活性 型リ コン ビナ ントgelatinaseAお よびgelatinaseBはウシIV 型 コ ラ ー ゲ ン を 分 解 し 、MT2‑MMPは メ ダ カI型 コ ラ ー グ ン を 分 解 し た 。 ま た 、 MT5‑MMPを 除 くMT‑MMPは 不 活性 前 駆 体 のprogelatinaseAを 活 性 化 し た。 免疫学 的 解 析 か らMT3‑MMPを 除 く6種 のMMPが 卵 巣 に 発 現 し て お り 、 そ れ ら の 局 在 はmRNA の 局 在 と 一 致 し た 。 以 上 の 結 果 に 基 づき 、4種MMP (gelatinaseA、gelatinaseB、
行 男
兼
孝 範
正
橋 木
下
高 鈴
山
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
MTl‑MMP、MT2‑MMP)が排卵に 関与する可能性があることが示された。
第3章 メダカ 排卵時の濾 胞破裂にお けるマトリ クスメタロ プロテアー ゼの作用 第2章 において、 排卵期にgelatinaseA、gelatinaseB、MTl‑MMP、MT2‑MMPタン パク質が発現していることが明らかにされた。本章では、これら4種のMMPの排卵 への関与を調べるために、特異的抗体を用いて排卵前後における発現部位、消長、プ ロセシングパターンをタンパク質レベルで解析した。メダカ生体外排卵評価系を用い た実験で は、gelatinaseB抗体以外について排卵抑制効果が確認された。また、
MTl‑MMPに対 する抗体を用いた実験から排卵前の時期にMTl‑MMPがprogelatinase Aを 活性化し、 活性型gelatinaseAは 内在性MMP阻害因子TIMP‑2bによって調節さ れていることが明らかにされた。以上の結果から、gelatinaseAおよびMT2‑MMPが 濾胞を溶 解する実質 的な排卵酵 素であり、 排卵時のMMP活性調節にMTl‑MMPおよ びTIMP‑2bが関与していることが明らかになった。
第4章メダカ 排卵におけ るtPA/plasmin系、ADAMTS‑1、およびcathepsinLの役割 哺乳類の排卵においては、tPA/plasmin系、ADAMTS‑1、およびcathepsinLの関与 が示唆されている。そこでメダカ排卵にこれらの分子が関わるかについて検討した。
Northem blot解析の結果、ADAMTS‑1およびcathepsinLmRNAは卵巣において検出さ れたが、tPAおよびplasminは検出されなかった。ADAMTS‑1およびcathepsinLは小 濾胞の卵母細胞の細胞質に発現していたが、cathepsinLにっいては成熟した濾胞の濾 胞細胞層および排卵後の濾胞細胞層にも確認された。これら4種のりコンビナントタ ンパク質はI型およびIV型コラーゲンのいずれも分解できなかった。さらに特異的 抗体による排卵抑制効果は見られなかった。以上の結果から、これら4種のプロテア ーゼはメダカの排卵には関与しないと．結諭した。
以上、本研究によって、メダカ卵巣に発現するMMPにっいてタンパク質レベルで それらの性質が明らかになったばかりでなく、排卵に関与するMMPが同定された。
さらに排卵時における個々のMMPの役割を明らかにすることによって、メダカの排 卵のメカニズムが解明された。これらの成果は、過去一世紀にわたって生殖生物学の 分野で解明が待たれてきた課題に対して、初めて明快な解答を与えるものである。一 部の成果は、すでに国際的学術専門誌に公表されており、申請者の研究が世界的レベ ルで評価を受けていることは明らかである。
よって、申請者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格あるものと認 める。
