角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 、

角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 、 お よ び 角 膜 内 皮 移 植 マ ウ ス モ デ ル の 作 製 と 同 モ デ ル に お け る 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の 評 価

日 本 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 博 士 課 程 外 科 系 眼 科 学 専 攻

栗 田 淳 貴

修 了 年 2021 年

指 導 教 員 : 山 上 聡

角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 、 お よ び 角 膜 内 皮 移 植 マ ウ ス モ デ ル の 作 製 と 同 モ デ ル に お け る 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の 評 価

日 本 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 博 士 課 程 外 科 系 眼 科 学 専 攻

栗 田 淳 貴

修 了 年 2021 年

指 導 教 員 : 山 上 聡

1

【 目 次 】

ア ） 概 要

イ ） 諸 言

１ ． 角 膜 の 構 造

２ ． 角 膜 移 植 術

１ ． 全 層 角 膜 移 植 術 （PKP

）

２ ． 角 膜 内 皮 移 植 術 （DSAEK

）

３ ． 角 膜 移 植 術 後 拒 絶 反 応

１ ． 角 膜 内 皮 移 植 後 の 拒 絶 反 応

２ ． 拒 絶 反 応 の 抗 原 提 示 ・ 認 識 相

３ ． 免 疫 特 権

４ ． 角 膜 移 植 術 後 拒 絶 反 応 関 連 サ イ ト カ イ ン ・ ケ モ カ イ ン

ウ ） 目 的

エ ） 材 料 と 方 法

１ ． 角 膜 移 植 マ ウ ス モ デ ル の 作 製

１ ）

マ ウ ス モ デ ル の 作 製

２ ）DSAEK

マ ウ ス モ デ ル の 作 製

2 ２ ． 角 膜 移 植 後 の 拒 絶 反 応 評 価 判 定

３ ． 角 膜 移 植 片 に お け る 免 疫 応 答 関 連 遺 伝 子 発 現 の 検 討

１ ） レ ー ザ ー マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン 法

２ ）

法

３ ） 定 量 的 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 （

）

４ ） 免 疫 組 織 化 学 染 色

４ ． 統 計 学 的 検 討

オ ） 結 果

１ ．PKP

マ ウ ス モ デ ル

１ ） 拒 絶 判 定 の 臨 床 ス コ ア

２ ） 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の バ イ オ マ ー カ ー の 探 索

ⅰ

法 を 用 い た バ イ オ マ ー カ ー 候 補 遺 伝 子 の ス ク リ ー

ニ ン グ

ⅱ

群 、

群 の 比 較 に よ る バ イ オ マ ー カ ー の 探 索

ⅲ

の 由 来 細 胞 、 お よ び 局 在 の 観 察

２ ．DSAEK

マ ウ ス モ デ ル

１ ） 拒 絶 判 定 の 臨 床 ス コ ア

２ ）

に よ る

群 と

群 、

群 の 比 較

3

カ ） 考 察

キ ） ま と め

4

【概 要 】

[

背 景 ・ 目 的

角 膜 移 植 は 、 病 的 に 混 濁 し た 角 膜 に 対 し て 透 明 性 を 回 復 す る た め の 外 科 的

手 段 で あ る 。 代 表 的 な 術 式 は 、 全 層 角 膜 移 植 術 （

keratoplasty

） で あ る 。 角 膜 の 移 植 は 、 他 臓 器 の 移 植 と 比 較 し 、 拒 絶 の 発 生

率 が 低 い こ と が 知 ら れ て い る が 、 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の 病 態 に は 不 明 な 点 が

数 多 く 残 さ れ て お り 、 解 明 に 向 け た 多 く の 研 究 結 果 が 報 告 さ れ て い る 。 角 膜

移 植 後 拒 絶 反 応 の 研 究 で は 、 マ ウ ス モ デ ル を 用 い た も の も 多 く 報 告 さ れ て い

る が 、 拒 絶 の 評 価 判 定 は 、 顕 微 鏡 下 で の 臨 床 所 見 で 行 わ れ て い る た め 、 客 観

性 お よ び 定 量 性 に 欠 け る こ と が 問 題 と し て あ げ ら れ て い る 。 我 々 は 、 全 層 角

膜 移 植 マ ウ ス モ デ ル を 作 製 し 、 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 発 症 時 に 得 た 角 膜 移 植 片

を 基 に 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー と な り う る 因 子 の 探 索 的 研 究 を 行 っ た 。

ま た 、 近 年 で は 疾 患 に 応 じ た 角 膜 部 分 移 植 が 普 及 し て き て い る 。 角 膜 内 皮

に 障 害 が 生 じ る 水 疱 性 角 膜 症 を 対 象 と し て 、 角 膜 の 深 層 の 薄 い 実 質 と 角 膜 内

皮 層 だ け を 角 膜 裏 面 に 貼 り 付 け 移 植 す る 角 膜 内 皮 移 植 術

Stripping Automated Endothelial Keratoplasty)

が 行 わ れ て い る 。

は 、

と 比 較 し て 拒 絶 反 応 が 起 こ り に く い こ と や 拒 絶 反 応 が 実 際 に 起 こ っ

て も そ の 反 応 が 弱 い と い う 報 告 が み ら れ る 。 し か し 、

に お い て 拒 絶

5

反 応 が 軽 症 化 す る 機 序 は 明 ら か と な っ て い な い 。 我 々 は 、

に お け る

拒 絶 反 応 の 病 態 を 解 析 す る 目 的 で 、 新 た な

マ ウ ス モ デ ル を 提 唱 す る

と と も に 、

モ デ ル マ ウ ス と の 比 較 を 行 う こ と で 、

モ デ ル マ ウ ス

で の 拒 絶 反 応 に つ い て 検 討 し た 。

[

方 法

同 種 同 系

マ ウ ス モ デ ル （

） お よ び 同 種 異 系

マ ウ ス

モ デ ル （

） を 作 製 し 、 移 植 後

週 目 に 臨 床 ス コ ア を 用 い て 、

拒 絶 反 応 の 評 価 判 定 を 行 っ た 。 判 定 を 行 っ た 後 に 角 膜 移 植 片 を 採 取 し 、

Profiler PCR Arrays

（

）を 用 い て 遺 伝 子 発 現 の 多 項 目 同 時 解 析 、お

よ び

reaction (qRT-PCR)

法 に よ り

、

（

protein 10-kDa

）、

お よ び 、

、

に つ い て 、

messenger RNA

（

） 発 現 量 を 定 量 的 に 検 討 し た 。 対 照 に は 、 未 処 置 の

マ ウ ス の 角 膜 を 用 い た 。

ま た 、 内 皮 側 移 植 片 を 同 種 異 系 と し た 同 種 異 系

マ ウ ス モ デ ル

（

） を 作 製 し 、 同 様 に 臨 床 ス コ ア の 評 価 、

法 を 施 行 し た 。

6 [

結 果

PKP iso

群 （

） お よ び

群 （

） の 臨 床 ス コ ア （ 角 膜 混 濁 ）

は 、そ れ ぞ れ

（ 平 均 ±標 準 偏 差 ） （ 点 ）、

だ っ た 。

群

は

頭 す べ て が 拒 絶 な し 、

群 は

頭 が 拒 絶 な し 、

頭 が 拒 絶 あ り の

判 定 と な り 、 両 郡 を 比 較 す る と 、 統 計 学 的 に 有 意 な 差 を 認 め た （

、

Fisher

の 正 確 確 率 検 定 ）。

法 に お い て 、

で は 、 コ ン ト ロ

ー ル と 比 較 し て

、

、

（

γ

protein 10-kDa

）、

、

、

、

で

倍 以 上

の 増 加 が 見 ら れ た 。

法 に お い て 、

発 現 量 は 、

群 と

群 と の 間 で 有 意 な 差 が 見 ら れ た （

、 マ ン ホ イ ッ ト ニ ー

の

検 定 ）。

DSAEK

群 の 臨 床 ス コ ア の 平 均 は

（ 平 均

標 準 偏 差 ） で 、 拒 絶 反 応

あ り と 判 定 し た も の が

頭 、 無 し と 判 定 し た も の が

頭 だ っ た 。 臨 床 ス コ ア

は 、

群 と

群 と で は 、 有 意 な 差 が 見 ら れ （

、

の 正 確 確 率 検 定 ）、

群 と

群 と で は 、差 が な か っ た（

）。

ま た 、

法 に お い て 、

発 現 量 は 、

群 を 基 準 と

し た ス テ ィ ー ル 検 定 に お い て 、

群 と の 間 で 、 有 意 に 高 値 を 示 し （

= 0.046

）、

群 と の 間 に 差 は な か っ た （

）。

7 [

結 論

PKP iso

と

の 比 較 に よ り 、

は

マ ウ ス モ デ ル に お け

る 角 膜 移 植 後 の 拒 絶 反 応 の バ イ オ マ ー カ ー と な り う る こ と が 明 ら か と な っ た 。

ま た 、今 回 我 々 が 新 た に 提 唱 し た

マ ウ ス モ デ ル は 、

を バ イ オ

マ ー カ ー と し て 判 定 し た 場 合 、

マ ウ ス モ デ ル と 比 較 し て 拒 絶 反 応 が 起 き

に く い こ と が 解 り 、 実 臨 床 に そ く し た

の 動 物 モ デ ル と な り う る 可 能

性 が 考 え ら れ た 。

8

【諸 言 】

1. 角 膜 の 構 造

角 膜 は 、 眼 球 の 最 外 層 に 位 置 し 、 外 界 と 涙 液 層 を 介 し て 直 接 接 す る 組 織 で

あ り 、 眼 内 へ の 光 の 入 口 と し て 光 の 通 過 と 屈 折 に 関 連 す る 光 学 的 に も 重 要 な

無 血 管 で 透 明 な 組 織 で あ る 。 組 織 学 的 に は 、 外 側 か ら 、 角 膜 上 皮 、

膜 、 角 膜 実 質 、

膜 、 角 膜 内 皮 の

層 で 構 成 さ れ る

。 角 膜 上 皮 は 、

重 層 扁 平 上 皮 で 構 成 さ れ 、

で 結 合 し た 上 皮 細 胞 は 、 外 界 か ら

の 微 生 物 や 抗 原 の 侵 入 を 防 御 す る 生 体 バ リ ア と し て の 役 割 を 持 っ て い る 。

膜 は 、 角 膜 上 皮 直 下 に 位 置 し 、 無 細 胞 性 の 層 で あ る 。 細 胞 外 マ ト リ

ク ス で 構 成 さ れ る が 、生 理 学 的 意 義 は 不 明 で あ る 。角 膜 実 質 は 、角 膜 の

％

以 上 の 厚 み を 占 め 、角 膜 実 質 細 胞 と 細 胞 外 マ ト リ ク ス（ 主 に Ⅰ 型 コ ラ ー ゲ ン 、

プ ロ テ オ グ リ カ ン ） と で 構 成 さ れ る ラ メ ラ 構 造 は 、 角 膜 の 形 状 と 透 明 性 維 持

に 重 要 な 組 織 で あ る

。 角 膜 実 質 に 異 常 な 沈 着 を 生 じ る 角 膜 ジ ス ト ロ フ ィ 、

お よ び 感 染 や 外 傷 に よ り 生 じ る 角 膜 瘢 痕 は 角 膜 ラ メ ラ 構 造 が 乱 れ る こ と に よ

り 角 膜 混 濁 を 生 じ る 疾 患 で あ る

。 角 膜 実 質 混 濁 に 伴 う 視 力 障 害 の 治 療 に

は 、角 膜 移 植 術 が 行 わ れ て い る 。

膜 は 、角 膜 内 皮 細 胞 の 基 底 膜 で あ

り 、 角 膜 の 形 状 維 持 に 働 く 。 角 膜 内 皮 は 、 最 内 層 に 位 置 す る 単 層 の 扁 平 細 胞

（ 角 膜 内 皮 細 胞 ） で 構 成 さ れ 、 角 膜 へ の 水 の 出 入 り を 調 節 し て い る 。 角 膜 内

9

皮 は 、 浸 透 を 抑 制 す る バ リ ア 機 能 と 、 汲 み 出 す ポ ン プ 機 能 と の バ ラ ン ス に よ

り 角 膜 内 の 含 水 量 を 一 定 に 調 整 す る 機 能 を 持 ち 、 角 膜 の 透 明 性 の 維 持 に 働 く

が 、 角 膜 内 皮 細 胞 の 機 能 低 下 に よ り 角 膜 浮 腫 が 生 じ 、 水 疱 性 角 膜 症 な ど の 疾

患 が 発 症 す る 。 角 膜 の 浮 腫 性 混 濁 は 、 著 し い 視 力 低 下 の 原 因 に な る た め 、 角

膜 移 植 術 の 適 応 と な る

（ 図 １ ）。

角 膜 の 各 層 の バ ラ ン ス に よ り 、 角 膜 は そ の 形 状 と 透 明 性 を 維 持 さ れ る 。

2. 角 膜 移 植 術

角 膜 は 、前 項 で 挙 げ た 通 り 、透 明 性 の 低 下 が 、視 機 能 に 多 大 な 影 響 を 与 え 、

患 者 の

の 低 下 を 招 く 。 角 膜 移 植 が 適 応 と な る 角 膜 混

濁 の 原 因 と な る 疾 患 は 、 先 天 疾 患 と し て は 角 膜 ジ ス ト ロ フ ィ 、 後 天 疾 患 と し

て は 感 染 性 角 膜 炎 、 水 疱 性 角 膜 症 、 角 膜 外 傷 な ど が あ げ ら れ る 。 こ れ ら の 疾

患 に 対 し 、 透 明 性 を 回 復 す る 手 段 と し て 施 行 さ れ る 角 膜 移 植 術 は 、 光 学 的 角

膜 移 植 術 と 呼 ば れ る

。 一 方 、 感 染 症 や 外 傷 に よ る 角 膜 穿 孔 に 対 し て 、 穿

孔 部 を 閉 鎖 し 、 眼 球 の 形 状 を 維 持 す る こ と を 目 的 と し て 行 わ れ る 角 膜 移 植 術

は 、治 療 的 角 膜 移 植 術 と さ れ て い る

。角 膜 移 植 術 は 、

世 紀 に 初 め て

試 み が な さ れ て か ら 、 今 日 に 至 る ま で に 術 式 の 進 歩 を み せ 、 現 在 で は 様 々 な

術 式 が 、 そ の 適 応 の 下 行 わ れ て い る

。

10

角 膜 移 植 術 の 術 式 と し て は 、角 膜 の 全 層 を 移 植 す る 全 層 角 膜 移 植 術（

Penetrating Keratoplasty

） と パ ー ツ ご と に 移 植 を 行 う 部 分 移 植 に 分 け ら れ

る 。 部 分 移 植 は 、 角 膜 上 皮 移 植 と し て

、 角 膜 輪 部 移 植

術 が あ り 、 角 膜 実 質 移 植 と し て 表 層 角 膜 移 植 術 （

Keratoplasty

）、 深 層 表 層 角 膜 移 植 術 （

Keratoplasty

） が 、 角 膜 内 皮 の 移 植 と し て は 、 デ ス メ 膜 剥 離 角 膜 内 皮 移 植 術

（

） や

デ ス メ 膜 角 膜 内 皮 移 植 術 （

：

Keratoplasty

） な ど が 報 告 さ れ て い る

。

2−1. 全 層 角 膜 移 植 術

PKP

は 、角 膜 全 層 を 移 植 す る 古 典 的 角 膜 移 植 術 で 、角 膜 中 央 部 の 混 濁 し た

角 膜 を 円 形 に 全 層 切 除 し 、提 供 さ れ た 移 植 角 膜 を 全 層 移 植 す る 術 式 で あ る（ 図

2a

）。本 術 式 は 、角 膜 実 質 深 層 に 混 濁 の あ る 症 例 や 、角 膜 内 皮 の 異 常 に よ り 角

膜 実 質 や 全 層 に 障 害 の 生 じ た 症 例 、 角 膜 穿 孔 を き た し た 症 例 な ど が 適 応 と な

る た め 、 水 疱 性 角 膜 症 、 感 染 性 角 膜 炎 後 角 膜 白 斑 、 角 膜 ジ ス ト ロ フ ィ 、 円 錐

角 膜 、角 膜 外 傷 後 角 膜 混 濁 な ど に 対 し て 施 行 さ れ て い る 。角 膜 の 透 明 性 回 復 、

視 力 向 上 に 優 れ た 術 式 と 考 え ら れ て い る が 、 角 膜 全 層 を 移 植 す る こ と か ら 、

11

拒 絶 反 応 が 生 じ や す い と い う 欠 点 を 有 し て い る 。 既 報 に よ れ ば 、 拒 絶 反 応 の

頻 度 は 、

程 度 で あ る と さ れ る

。

2−2. 角 膜 内 皮 移 植 術

角 膜 内 皮 移 植 術 は 、近 年 主 流 と な っ て い る 角 膜 部 分 移 植 術 の 一 手 法 で あ る 。

本 法 は 、 角 膜 内 皮 の 移 植 を 目 的 と す る 術 式 で 、 角 膜 実 質 の 深 層 と 角 膜 内 皮 層

を 角 膜 裏 面 に 貼 り 付 け 移 植 す る デ ス メ 膜 剥 離 角 膜 内 皮 移 植 術

、お よ

び 角 膜 内 皮 層 だ け を 移 植 す る デ ス メ 膜 角 膜 内 皮 移 植 術 （

） の

つ の 術

式 が 行 わ れ て い る （ 図

）。 角 膜 内 皮 面 に 障 害 が 限 局 す る 症 例 な ど が 適 応 と

な る た め 、 水 疱 性 角 膜 症 に 対 す る 治 療 に 用 い ら れ て い る 。 手 術 手 技 は 、 レ シ

ピ エ ン ト の 角 膜 は 前 房 側 か ら 角 膜 内 皮 を 剥 離 し 、 内 皮 移 植 用 に 形 成 し た ド ナ

ー 角 膜 は 前 房 内 に 挿 入 し て 、ド ナ ー 角 膜 と レ シ ピ エ ン ト 角 膜 が 接 着 す る よ う 、

前 房 内 に 空 気 を 注 入 す る 。 ド ナ ー 角 膜 の レ シ ピ エ ン ト 角 膜 内 皮 面 の 貼 り 付 け

に は 、 空 気 を 用 い て の 圧 迫 が 行 わ れ 、 縫 合 は 行 わ れ な い た め 、 術 後 、 患 者 に

は 数 時 間 、 仰 臥 位 を 維 持 し て も ら い 、 空 気 の 浮 力 に よ る 圧 迫 を す る こ と で 、

ド ナ ー 角 膜 を 接 着 さ せ る

。

本 術 式 は 、 患 者 に 対 し て 低 侵 襲 で あ る こ と 、 お よ び 拒 絶 反 応 の 発 症 が 全 層

角 膜 移 植 術 と 比 較 し て 低 率 で あ る こ と が 特 徴 と さ れ て い る

。

12 3. 角 膜 移 植 術 後 拒 絶 反 応

角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 は 、 上 皮 型 、 実 質 型 、 内 皮 型 に 分 類 さ れ て い る 。 特 に

内 皮 型 拒 絶 反 応 は 、

や

の 予 後 を 左 右 す る 重 要 な 術 後 合 併 症 の １

つ と さ れ 、角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の

％ を 占 め る

。角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の 免

疫 学 的 反 応 は 、

） 角 膜 で の 抗 原 提 示 、 認 識 相 、

） 所 属 リ ン パ 節 で の 細 胞 増

殖 相 、

）角 膜 で の 拒 絶 反 応 と し て の 効 果 相 に 分 類 さ れ 、各 反 応 相 で の 解 析 が

進 ん で い る

。

3−1.

角 膜 内 皮 移 植 後 の 拒 絶 反 応

角 膜 は 、血 管 や リ ン パ 管 に 乏 し い 組 織 学 的 特 徴 を 有 す る 組 織 で あ る こ と 、お

よ び 角 膜 内 皮 が 接 す る 前 房 に は 、 拒 絶 反 応 を 抑 制 す る 免 疫 学 的 機 序 が 備 わ っ

て い る こ と が 指 摘 さ れ て お り 、 他 の 固 形 臓 器 と 比 較 し 、 移 植 後 の 拒 絶 反 応 の

発 生 率 が 低 値 で あ る こ と が

で 報 告 さ れ て い る

。 さ ら に

で は 、

PKP

と 比 較 し て 拒 絶 反 応 の 発 症 が 低 率 で あ る と さ れ て い る が

、差 が な

い と す る 報 告 も あ り

、

に お け る 拒 絶 反 応 の 機 序 が 十 分 に 解 明 さ れ

て い な い 。 ま た 、 拒 絶 反 応 に 角 膜 実 質 細 胞 が 関 与 す る と の 報 告 も な さ れ て い

る

。

13 3−2. 拒 絶 反 応 の抗 原 提 示 ・ 認 識 相

抗 原 提 示 ・ 認 識 相 は 、 樹 状 細 胞 な ど の 抗 原 提 示 細 胞 が 、 移 植 さ れ た 角 膜 の

抗 原 を ホ ス ト の

細 胞 に 提 示 し 、 角 膜 移 植 関 連 抗 原 を 認 識 す る 過 程 で あ る 。

現 在 、 角 膜 移 植 に お け る 拒 絶 反 応 の 認 識 相 は 、 抗 原 提 示 細 胞 に よ る 直 接 認 識

と 間 接 認 識 の

つ に よ り な さ れ て い る と さ れ て い る 。 前 者 は 、 ド ナ ー 角 膜 の

移 植 時 に 、そ こ に 含 ま れ る ド ナ ー 由 来 の 抗 原 提 示 細 胞 が レ シ ピ エ ン ト の

細

胞 に 抗 原 提 示 を 行 い 、 後 者 は ド ナ ー 角 膜 に 対 し て 、 レ シ ピ エ ン ト の 抗 原 提 示

細 胞 が 抗 原 認 識 を 行 い 、 そ れ ぞ れ 拒 絶 反 応 を 導 く も の で あ り 、 角 膜 移 植 後 拒

絶 反 応 は 主 に 間 接 認 識 に よ り 抗 原 認 識 が な さ れ て い る と 考 え ら れ て い る

。

3−3. 免 疫 特 権

免 疫 特 権 は 、 免 疫 応 答 を 自 動 制 御 し て 過 剰 な 炎 症 を 抑 制 し 、 組 織 を 障 害 か ら 守 る 性 質 で あ り 、 移 植 角 膜 の 生 着 率 が 高 い 理 由 の １ つ と 考 え ら れ て い る 。

角 膜 は 組 織 内 に 血 管 や リ ン パ 管 が な く 、 白 血 球 の 遊 走 が さ れ に く い と い う こ

と が 角 膜 の 免 疫 特 権 の １ つ に な っ て い る

。 臨 床 的 に も 、 原 因 疾 患 に よ り

角 膜 に 血 管 侵 入 を 生 じ て い る 病 巣 に 対 す る 角 膜 移 植 術 は 、 角 膜 移 植 後 拒 絶 反

応 が 血 管 侵 入 の な い 角 膜 病 巣 に 対 す る 角 膜 移 植 術 と 比 較 し て 高 率 に 出 現 す る

と さ れ て い る

。

14

以 前 か ら 、 前 房 内 に 移 植 抗 原 を 投 与 す る と 、 通 常 の 免 疫 応 答 と は 異 な る 全

身 性 免 疫 反 応 が 生 じ る こ と が 知 ら れ て い る 。 す な わ ち 、 前 房 に よ り 誘 導 さ れ

る 移 植 組 織 の 拒 絶 不 能 や 移 植 抗 原 に 対 す る 遅 延 型 過 敏 反 応 の 欠 如 は 、 免 疫 変

異 （

） に 類 似 し た 反 応 と 考 え ら れ 、 前 房 関 連 （ 性 ） 免 疫 偏

位 （

：

） と 呼 ば れ て

い る 。 こ の 免 疫 学 的 特 徴 に は 、

液 性 免 疫 ： 抗 原 特 異 的

抗 体 の 産 生

抑 制 、

細 胞 性 免 疫：抗 原 特 異 的 遅 延 型 過 敏 反 応 の 抑 制 な ど が あ げ ら れ て い

る

。

免 疫 抑 制 性 眼 内 微 小 環 境（

）

は 、角 膜 深 層 か ら 前 房 に か け て 多 く の 免 疫 抑 制 因 子 が 恒 常 的 に 発 現 し て お り 、

眼 内 に 浸 潤 し た 免 疫 細 胞 の 機 能 を 制 御 し て 眼 内 の 恒 常 性 維 持 に 関 与 す る 機 構

で あ る 。 角 膜 移 植 に 関 連 す る 因 子 と し て 、

、

、

glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) family- related protein ligand^{3 0}

、

な ど が あ げ ら れ て い る 。

3−4.

角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 関 連 サ イ ト カ イ ン ・ ケ モ カ イ ン

サ イ ト カ イ ン は 、 細 胞 間 の 情 報 伝 達 を 担 う 低 分 子 量 の タ ン パ ク 質 で あ る 。

免 疫 応 答 を 行 う 免 疫 細 胞 か ら 多 く 分 泌 さ れ 、 免 疫 応 答 の 調 整 や 炎 症 の 惹 起 な

15

ど に 働 く

。 角 膜 移 植 関 連 サ イ ト カ イ ン は 、 角 膜 移 植 の 免 疫 応 答 が

型 ヘ

ル ペ ー

細 胞 （

） に 依 存 し て い る

こ と か ら 、

サ イ ト カ イ ン で あ る

IFN-

γ 、

が 注 目 さ れ て い る 。

ケ モ カ イ ン は 、白 血 球 の 遊 走 を 引 き 起 こ し 、炎 症 を 惹 起 さ せ る 作 用 を 持 つ サ

イ ト カ イ ン で あ り 、

回 貫 通 型 の た ん ぱ く 質 で あ る 。 構 造 か ら 、

、

、

CX3C

、

の

つ の サ ブ フ ァ ミ リ ー に 分 類 さ れ る 。ケ モ カ イ ン は 、ケ モ カ イ ン

受 容 体 を 介 し て 作 用 す る た め 、 疾 患 の 主 要 病 態 に 関 連 す る ケ モ カ イ ン 受 容 体

の 探 索 と と も に 、 治 療 の 標 的 分 子 と し て の 検 討 が 進 め ら れ て い る

。

角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 に 関 し て は 、 認 識 相 に お い て

お よ び

の 重

要 性 が 報 告 さ れ て い る

。ま た 、効 果 相 で は 、

型 免 疫 応 答 が 主 体 と な

る こ と か ら 、

細 胞 に 発 現 し て い る

や

に 関 連 し て い る ケ モ

カ イ ン が 注 目 さ れ て い る 。

は 、

型 転 写 因 子 で あ る

に よ り

遺 伝 子 発 現 が 誘 導 さ れ 、

細 胞 、

細 胞 傷 害 性

細 胞 、 ナ チ ュ

ラ ル キ ラ ー （

） 細 胞 を 含 む さ ま ざ ま な エ フ ェ ク タ ー

リ ン パ 球 に 発 現 が

み ら れ る 。

の リ ガ ン ド と し て は 、 主 に

ケ モ カ イ ン と 呼 ば れ る

CXCL9/MIG

（

γ ）、

（

γ

）、

（

inducible T cell chemoattractant

）や

、が 報 告 さ れ て い る

。

16

は 、 リ ン パ 節 や 炎 症 部 位 に

細 胞 を 誘 導 す る 働 き を 有 す る こ と が 報 告 さ れ

て お り 、

の 阻 害 は

型 慢 性 炎 症 の 抑 制 に 有 用 で あ る と 報 告 さ れ て

い る

。

の 代 表 的 リ ガ ン ド は

α 、

β 、

CCL5/RANTES

、

、

、

な ど で あ り 、

Th1

細 胞 、

細 胞 お よ び 未 熟 樹 状 細 胞 な ど に 発 現 さ れ て い る

。 角 膜 移 植 で は 、

と

と 同 時 に 阻 害 す る こ と で 、 生 存 期 間 が 延 長 し た

と 報 告

さ れ て い る が 、 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 と の 関 連 の 詳 細 に つ い て は 不

明 な 点 が 多 く 残 さ れ て い る 。

【 目 的 】

PKP

マ ウ ス モ デ ル に よ る 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 、 お よ び

マ ウ ス モ デ ル の 作 製 と 同 モ デ ル に お け る 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー を 用 い た 角

膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の 評 価 を 目 的 と す る 。

【 材 料 と 方 法 】

1.

角 膜 移 植 マ ウ ス モ デ ル の 作 製

1) PKP

マ ウ ス モ デ ル の 作 製

マ ウ ス を 用 い た 全 て の 実 験 は 、 日 本 大 学 動 物 実 験 運 営 委 員 会 の 承 認 を 受 け 、

17

実 施 し た （ 承 認 番 号 ： 第

号 ）。

Charles River Japan

（ 横 浜 ） か ら 購 入 し た

マ ウ ス と

マ ウ ス を 使 用 し て 、同 種 同 系 移 植 モ デ ル（

モ デ ル ）お よ び 同 種 異 系 移 植 モ

デ ル（

モ デ ル ）の

種 類 の

マ ウ ス モ デ ル を 作 製 し た 。作 製 は 、既 報

Williams

や

ら の 報 告 を 参 考 に 行 っ た

。 す べ て の マ ウ ス は

〜

週

齢 の オ ス を 用 い た 。

マ ウ ス モ デ ル で は 、

マ ウ ス を レ シ ピ エ ン

ト と し 、

モ デ ル の ド ナ ー に 同 齢 の

マ ウ ス を 、

モ

デ ル の ド ナ ー に 同 齢 の

マ ウ ス を 使 用 し た 。 角 膜 移 植 は 、 三 種 混 合

麻 酔（ メ デ ト ミ ジ ン（

） （

、福 島 ）、ミ ダ ゾ ラ ム（

）

（ サ ン ド 、 東 京 ）、 酒 石 酸 ブ ト ル フ ァ ノ ー ル （

）（

、 東 京 ）） を

0.1ml

腹 腔 内 投 与 し 、 全 身 麻 酔 下 で 施 行 し た 。 レ シ ピ エ ン ト マ ウ ス の 右 眼 の 角 膜 を

の ト レ パ ン で マ ー キ ン グ し 、

剪 刀 で マ ー キ ン グ に 沿

っ て 、切 除 し た 。ド ナ ー マ ウ ス の 角 膜 は

の ト レ パ ン で マ ー キ ン グ し 、

剪 刀 で 切 除 し 、角 膜 移 植 片 を 作 製 し た 。角 膜 移 植 片 を 、レ シ ピ エ ン ト

マ ウ ス の 右 眼 に

（

）針 付 縫 合 糸（

、

マ ニ ー 、 栃 木 ） で 、

か 所 の 単 結 紮 を お こ な っ た 。 移 植 後 、 眼 表 面 を オ フ ロ

キ サ シ ン 眼 軟 膏 （

眼 軟 膏 、 参 天 、 大 阪 ） で 満 た し 、

針 付 縫 合 糸

（

、

＆

、

、

）で 眼 瞼 縫 合 し 、

18

閉 瞼 し た （ 図

）。 眼 瞼 、 角 膜 の 縫 合 糸 は 、 術

週 間 後 に 抜 糸 を 行 っ た 。 術

4

週 間 後 に 、 三 種 混 合 麻 酔 を

腹 腔 内 投 与 し 、 全 身 麻 酔 を か け 、 前 眼 部 を 実 体 顕 微 鏡 で 観 察 、 写 真 を 撮 影 し た 。 拒 絶 反 応 の 程 度 を 確 認 し た 後 、 全 身 麻

酔 下 で 眼 球 を 摘 出 し た 。 眼 球 摘 出 後 に 頚 椎 脱 臼 に よ る 安 楽 死 法 を 行 っ た 。

2) DSAEK

マ ウ ス モ デ ル の 作 製

DSAEK

は 通 常 、 移 植 片 の 接 着 に 、 前 房 内 に い れ た 空 気 に よ る 圧 を 用 い 、 接 着 す る ま で の 間 、安 静 位 が 必 要 と な る 。マ ウ ス で は 、術 後 の 安 静 位 は 難 し く 、

こ れ ま で に モ デ ル マ ウ ス の 報 告 は さ れ て い な い 。 今 回 我 々 は 、 空 気 圧 に 代 わ

り 、 縫 合 を 用 い る こ と で 、 新 た な

マ ウ ス モ デ ル が 可 能 と 考 え 、 作 製

を 行 っ た 。

BALB / c

マ ウ ス と

マ ウ ス を 使 用 し て 、 同 種 異 系

マ ウ

ス モ デ ル を 作 製 し た 。

マ ウ ス モ デ ル は 、

マ ウ ス モ デ ル と 同 様 に

全 身 麻 酔 下 で 角 膜 移 植 を 施 行 し た 。

マ ウ ス の 角 膜 を 直 径

の

ト レ パ ン で マ ー キ ン グ を 行 っ た 後 、

剪 刀 を 用 い 、角 膜 を 切 り 出 し た 。

切 り 出 し た 角 膜 を 攝 子 で 把 持 し て 、 角 膜 実 質 深 層 か ら 内 皮 層 を 剥 離 し た 。 残

っ た 角 膜 上 皮 層 か ら 角 膜 実 質 浅 層 で 構 成 さ れ る 移 植 片 を 上 皮 側 移 植 片 と し た 。

続 い て 、

マ ウ ス の 角 膜 を 直 径

㎜ の ト レ パ ン で マ ー キ ン グ を 行

19

っ た 後 、

剪 刀 を 用 い て 角 膜 を 切 り 出 し た 。切 り 出 し た 角 膜 を 攝 子 で

把 持 し て 角 膜 上 皮 層 か ら 角 膜 実 質 浅 層 を 剥 離 し た 。 残 っ た 角 膜 実 質 深 層 か ら

角 膜 内 皮 層 で 構 成 さ れ る 移 植 片 を 内 皮 側 移 植 片 と し た 。

マ ウ ス の 上

皮 か ら 実 質 浅 層 を 含 む 上 皮 側 移 植 片 と 、

マ ウ ス の 実 質 深 層 か ら 内

皮 を 含 む 内 皮 側 角 膜 片 と を 、 各 実 質 層 が 接 す る よ う に 重 ね 合 わ せ 、

（

）針 付 縫 合 糸 で

か 所 縫 合 し て 複 合 角 膜 移 植 片 を 作 製 し た 。レ シ

ピ エ ン ト で あ る

マ ウ ス の 右 眼 の 角 膜 に

の ト レ パ ン で マ ー

キ ン グ を 行 い 、

剪 刀 で 角 膜 を 切 除 し た 。複 合 角 膜 移 植 片 を 、レ シ ピ エ

ン ト マ ウ ス の 右 眼 に 、

（

） 針 付 縫 合 糸 で 、

か 所 の 単 結 紮 を 行

っ た 。移 植 後 、眼 表 面 を オ フ ロ キ サ シ ン 眼 軟 膏（

眼 軟 膏 ）で 満 た し 、

6-0

針 付 縫 合 糸 で 眼 瞼 を 縫 合 し 、 閉 瞼 し た （ 図

）。 術

週 間 後 に 、 眼 瞼 、 角

膜 の 抜 糸 を 行 っ た 。術

週 間 後 に 、三 種 混 合 麻 酔 を

腹 腔 内 投 与 し 全 身 麻

酔 を か け 、 実 体 顕 微 鏡 で 前 眼 部 を 観 察 、 写 真 を 撮 影 し た 。 拒 絶 反 応 の 程 度 を

評 価 し た 後 、 全 身 麻 酔 下 で 眼 球 を 摘 出 し た 。 眼 球 摘 出 後 に 頚 椎 脱 臼 に よ る 安

楽 死 法 を 行 っ た 。

2.

角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の 評 価 判 定

PKP

マ ウ ス モ デ ル に つ い て 、 眼 球 摘 出 前 に 実 体 顕 微 鏡 下 で 移 植 眼 の ス コ ア

20

リ ン グ を 行 い 、 拒 絶 反 応 の 有 無 、 お よ び 程 度 を 判 定 し た 。 ス コ ア リ ン グ は 、

既 報

や

ら の 評 価 法 に 基 づ い て 、 施 術 者 お よ び 医

師

名 の 確 認 の 下 、 行 っ た

。 評 価 法 を 表

に 示 す が 、 本 法 で は 角 膜 移 植

片 の 混 濁 の 程 度 と 血 管 浸 潤 の 範 囲 で 判 定 し た 。 角 膜 移 植 片 の 混 濁 の 程 度 は 、

瞳 孔 縁 の 外 観 と 虹 彩 紋 理 の 見 え 方 に よ っ て 定 め ら れ て お り 、 ス コ ア は

の

6

段 階 で 評 価 さ れ る 。 角 膜 移 植 片 へ の 血 管 浸 潤 の 程 度 は 、 角 膜 移 植 片 の 周 辺

部 か ら 中 心 部 へ の 進 行 の 程 度 に よ っ て 定 め ら れ て お り 、 ス コ ア は

の

段

階 で 評 価 さ れ る 。 角 膜 移 植 片 の 混 濁 の ス コ ア が

を 示 し 、 か つ 縫 合 糸 除 去

後 の 血 管 新 生 の ス コ ア が

を 示 す と き 、本 評 価 法 の 拒 絶 判 定 基 準 に 従 っ て 、

拒 絶 あ り と 判 定 し 、上 記 を 満 た さ な い も の は 、拒 絶 な し と 判 定 し た 。

マ ウ ス モ デ ル で は 、 上 記 の

マ ウ ス モ デ ル と 同 様 の 方 法 で 角 膜 移 植 後 拒

絶 反 応 の 評 価 を 行 っ た 。

3.

角 膜 移 植 片 に お け る 免 疫 応 答 関 連 遺 伝 子 発 現 の 検 討

レ ー ザ ー マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン 法

免 疫 応 答 関 連 遺 伝 子 発 現 を 検 討 す る た め の 角 膜 組 織 を 、レ ー ザ ー マ イ ク ロ ダ

イ セ ク シ ョ ン 法 を 用 い て 未 固 定 凍 結 切 片 か ら 採 取 し た 。

摘 出 し た 眼 球 と 眼 瞼 は 未 固 定 の ま ま 、

コ ン パ ウ ン ド で 凍 結 包 埋 し た 。

21

そ の 後 、ク ラ イ オ ス タ ッ ト（

、

、

）を 用 い て

の

凍 結 切 片 を 作 製 し た 。 凍 結 切 片 は 、冷

％ メ タ ノ ー ル 中 で

秒 間 固 定 後 、

0.02

％ ト ル イ ジ ン ブ ル ー で 染 色 し た 。 次 に 、 レ ー ザ ー マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン 法（

、

）に よ り 、凍 結 切 片 か ら 移 植 片 角 膜 を 切 り 出 し た（ 図

）。 切 り 出 し は 、 角 膜 上 皮 層 か ら 内 皮 層 ま で の 全 層 を 移 植 片 の み を 含 む よ う 切 り 出 し 、 計

枚 の 凍 結 切 片 か ら 集 め た 。 切 り 出 し た 角 膜 を

の ミ ネ

ラ ル オ イ ル（

、

、

）を 含 む

キ

ャ ッ プ（

）に 回 収 し て サ ン プ ル と し た 。サ ン プ ル か

ら 核 酸 抽 出 キ ッ ト（

、千 葉 ）

を 用 い て

（

） を 抽 出 し 、

逆 転 写

キ ッ ト（

、東 京 ）を 用 い て

と し た 後 、使 用 す

る ま で

で 保 存 し た 。

2) PCR array

法

PKP

マ ウ ス モ デ ル の 角 膜 移 植 片 に 発 現 し て い る 免 疫 応 答 関 連 遺 伝 子 を ス ク

リ ー ニ ン グ す る た め に 、

法 を 施 行 し た 。

法 に は 、 レ

ー ザ ー マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン 法 に よ り 得 ら れ た

モ デ ル サ ン プ ル

（

）お よ び コ ン ト ロ ー ル と し て 同 週 齢 の 未 処 置 マ ウ ス か ら 同 様 の 方 法 で

22

採 取 し た 健 常 角 膜 サ ン プ ル （

） を 使 用 し た 。 サ ン プ ル か ら

を 抽

出 し た 後 、

（

、

） を 使 用 し て

を 作 製 し た 。

PCR array

法 は 、

（

） を 用 い て 遺 伝 子 発

現 の 多 項 目 同 時 解 析 を 行 っ た （ 表

）。 今 回 の 実 験 に は 、

Array, Mouse Innate & Adaptive Immune Responses

（

QIAGEN

） キ ッ ト を 使 用 し 、 キ ッ ト の 使 用 方 法 に 従 っ て 反 応 液 を 調 整 し て リ ア ル タ イ ム サ イ ク ラ ー（

、

）で 測 定

し た 。 測 定 結 果 は 、

ソ フ ト ウ ェ ア を 用 い て 、 Δ Δ

ベ ー ス の 倍 率 変 化 に 算 出 、 変 換 し た

。

3)

定 量 的 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 （

定 量 的 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応

：

は 、

法 に よ る 免 疫 応 答

関 連 遺 伝 子 発 現 の ス ク リ ー ニ ン グ で

マ ウ ス モ デ ル と コ ン ト ロ ー ル と の

間 で 差 が あ っ た 項 目 に つ い て 、

群 （

）、

群 （

）、

お よ び

群 （

） の サ ン プ ル を 用 い て

法 を 施 行 し た 。 今

回 の

法 の

お よ び

に は

23

Assays

（

）を 使 用 し た 。測 定 項 目 は 、試 料（ 角 膜 移 植 片 ） の 量 的 問 題 か ら 、 特 異 性 の 高 い も の か ら 選 択 し た 。 項 目 は

(Mm00445235_m1)

と そ の 受 容 体 で あ る

、

と そ の 受 容 体 で あ る

、

と し 、 サ ー マ ル サ イ ク ラ ー （

）で

を 施 行 し た 。結 果 は 、内 因 性 コ ン ト

ロ ー ル （ β

、

） を 用 い 、 Δ Δ

法 で 算 出 し た

。

4)

免 疫 組 織 化 学 染 色

摘 出 し た 眼 球 を 未 固 定 凍 結 包 埋 し 、 ク ラ イ オ ス タ ッ ト で

の 凍 結 切 片 を

作 製 し た 。凍 結 切 片 は 、

パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド で 後 固 定 後 、蛍 光 抗 体 法 に

使 用 し た 。 蛍 光 抗 体 法 は 、 以 下 の 手 順 で 単 染 色 ま た は

重 染 色 を 行 っ た 。

最 初 に 凍 結 切 片 を

、 東 京

を

用 い て

分 間 ブ ロ ッ キ ン グ し 、 第

抗 体 と

で 反 応 さ せ た 。 第 １

抗 体 は 、 抗 マ ウ ス

ウ サ ギ ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 （

Antibodies

、

、

）と 抗 マ ウ ス

ラ ッ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体（

Thermo Fisher Scientific

） と を 含 ん だ カ ク テ ル 抗 体 液 を 作 製 し て 染 色 に 用

い た 。第 １ 抗 体 を 洗 浄 後 、第

抗 体 を 反 応 さ せ た 。第

抗 体 は

24

488 Donkey anti-rat IgG

（

）、 お よ び

（

） を

用 い 、 室 温 で

分 間 反 応 さ せ た 。

で 洗 浄 後 、 最 後 に 核 染 色 と し て

diamidion-2-phenylindole (DAPI)

に よ る 染 色 を 行 っ た 。蛍 光 抗 体 法 で 染 色 し た ス ラ イ ド は 、 顕 微 鏡 下 で 観 察 後 、 組 織 写 真 を

デ ジ タ ル カ メ ラ

（

、 キ ー エ ン ス ジ ャ パ ン 、 大 阪 ） で 撮 影 し た 。

4.

統 計 学 的 検 討

統 計 解 析 に は 、統 計 解 析 ソ フ ト と し て

（

、

、

）お よ び

統 計 解 析（ エ ス ミ 、東 京 ）を 用 い た 。

で 得 ら れ た 結 果 の 群 間 比 較 に は 、

2

群 間 比 較 に は マ ン ホ イ ッ ト ニ ー の

検 定 、

群 間 比 較 に は ス テ ィ ー ル 検 定

を 用 い た 。

【 結 果 】

1. PKP

マ ウ ス モ デ ル

1)

拒 絶 反 応 の 臨 床 ス コ ア

PKP iso

群

頭 の 臨 床 ス コ ア （ 角 膜 混 濁 ） は 、

（ 平 均 ±標 準 偏 差 ）

（ 点 ）、

頭 す べ て が 拒 絶 な し の 判 定 と な っ た 。 一 方 、

群

頭 の 臨

25

床 ス コ ア （ 角 膜 混 濁 ） は

、 血 管 侵 入 は

頭 す べ て で 見 ら れ 、

頭 が

拒 絶 な し 、

頭 が 拒 絶 あ り の 判 定 と な っ た 。 拒 絶 の 有 無 に つ い て 両 群 間 を 比

較 す る と 、 統 計 学 的 に 有 意 な 差 を 認 め た （

、

の 正 確 確 率 検

定 ）（ 表

）。

2)

角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の バ イ オ マ ー カ ー の 探 索

ⅰ

法 を 用 い た バ イ オ マ ー カ ー 候 補 遺 伝 子 の ス ク リ ー ニ ン グ

拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー 選 択 の た め の ス ク リ ー ニ ン グ と し て

法

を 施 行 し た 。

法 の 結 果 を 表

に 示 す 。 正 常 眼 を コ ン ト ロ ー ル と し

て 、

マ ウ ス モ デ ル で

倍 以 上 増 加 し て い る 因 子 を 抽 出 し た 。

、

lysosome 2

、

、

、

、

、

、

が

倍 以 上 増 加 し て い た 。

ⅱ

群 、

群 の 比 較 に よ る バ イ オ マ ー カ ー の 探 索

PCR array

法 の 結 果 に 基 づ い て 、 バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 を 目 的 に

法 を 行 っ た 。 対 象 と す る 遺 伝 子 は 、 試 料 が 少 数 で あ る こ と か ら 、 不 足 す る 可

能 性 を 考 慮 し 、 限 定 し た 。 対 象 遺 伝 子 と し て 、

、

系 お

よ び

系 を 選 別 し 、 そ れ ら の 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー と し て の 有

26

用 性 を

群 お よ び

群 に お い て

法 を 用 い て 検 討 し

た 。 各 群 か ら 得 ら れ た

の 平 均 濃 度 は 、

群 で

（

）、

PKP allo

群 で

（

） で あ り 、 こ れ を 基 に

法 を 施 行 し た 。

CXCR3 mRNA

発 現 量 の 測 定 値 は 、

群 で

（ 中 央 値 ） （ レ ン ジ ：

4.8

）

群 で

（

） で あ り 、

群 は

群 と 比 較 し

て 有 意 に 高 値 を 示 し た （ 図

マ ン ホ イ ッ ト ニ ー の

検 定 ）。

CXCL10 / IP-10

（

）、

（

）、

（

）、

CD14

（

）

発 現 量 に つ い て は 、

群 と

群 と の 間

に 統 計 学 的 な 有 意 差 は な か っ た （ 図

）。

ⅲ

３ の 由 来 細 胞 、 お よ び 局 在 の 観 察

CXCR3

の 由 来 す る 細 胞 の 探 索 、 お よ び 移 植 片 に お け る 局 在 を 調 べ る た め に 、 免 疫 組 織 化 学 染 色 を 行 っ た 。

群 の 凍 結 切 片 を 用 い て

と

と に 対 す る 蛍 光 抗 体 法

重 染 色 を 施 行 し た 。

陽 性 細 胞 は 、 移 植

片 の 角 膜 実 質 層 に 浸 潤 細 胞 像 と し て 、陽 性 像 が 観 察 さ れ た 。

陽 性 細 胞 は 、

移 植 片 角 膜 内 の 浸 潤 細 胞 に 多

数 の 陽 性 像 が 観 察 さ れ た 。

と

と の

重 染 色 で 陽 性 を 示 す 浸 潤 細

胞 が 移 植 片 角 膜 内 に 観 察 さ れ た （ 図

）。

27 2. DSAEK

マ ウ ス モ デ ル

1)

拒 絶 反 応 の 臨 床 ス コ ア

DSAEK

マ ウ ス モ デ ル の 臨 床 ス コ ア と

、

、

、

CCL5/RANTES

、

発 現 量 と の 関 係 を 表

に 示 し た 。

頭 の 中 で 、

臨 床 ス コ ア の う ち 角 膜 混 濁 ） が

点 以 上 、 か つ 血 管 侵 入 が

点 以 上 を 示 し 、

拒 絶 反 応 あ り と 判 定 し た も の が

頭 、 上 記 を 満 た さ ず 拒 絶 反 応 無 し と 判 定 し

た も の が

頭 だ っ た 。 臨 床 ス コ ア の 平 均 は

（ 平 均

標 準 偏 差 ）。 拒 絶

反 応 の 有 無 に つ い て 、

群 と

群 で は 、 有 意 な 差 が 見 ら れ

（

、

の 正 確 確 率 検 定 ）、

群 と

群 で は 、 差 が

な か っ た （

、

の 正 確 確 率 検 定 ）（ 表

）。

2) CXCR3

に よ る

群 と

群 、

群 の 比 較

PKP iso

群 と

群 間 で 差 の み ら れ た

に つ い て 、

群

に お い て も 、同 様 に

を 施 行 し た 。

群 に お け る サ ン プ ル か ら

得 ら れ た

平 均 濃 度 は

（

） で あ り 、

の 発 現 量

は 、

（ 中 央 値 ）（ レ ン ジ ：

） で あ っ た 。

群 に お け る

mRNA

発 現 量 を

群 お よ び

群 と 比 較 す る た め 、

群

28

を 基 準 と し て ス テ ィ ー ル 検 定 を 行 っ た 。 結 果 、

群 と 比 較 し て

allo

群 は 、

に つ い て 有 意 に 高 値 を 示 し た（

）が 、

群

と

群 と の 間 に 差 は な か っ た（

）。

、

、

CCL5 / RANTES

、

に つ い て は 、

因 子 と も に

群 で 高 値 、

iso

群 お よ び

群 で 低 値 を 示 す 傾 向 が あ っ た が 、

群 間 に 統 計 学 的 有 意

差 は な か っ た （ 図

）。

【 考 案 】

現 在 、 角 膜 移 植 に お け る 拒 絶 反 応 に 関 連 す る 免 疫 応 答 は 、 モ デ ル マ ウ ス を

用 い て の 実 験 に よ り 徐 々 に 解 明 が 進 ん で い る も の の 、 ま だ 十 分 な 理 解 が 得 ら

れ て い な い 。 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 の 動 物 モ デ ル に お い て 、 拒 絶 反 応 の 判 定 評

価 は 、 一 定 期 間 後 に 顕 微 鏡 下 で 観 察 さ れ る 角 膜 移 植 片 の 混 濁 や 周 囲 か ら の 血

管 侵 入 の 程 度 を ス コ ア 化 し て 判 定 さ れ て き た 。 し か し 、 拒 絶 反 応 ス コ ア は 、

観 察 者 の 主 観 に 影 響 を 受 け る こ と が 大 き く 、 評 価 の 再 現 性 や 定 量 の 正 確 性 に

問 題 を 含 ん で い る 。 そ の た め 、 拒 絶 反 応 の 有 無 、 お よ び 重 症 度 判 定 の 正 確 性

を 得 る た め に は 、 客 観 的 な 定 量 性 に 優 れ た 評 価 方 法 が 必 要 と さ れ る 。 そ の 点

に お い て 、 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 に 対 す る 眼 局 所 の バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 は 重

要 な 意 味 を も つ と 考 え ら れ た 。 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー の 設 定 は 、 定 量 評 価

29

が 可 能 に な る だ け に と ど ま ら ず 、 遺 伝 子 の 種 類 か ら 拒 絶 反 応 の 機 序 の 解 明 の

一 助 に も な り う る 利 点 を 有 す る と 考 え ら れ た 。

一 方 、 近 年 の 角 膜 移 植 で は 、 拒 絶 反 応 の リ ス ク を 減 ら す た め に 、 角 膜 パ ー

ツ 移 植 が 主 流 に な っ て い る 。

も 角 膜 パ ー ツ 移 植 の

つ で あ り 、 角 膜

内 皮 移 植 と 考 え ら れ て い る 。

の 拒 絶 反 応 に 関 し て は 、

と 比 較 し

て 、 拒 絶 反 応 の 発 生 率 が 少 な い と す る 報 告

が あ る 。 こ の 正 確 な 機 序 は 不

明 で あ る が 、 現 在 の と こ ろ 、

と 移 植 片 量 の 少 な さ が 影 響 し て い る と

考 え ら れ て い る 。 前 房 内 に 移 植 片 全 体 を 挿 入 す る こ と で 、 よ り 効 果 的 に

が 働 き 、 ま た 移 植 片 量 が 少 な い こ と で 、 抗 原 提 示 細 胞 や 抗 原 の 量 も

少 な く 済 む た め 、 拒 絶 の 発 生 率 が 抑 え ら れ る と 考 え ら れ て い る

。

今 回 、 我 々 は 角 膜 移 植 マ ウ ス モ デ ル と し て 、

マ ウ ス モ デ ル 、

allo

マ ウ ス モ デ ル 、 お よ び

マ ウ ス モ デ ル の

種 類 を 用 い た 。 現 時 点

で は 、

マ ウ ス モ デ ル は 確 立 さ れ た 動 物 モ デ ル と し て 角 膜 移 植 後 拒 絶 反

応 の 研 究 に 用 い ら れ て い る 一 方 で 、

の 研 究 に 用 い ら れ る マ ウ ス モ デ

ル に 関 し て は 様 々 な 問 題 を 含 ん で お り 、 動 物 モ デ ル が 確 立 し た と は 言 い 難 い

状 況 で あ る 。 前 述 し た と お り 、

術 後 は 、 ド ナ ー 角 膜 と レ シ ピ エ ン ト

角 膜 が 接 着 す る よ う 、 前 房 内 に 注 入 し た 空 気 に よ る 圧 迫 が 必 要 で あ り 、 こ れ

に は 長 時 間 の 仰 臥 位 安 静 が 必 須 で あ る 。 マ ウ ス に お い て は 、 仰 臥 位 安 静 の 維

30

持 は 難 し く 、 ま た 麻 酔 を 用 い た と し て も 、 マ ウ ス へ の 影 響 が 大 き い と い う 問

題 が 生 じ る 。 以 上 の 点 か ら 、 現 在 、 ヒ ト と 同 様 の 手 技 を 用 い た

マ ウ

ス モ デ ル の 報 告 は な さ れ て い な い 。 今 回 、 我 々 は 、 同 一 の 手 技 で は な い も の

の 、 空 気 圧 に よ る 角 膜 移 植 片 の 接 着 の 代 替 と し て 、 縫 合 を 用 い る こ と で 、 異

系 角 膜 実 質 深 層 と 内 皮 と を 移 植 す る と い う 観 点 か ら 、

と 同 様 の 形 態

を と っ た マ ウ ス モ デ ル の 作 製 を 行 っ た 。 縫 合 糸 は 術

週 後 に 抜 糸 を 行 っ た

が 、 術

週 後 に 採 取 し た 角 膜 の ヘ マ ト キ シ リ ン ・ エ オ ジ ン 染 色 で 、 角 膜 実

質 深 層 か ら 角 膜 内 皮 層 が 確 認 で き 、 形 態 上 の 妥 当 性 は 得 ら れ た と 考 え た （ 図

）。

マ ウ ス モ デ ル 作 製 に お い て は 、 移 植 片 の 小 さ さ か ら 、 複 合 移 植

片 を 作 製 す る 点 で 困 難 で あ る が 、 安 定 し て 作 製 す る こ と に 成 功 し た 。 そ し

て 、 こ の

マ ウ ス モ デ ル に お け る 角 膜 移 植 後 拒 絶 反 応 を 、 拒 絶 反 応 バ

イ オ マ ー カ ー を 用 い て

マ ウ ス モ デ ル お よ び

マ ウ ス モ デ ル

と の 比 較 を 行 っ た 。

本 研 究 で は 、 以 下 の 結 果 が 得 ら れ た 。 １ ） 免 疫 関 連 因 子

の 発 現 量 を

PKP iso

群 と

群 と で 比 較 す る こ と に よ り 、

発 現 量

が 拒 絶 反 応 バ イ オ マ ー カ ー と し て 特 異 性 が 高 い こ と 、 お よ び

10

、

、

、

発 現 量 は 角 膜 移 植 後 の 非 特 異

的 炎 症 反 応 に よ り 増 加 す る 因 子 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 ２ ） 拒 絶 反 応 バ