ヒト血清アルブミンの構造と機能に及ぼす酸化の影響

熊本大学学位論文

ヒト血清アルブミンの構造と機能に及ぼす酸化の影響

2 003 

安 楽 誠

E f f e c t  o f  o x i d a t i v e  s t r e s s  on t h e  s t r u c t u r e  and  f u n c t i o n  o f  human serum a l b u m i n  

恥

1 a k o t o Anr aku 

目次

第１章  緒言--- 1

第２章  腎障害時における血清中酸化型ヒト血清アルブミン(HSA)分子種の変動 第１節  序

--- 8

第２節  結果--- 9

２−１  腎透析患者における血清中酸化型 HSA分率---9

２−２  腎透析患者における血漿中蛋白質酸化の程度

---10

２−３  腎透析患者の血漿中蛋白質酸化における HSA寄与率--- 11

２−４  腎透析患者における血清抗酸化能

---12

２−５  腎透析患者に併用投与される鉄剤のHSAへの影響---13

第３節  考察---18

第４節  小括---21

第３章  In vitroにおける酸化HSAの調製とその特性

---22

第１節  序

---22

第２節  結果---24

２−１  酸化HSA誘導活性酸素種の検索---24

２−２  酸化HSAの調製---24

２−３

 酸化HSAの酸化の程度の比較 --- 27

２−４

 各種酸化剤による標的アミノ酸残基の比較 ---28

 2-4-1

 Cys残基の酸化 ---28

 2-4-2  Met残基の酸化

---29

 2-4-3  塩基性アミノ酸残基の酸化

---29

 2-4-4  Trp及びTyr残基の酸化

---30

２−５  各種酸化剤による酸化HSAの構造特性---31

 2-5-1  CDスペクトル---31

 2-5-2  疎水性評価

---32

２−６  各種酸化剤による酸化HSAの機能特性---33

 2-6-1  リガンド結合性に及ぼす酸化の影響

---34

 2-6-2  エステラーゼ様活性に及ぼす酸化の影響

---35

２−７  各種酸化剤による酸化HSAの生体内動態特性---36

第３節  考察---38

第４節  小括---42

第４章  HSA変異体による酸化部位の比較検討

---43

第１節  序

---43

第２節

 結果 ---44

２−１  変異型HSAのコンフォメーション変化

---45

２−２

 変異型HSAの機能特性 --- 47

 2-2-1  抗酸化能評価 (DRD測定）

---48

 2-2-2  抗酸化能評価 （SDS-PAGE）--- 49

第３節  考察---51

第４節  小括---57

第５章 総括---58

実験の部

--- 61

参考文献

--- 70

第１章 緒言

 生体内では、酸素を利用する過程において種々の活性酸素種が生成している。しかし、

生体はこの活性酸素種を消去する巧みな防御機構を充分に備えているため、生理的条件下 では酸素代謝の副産物である活性酸素種やフリーラジカルの産生はそれほど重要視するも のではない。ところが何らかの理由で、これらの防御能を上回る量の活性酸素種が生じる と、重篤な病態を惹起する。その代表的なものがガンであり、その他、動脈硬化を始めと する多くの生活習慣病が発症する。近年、アルツハイマー病や血管障害性脳疾患の発症機 序の一つとして、老人斑へのβ-アミロイドの酸化的凝集沈着が注目されている^1,2)。さらに 活性酸素による細胞障害は、加齢に関係して発症する各種疾患の成因の一つとして重視さ れており、ラジカル捕捉剤の治療への応用も検討されている³⁾。

 通常、生体内に取り込まれた酸素の数％は、常に種々の酵素代謝系などでスーパーオキ シドアニオン

(O

)

(H

O

)

(OH

)

Extracellular O ₂

O ₂ - NADPH

oxidase

NO

ONOO-

H ₂ O ₂

Fe ³⁺ /Fe ²⁺ .OH

MPO Cl.

RH R.

HOCl

Protein

Oxi-Protein .OH

Fig.1 Possible oxidant generating reaction

変化する。このうち、不対電子を持つO₂^-とOH・は寿命が短い。OH・が最も高い反応性を 有しており、ほとんど拡散律速で様々な分子と反応する。

O

OH・を生成したり（ Fenton

(NO)と反応して、NOのもつ生理作用（血管弛緩作用など）を消失させる

オキシナイトライト(ONOO^-

)を生成させ酸化障害を起こす (Fig.1)

SOD

 血清中において、最も高濃度に存在するヒト血清アルブミン（

HSA

HSA

LDL-

HSA

HSA

ラジカルの処理や抗酸化作用が滞り、動脈硬化が進展する可能性が考えられる。さらに、

HSA

HSA

HSA

34

Cys

Era

Asahipack GS-502N

SH

(HMA

)

Cys

(HNA

)

HMA

特に、糖尿病や腎透析患者で顕著に減少することも確認している¹⁸⁾。これらの結果から、還

34

Cysのみの酸化で説明できるのかについては不明な点が数多く残されている。

 事実、

Stadtman

(Met)

性サイトの入り口に位置していることに注目し、活性サイトにおいて機能発現や構造維持 に重要なアミノ酸残基をラジカルによるダメージから守るスカベンジャーとして、

Met

Met

MSOX

MSOX

Met

したがって、

Met

in vivo

Met

Met

HSA

Cys

HSA

HSA

in vivo

HSA

 HSAはビタミンD結合蛋白質、α-フェトプロテイン、アファミン（α

-アルブミン）を含

約

66.5kDaの糖鎖を持たない単量体蛋白質である

17対はジスルフィ

ド結合を形成し、9つのループの構築やHSAの構造安定化に大きく寄与しているものと思わ

れる^24,25)。その他、一次配列上の特徴として、

34番目と214番目に各々唯一遊離状態の

Cys

とトリプトファン残基（²¹⁴

Trp）を有している。HeらはHSAのX線結晶構造解析より、HSA

I、II及びIIIから構成されることを明ら

2つのサブドメイン A及びBに細分される。また、 Sudlow

I（ワルファリン結合サイト）及びサイトII

（インドール、ベンゾジアゼピン結合サイト）はそれぞれサブドメイン

IIAとIIIAに位置す

  最近、

Watanabe

HSA

HSA

。その結果、特にサイト

II

410

(

Arg)

411

(

Tyr)

Cys-34

Site I Site II

Trp-214

Fig.2 Structure of HSA

質の設計が可能になった。さらに、

HSA-リガンド複合体の X線結晶構造解析が盛んに行わ

HSA

HSA

(Table 1)が、HSAの多型が、生きていく上で重篤な症状

familial dysalbuminemic hyperthyroxinemia：FDH）の研究は、現在も盛んに行われてい

る^32-38)。これは、サイト

Iに位置する218番目のアルギン残基(

Arg)のヒスチジン (His)

ロリン(Pro)への変異に起因するもので、L-サイロキシンのHSAへの結合定数が約10倍増大

Residue

Table 1 Location of mutations of HSA

Codon change Geographical names and [references]; in order of reports Amino acid change

From To

-2 Arg His GGT CAT + Lille; Pollibauer, Somalia,

Tokushima ,Taipei, Fukuoka-2, Varese; Wu Yang ; Mayo, Komagone-3.

-2 Arg Cys CGT TGT + (-2 to -6 omitted) Malmo I,

Kaikoura , Tradate Redhill (see also residue 320); high in Italy, Sweden, 3 homozygotes; Ildut .

-1 Arg Glu CGA CAA + Christchurch; Gainesville ,Y,

Honolulu-2, Fukuoka-3; Mayo;

Shizuoka

-1 Arg Pro CGA CCA + Takefu; Honolulu-1

-1 Arg Leu CGA CTA + Jaffna

1 Asp Val GAT GTT + Blenheim ; Bremen ;

Malmo"II;Iowa City-2

3 His Gln CAC CAA/G Nagasaki-3

3 His Tyr CAC TAC+ Larino*

32 Gln Stop CAG TAG+ Analbuminemia case #18

(Codogna)

60 Glu Lys GAA AAA Torino

63 Asp Asn GAC AAC CHO Dalakarlia [12], SW-1, Malmo"-

95 . CHO next to Cys

82 Glu Lys GAA AAA Vibo Valentia

114 Arg Stop CGA TGA+ Analbuminemia case #3

(Bethesda)

122 Val Glu GTG GAG+ Tregasio

177 Cys Phe TGC TTC+ Hawkes Bay

214 Intron 6,3' AG GG + Analbuminemia case #16

214 Intron 6,3' G/G G/A + Analbuminemia case #15 (Vancouver)

(Trp214 stop)

218 Arg His CGC CAC+ Familial dysalbuminemic

hyperthyroxinemia (FDH)

225 Lys Gln AAA CAA+ Tradate-2

240 Lys Glu AAA GAA+ Herborn

267 Exon 8 a insert + Analbuminemia cases 10,11

(Perugia)

268 Gln Arg CAA CGA Skane SW

269 Asp Gly GAT GGT Niigata, Nagasaki-1

276 Lys Asn AAG AAC Caserta

313 Lys Asn AAG AAT+ Tagliacozzo; Cooperstown ;

Canterbury , New Guinea , Reading , IRE-1

318 Asn Lys AAG AAT/C O"rebro SW, Malmo-4

Residue Codon change Geographical names and [references]; in order of reports Amino acid change

From To

320 Ala Thr GCT ACT CHO Redhill(gives AsnTyrThr site for

glycosyl'n); also see -2 Arg Cys (Malmo"-I)

321 Glu Lys GAG AAG Roma

333 Glu Lys GAA AAA Sondrio

354 Glu Lys GAA AAA Hiroshima-1

358 Glu Lys GAG AAG Coari I, Porto Alegre I

Asp His GAT CAT Parklands

365

Asp Val GAT GGT Iowa City-1

365

Lys Glu AAA GAA Naskapi Mersin ; Komagone-1

372

Asp Asn GAT AAT

375 Nagasaki-2

Glu Lys GAA AAA

376 Tochigi

Glu Gln GAA CAA

376 Malmo-3

Glu Lys GAA AAA

382 Hiroshima-2

410** Arg Cys CGT TGT Liprizzi

479 Glu Lys GAA AAA Dublin

494 Asp Asn GAT AAT CHO Casebrook

501 Glu Lys GAG AAG+ Vancouver, Birmingham, Adana; Porto

Alegre II , Manaus I , Lambadi, Kashmir

505 Glu Lys GAA AAA Ortonovo

536 Lys Glu AAG GAG Castel di Sangro

541 Lys Glu AAA GAA Maku' (Wapishana) ;

Oriximina I

550 Asp Gly GAT GGT Mexico

550 Asp Ala GAT GCT Dalakarlia, Malmo"-62

560 Lys Glu AAG GAG Church Bay

563 Asp Asn GAT AAT Fukuoka-1 ; Ube-1; Varese-2,

Paris-2 ,

565 Glu Lys GAG AAG Osaka-1

567 Cys - TGC GC+ Bazzano*; (Frameshift:

CFAEEGKKLVAASQAALGL ->

ALPRRVKNLLLQVKLP) Lys

570 Glu GAG AAG+ B, Oliphant ; Verona*; Osaka-2

;Phnom Penh; Nagano; Iowa City-3;

Mayo ; Victoria (East India); Saitama- 1

572 Intron 13-5' G C Rugby Park (Exon 14 omitted:

GKKLVAASQAALGL -> LLQFSSF)

572 Intron 14-5' GT TT Venezia(Exon 14

omitted:GKKLVAASQAALGL ->

PTMRIRE(R)(K))

573 Lys Glu AAA GAA+ Milano fast

573 Lys Asn AAA AAT/C Vanves

580 Gln - CAA AA Catania (Frameshift: QAALGL ->

KLP)

することにより、血漿中総サイロキシン濃度は正常時に比べ高いもので

20倍上昇する。血

数種の多型に関しては、薬物結合特性に変化が生じることが報告されている^39,40)。このよう にHSA遺伝子に変異を持つ個体は平常時特別な症状を呈しないため、その変異の研究は無 害な突然変異の頻度や変異パターンに興味が注がれてきた。一方、ヒトの異常アルブミン

（variant）における分解促進及び金属や脂肪酸への結合の変動メカニズムの解明は、まだ 始まったばかりである。臨床において、アルブミンは様々な疾患時に汎用されているが、

投与したHSAの消失が速いため、頻繁な投与を必要とする。この原因の一つとして、疾病 による酸化ストレス条件下でHSAが酸化され、消失が促進することが挙げられる。したがっ て、ラジカル酸化を受けにくい

HSAを部位特異的変異法で作製することができれば、投与

  このような背景の下、生体内における

HSA

Era

HPLC

HSA

HSA

in vitro

HSA

HSA

HSA

HSA

HSA

HSA

 以下に得られた知見を詳述する。

第２章 腎障害時における血清中酸化型ヒト血清アルブミン（HSA）分子種の変動

第１節 序

 HSAに唯一遊離状態で存在している

Cysは、生体内においてリガンドのスカベンジャー

Cysの生理学的意義が注

Cys

HMA）とい

このHMAの存在比率はメルカプト分率といわれ、各種疾患、加齢などで変動することが報 告されている¹⁶⁾。そこで、HSAの酸化型、還元型を分離するAsahipack GS-502Nという特殊 なカラムを用いることにより、健常時及び病態時、特に腎透析患者での酸化HSAの変動を、

HMA, HNAを定量することにより比較検討した。また、酸化HSAの血清中での酸化の程度

HSAの重要性についても検討

/還元型比の違いを比較検討するとともに、鉄剤の

第２節 結果

 ２-１ 腎透析患者における血清中酸化型HSA分率

 Fig.3に健常人（男性、age; 24）及び腎透析患者（男性、age; 66)のHPLCプロファイルを 示す。第一のピークはメルカプト型（HMA）、第二のピークはシステインやグルタチオン と混合ジスルフィドを形成しているノンメルカプト型（

HNA

;HNA-1

; HNA-2）を表す。

健常人ではHMAが約8割を占め、HNA-2はほとんど存在しない。一方、腎透析患者では、

HMAが大きく低下し、HNA-1,HNA-2の増加が観察された。また、Table 2に示すように、

健常人（n = 6）、腎透析患者（n = 66）でのHMA, HNA-1, HNA-2の存在比率を検討した 結果、先のHPLCプロファイルを反映して、腎透析患者におけるHMAの顕著な減少が認め られた一方で、HNA-1及びHNA-2の上昇が観察された。また、このときの血清中のフリー のCys濃度を測定したところ、健常人に対して腎透析患者で約

3割の低下が観察された (Fig.4)。

Fig. 3 HPLC profile of serum from a normal subject (A) and a patient of renal failure (B) HMA ; mercaptoalbumin (reduced form), HNA-1; nonmercaptoalbumin (disulfide form),  

HNA-2; nonmercaptoalbumin (oxidized form)

10 20 30 40 10 20 30 40

Retention time (min)

(A) HMA (B)

HMA

HNA-1 HNA-1

HNA-2 HNA-2

** P < 0.001 as compared with sera of normal subjects.

Table 2 f values (%) for HSA and oxidized HSA in sera from normal subjects and patients of renal failure

normal subjects (n = 6)

HMA HNA-1 HNA-2

78.5 ± 3.51 19.8 ± 3.35 1.64 ± 0.79

patients of renal failure (n = 66)

50.6 ± 8.6 **

41.9 ± 7.8 **

7.55 ± 3.3 **

0 0.5 1

patients of renal failure normal subjects

Relative contents of free Cys

**

Fig. 4 Relative contents of free Cys of sera from normal subjects (n=6) and patients of renal failure (n=66) **P < 0.001 as compared with sera of normal subjects.

２-２ 腎透析患者における血漿中蛋白質酸化の程度

 多くの場合、蛋白質の酸化はカルボニル含量の増大を伴う⁴¹⁾。そこで、健常人及び腎透析 患者の血漿中蛋白質がどの程度酸化されているのか確認するために、まずカルボニル含量 を測定した。

Fig.5

0.00 0.05 0.10 0.15

normal subjects patients of renal failure

Fig. 5 Carbonyl content of plasma from normal subjects (n=6) and patients of renal failure (n=66) ** P < 0.001 as compared with plasma of normal subjects.

[Carbonyl content] / [Plasma]

**

２-３ 腎透析患者の血漿中蛋白質酸化におけるHSA寄与率

 先の腎透析患者のカルボニル含量の増大により、血漿中蛋白質の酸化が確認された。し かし、この所見は、血漿中のすべての蛋白質についてであり、どの蛋白質がどの程度酸化 されているかは定かではない。事実、血漿中には、

HSAを始め、トランスフェリン、フィ

における

HSAの寄与率について健常人及び腎透析患者間で比較検討した

Fig.6に示すように、血漿中を代表する HSA、トランスフェリン、フィブリノーゲン、免疫

グロブリンのなかで、腎透析患者において最も

HSAが酸化されていることが明らかとなっ

Fig. 6 (I) Western blots of plasma from normal subjects and patients of renal failure after derivatization and staining with Oxyblot Kit reagents (II) Plasma protein carbonyl formation measured by western blots of plasma from normal subjects (n=6) and patients of renal failure (n=20) *P< 0.05 vs. normal subjects.

(I)

Fibrinogen (340kDa) Immunoglobulin (180kDa) Transferrin (80kDa)

HSA (67kDa) Protein Carbonyl

N R N R

A) B)

N; normal subjects

R; Patients of renal failure

0 HSA Transferrin Immuno globulin

Fibrinogen (II)

0.5 1 1.5

2 2.5

3

*

Relative densitometry units

N R N R N R N R

２-４ 腎透析患者における血清中抗酸化能

 先の結果から、血漿中において HSA

HSA

ジヒドロローダミン123(DRD)を用い、希釈した血清中に活性酸素である過酸化水素を添加 することにより、DRDからローダミン123(RD)への酸化速度を蛍光スペクトルでモニターし て測定した⁴²⁾。その結果、健常人に対して腎透析患者での抗酸化能効果の有意な低下が観察 された(Fig.7)。

0 50 100

normal subjects patients of renal failure

Fig. 7 Relative antioxidant activity of sera from normal subjects (n=6) and patients of renal failure (n=66) * P < 0.05 as compared with sera of normal subjects.

Relative antioxidant activity (%)

*

２-５ 腎透析患者に 併用投与される鉄剤のHSAへの影響

 腎透析患者において、貧血を防ぐために鉄剤が同時投与されている^43-45)。したがって、鉄 剤を投与することにより、貧血を防ぐ一方で、この鉄剤が触媒となり、生体内の酸化を促 進し、他の疾患を併発する可能性が考えられる。そこで、今回、我々は腎透析患者間での 鉄剤投与の有無による効果を比較検討するとともに、鉄剤のHSAの酸化に及ぼす影響につ いて検討した。

Fig.8

age; 66

age; 66)

HPLC

HMA

HNA-1

に、

HNA-2

た。事実、

Table 3

n=33

n=33）でのHMA, HNA-1, HNA-2の存在比率を検討した結果、先のHPLCプロファイルを

Fig. 8 HPLC profile of serum from a patient of renal failure without (A) and with (B) coadministration of Fe

10 20 30 40 10 20 30 40

Retention time (min)

(A) (B)

HMA HMA

HNA-1 HNA-1

HNA-2 HNA-2

* P < 0.05 as compared with sera from patients of renal failure without   coadministration of Fe.

without Fe (n = 33) HMA

HNA-1 HNA-2

52.3 ± 15.9 42.8 ± 10.9

6.54 ± 2.17

with Fe (n = 33) 50.3 ± 13.1 41.6 ± 8.26 8.96 ± 4.2 *

Table 3 f values (%) for HSA and oxidized HSA in sera from patients of renal failure with or without coadministration of Fe

 さらに、腎透析患者間の鉄剤投与の有無による血漿のカルボニル含量の比較検討を行っ

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

With Fe(+) Without Fe(-)

Fig. 9 Carbonyl content of plasma from patients of renal failure without (n=33) and with (n=33) coadministration of Fe ** P < 0.001 as compared with plasma from patients of renal failure without coadministration of Fe.

[Carbonyl content] / [Plasma]

**

さらに、カルボニル含量測定試薬であるフルオレッセイン

(DNP)のモノクロナール抗体を用

その結果、Fig.10に示すように鉄剤投与により、HSAのみの有意な酸化が確認された。また、

このときの血漿抗酸化能効果を測定したところ、鉄剤投与の患者群で、抗酸化能効果の有 意な低下が観察された(Fig.11)。

Fig. 10 (I) Western blots of plasma from patients of renal failure with or witout coadministration of Fe after derivatization and staining with Oxyblot Kit reagents

(II) Plasma protein carbonyl formation measured by western blots of plasma from patients of renal failure with (n=10) or witout (n=10) coadministration of Fe *P< 0.05 vs.witout Fe.

(I)

Fibrinogen (340kDa) Immunoglobulin (180kDa)

Transferrin (80kDa) Albumin (67kDa) Protein Carbonyl

Fe(-) Fe(+) Fe(-) Fe(+)

Fe (+); with Fe Fe (-); without Fe (II)

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Relative densitometry units

*

HSA Transferrin Immuno globulin

Fibrinogen

Fe(-)Fe(+) Fe(-)Fe(+) Fe(-)Fe(+) Fe(-)Fe(+)

0 50 100

without Fe with Fe

Fig. 11 Relative antioxidant activity of sera from patients of renal failure with (n=33) or without(n=33) coadministration of Fe

* P < 0.05 as compared with without coadministration of Fe.

Relative antioxidant activity (%)

*

 次に鉄剤非投与群の腎透析患者に対して

Fe(

40mg/2mL)

Fe

ex vivo

Fe

37˚C

HNA-2

Table 4 f values (%) for HSA and oxidized HSA in sera from patients of renal failure without coadministration of Fe treated with incubaiton for 1 hr at 37˚C with and without Fe

* P < 0.05 as compared with serum from patients of renal failure without coadministration of Fe treated with incubation without Fe.

f (HMA) 46.3 ± 8.07 43.2± 8.93

f (HNA-1) 42.9 ± 8.04 43.1 ± 7.81

f (HNA-2) 10.8 ± 2.68 13.7 ± 5.74*

incubation without Fe

incubation with Fe  

第３節 考察

1. 腎透析患者の酸化HSAの増加とその重要性

 健常人及び腎透析患者でのHMA, HNAの変動を比較したところ、健常人に比べて腎透析 患者において、酸化HSAと言われているHNA-1, HNA-2の上昇が観察される(Fig.3)と同時 にフリーのCys濃度の低下が観察された

(Fig.4)ことから、従来の報告通り、 HSAの

Cys

(Fig.5)。この増加は、塩基性アミノ酸残基であるリジン (Lys)、アルギニン(Arg)残基を始め、

プロリン

(Pro)残基などの酸化によるものと考えられる。すなわち、 HPLCプロファイルか

らHSAの³⁴

Cysの酸化が確認されるとともに、

Cys以外の他の残基も同時に酸化されている

(DNP)のモ

HSAのみが

HSAの酸化で説明がつくといっても過言ではな

HSAは、HSA自身が酸化を受ける

(Fig.7)。これは、

HSAが特異的に抗酸化能効果を担っていること示している。事実、健常人及び腎透析患者

(data not shown)。これは、先のカルボニル含量の結果からも分かるように、特異的な蛋白

HSAが病態時で血清中に過度に発生する活性酸素に対して、抗酸化剤として

2. 鉄剤のHSAに及ぼす影響

 透析患者において、貧血を防ぐために鉄剤が同時投与されている。通常、腎疾患を始め とする病態時では活性酸素による生体内の酸化が健常人より上昇することが数多く報告さ

れている^46-48)。事実、生体内では、弱い活性酸素と言われている過酸化水素に金属イオンが

相互作用することにより、

OH・という非常に強力な活性酸素を生じることが報告されてい

生体内の酸化を促進し、他の疾患を併発する可能性が充分に考えられる。しかしながら、

現在の鉄剤の投与設計は、貧血を防ぐ目的で経験的に処方されているに過ぎない。そこで、

我々は先のHSAの酸化型、還元型を分離するカラムを利用することにより、腎透析患者間 での鉄剤投与の有無による酸化型/還元型 比の違いを比較検討するとともに、鉄剤が及ぼす 生体内への影響について詳細に検討した。HMA, HNA-1のピークは、鉄剤投与の有無に関 わらず、大きな変化は認められなかったが、興味深いことに、HNA-2において、鉄剤投与 腎透析患者で有意な上昇が認められた

(Fig.8)。先の健常人との HPLCプロファイルと考え合

HMA

HNA-1、

HNA-2の上昇、加えて鉄剤投与によるさらなる HNA-2の上昇と、段階的にHSAは酸化され

ていくと考えられる。これは、腎疾患により健常人に比べて

HSAが酸化されているにも関

HSAの過度の酸化を受けていることが考えられる。

事実、鉄剤投与の有無による血漿カルボニル含量の相違においても、鉄剤投与群の患者に おいて有意な上昇が認められた(Fig.9)。これも鉄剤投与により、貧血を補う一方で、血漿中 の酸化促進を引き起こしていると考えられる。また、カルボニル含量測定試薬であるフル オレッセイン(DNP)のモノクロナール抗体を用い、血漿中蛋白酸化を鉄剤非投与群と比較検 討した。これまでの報告では、健常人の血漿にOH・を発生させる酸化剤を添加した際、フィ ブリノーゲンが最も酸化されると言われていたが^50,51)、今回の腎透析患者での鉄剤投与群で は、HSAのみが有意に酸化されていた

(Fig.9)

HNA-2の有意な上昇が確認された。これは鉄剤が血漿中の活性酸素と反応し、 HSAのさら

 このように、病態時での、HSAの酸化が明らかになったが、

HSA自身、どのアミノ酸残

その詳細についての検討が必要である。また、今回、腎透析患者に対する鉄剤の影響が明 らかになった現状では、今後、鉄剤投与設計において抗酸化剤を併用投与するなど新たな 指針が必要であるかもしれない。

第４節 小括

 本章では、腎透析患者の血漿を用いて酸化

HSAの病態時での変動について検討を行い、

以下の結果が得られた。

1）腎透析患者において、 HPLC

の上昇が観察され、

HSAの酸化が確認された。さらに、血漿カルボニル含量測定から、従

Cysだけでなく、塩基性アミノ酸あるいは芳香環アミノ酸残基が酸化さ

2）腎透析患者において、血漿中蛋白質のなかでHSAが特異的に酸化されていることが明ら

HSAの酸化が病態時に発生する活性酸素に対して抗酸化能効果を示す

3）腎透析患者において、鉄剤を投与することにより、貧血を防ぐ一方で、生体内の酸化を

 これらの知見は、これまで漠然と捕らえられていた病態時での酸化的ストレスによる血 漿中酸化機構に対して、

HSAが酸化されることにより、血漿中の恒常性維持に大きな役割

第３章 In vitroにおける酸化HSAの調製とその特性

第１節 序

 酸素依存性のアミノ酸の酸化は酸化の方法、すなわち、発生してくるラジカルの種類や アミノ酸の性質によって異なってくる。最近では、それら酸化生成物の構造特性も明らか にされてきている⁵²⁾。例えば、酸素分子存在下、アルギニン

(Arg)はOH・により5-ヒドロキ

(Trp)やヒスチジン (His)はOH・によりそれぞれ

N-フォルミルキヌレニンや 2-オキソヒスチジンへ変換されることが報告されている

た、ウシ血清アルブミン

(BSA)、ヘモグロビン、ミオグロビンでは、 OH・によりプロリン (Pro)が酸化され、ペプチド鎖のフラグメント化を生じることも知られている(Table 5)。

In vitro

酸、酸素存在下、過量の銅や鉄などの遷移金属触媒により発生したラジカル酸素により蛋 白質を酸化させる金属触媒酸化法はよく知られている^55-57)。ところが、これらの方法は蛋白 質を過度に酸化するため、蛋白の断片化や多量体化を引き起こす。しかしながら、

in vivo

Cys

in vitro

in vitro

HSA

分光学的手法を用いての構造特性の解明、リガンド輸送能を始めとする機能特性の解明、

さらには¹¹¹

In

HSA

Table 5 New moieties genarated by biological protein oxidation and their genesis

Oxidative insult Product

Tyr+OH. or RNIs Tyr+HOCl Tyr+RNIs Tyr+OH. or one-electron oxidation of Tyr or HOCl, followed by radical-radical combination

Phe+HO.;one-electron; RNls?

Trp+HO., or one-electron oxidation Trp+HO., or one-electron oxidation His+HO., or one-electron oxidation Glu+HO., in presence of O2

Leu+HO., in presence of O2 Val+HO., in presence of O2

Lys+HO., in presence of O2

Pro+HO., in presence of O2

Arg+HO., in presence of O2

Ile+HO., in presence of O2

Gly; hydrogen-atom abstraction from ∂-carbon followed by reaction with CO2.-radical;

could arise from a succession of oxidants of other amino acids

Met+HO. or one-electron oxidation Cys+HO.,

or other hydrogen-atom-abstractingspecies

Dopa

J. DAVIES et al., Biochem. J., (1997) 324,1-18 Isoleucine hydroperoxides; Isoleucine hydroxides?;

Carbonyl compounds?

Methionine sulfoxide Dityrosine

o-, and m-Tyrosine

N-Formylkynurenine; Kynurenine 5-Hydroxytryptophan

2-Oxohistidine

Glutamic acid hydroperoxide

Leucine hydroperoxides and hydroxides

Valine hydroperoxides and Carbonyl compounds Lysine hydroperoxides and Carbonyl compounds Proline hydroperoxides and hydroxides;

5-Hydroxy-2-aminovaleric acid;

Carbonyl compounds

5-Hydroxy-2-aminovaleric acid

Cystine; Oxy acids Aminomalonic acid 3-Chlorotyrosine 3-Nitrotyrosine

 第２節 結果

２-１ 酸化HSA誘導活性酸素種の検索 

 活性酸素は一般に反応性に富む化学種であるため、それらが生体内で生じた場合、検出 は容易ではない。活性酸素と疾患との関わり合いを知るためには、まずin vitroでの充分な 基礎検討が必要である。そこで、今回、我々は、代表的な

3種の活性酸素種、過酸化水素

(H

O

)、過塩素酸類似物質クロラミンＴ (CT)、ヒドロキシルラジカル (OH・)を用い、血漿

とこれら活性酸素種を反応させて得られたHPLCプロファイルを作成し、腎透析患者とのそ れを比較検討した。Fig.12に示すように緩和な酸化条件を設定し、時間及び濃度依存的に反 応させたところ、H₂

O

HNA-1及びHNA-2が上昇するHPLC

Fenton反応による、ピークの消

H

O

２-２ 酸化HSAの調製

 先のHPLCプロファイルの結果から、過塩素酸類似物質

CT及びH

O

3種の活性酸素を用い、酸化 HSAを調製した。血

O

OH・に関しては、反応が非

catalyzed oxidation)を利用し、緩和な条件で経時的に酸化HSAを調製した。今回、作製し

HMA

HNA-1 HNA-2

10 20 30 40

0

Retention time (min) After 3 min

After 1 hr Control

10 20 30 40

0 0 10 20 30 40

Retention time (min)

10 20 30 40

0

10 20 30 40

0 0 10 20 30 40

Retention time (min)

10 20 30 40

0 treated with CT (1 mM) treated with

H

O

(1 mM)

treated with H

O

(1 mM) +

Fe (10µM)

Fig.12 HPLC profile of HSA and oxidized HSAs treated with chloramine T (CT), hydrogen

peroxide (H

O

) and Fenton system(H

O

+ Fe) in serum from a normal subject

The data are average values of five experiments (± S. D.).a N.D. not detected.

* P < 0.001 as compared with CT (0 mM).

CT 0.1mM 1 mM 10 mM 50 mM

HMA

HNA-2 HNA-1 After 3 min

HMA HNA-2

HNA-1 After 1 hr

N.D. N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

74.9 ± 0.99

22.1 ± 1.51

2.97 ± 1.03

72.8 ± 2.11

23.9 ± 2.39

3.21 ± 1.13

72.4 ± 2.50

22.5 ± 1.38

2.62 ± 0.78

61.2 ± 3.63

*

23.7 ± 4.23

14.6 ± 1.23

*

65.2± 3.38

*

22.4 ± 3.95

12.4 ± 1.28

*

Table 6 f values (%) for HSA and oxidized HSAs treated with CT in serum from normal subjects

a

0 mM

The data are average values of five experiments (± S. D.).a N.D. not detected.

HMA

HNA-2 HNA-1 After 3 min

HMA HNA-2

HNA-1 After 1 hr

74.9 ± 0.99

22.1 ± 1.51

2.97 ± 1.03

72.8 ± 2.11

23.9 ± 2.39

3.21 ± 1.13

71.7 ± 4.76

25.19 ± 4.57

3.09 ± 1.16

38.4 ± 6.99

*

41.9 ± 2.66

*

19.57 ± 8.21

*

N.D.

N.D.

N.D.

38..2± 4.38

*

39.4 ± 6.95

*

18.4 ± 4.28

*

Table 7 f values (%) for HSA and oxidized HSAs treated with H

O

and Fenton system in serum from normal subjects

100 mM

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

a

H₂O₂ (1mM)    +   Fe (10µM)

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

0 mM 1 mM 10 mM

H₂O₂

HSA、CT

-HSA、CT

-HSA、またアスコルビン酸と鉄剤を用いた時間依存的な酸化体（

12、24、48、72hr）をMCO

-HSA、MCO

-HSA、MCO

-HSA、MCO

-HSAとして以下

２-３ 酸化HSAの酸化の程度の比較

 病態時あるいは老化による蛋白質の酸化は、カルボニル含量の増大を伴う⁵⁸⁾。そこで、本 実験条件で調製された酸化HSAがどの程度酸化されているかを確認するために、カルボニ ル 含 量 を 測 定 し た 。

Fig.13

C T - H S A ( C T

-、 C T

- H S A )

MCO- HSA(MCO

-、MCO

-、MCO

-、MCO

-HSA)では、酸化反応が進むにつれて、著しいカ

O

-HSA (H

-、H

-、H

-HSA)ではカルボ

H1-HSA

CT0.1-HSA H10-HSA H100-HSA CT1-HSA CT10-HSA CT50-HSA MCO12-HSA MCO24-HSA MCO48-HSA MCO72-HSA Control

0 0.1 0.2

[Carbonyl contents] / [HSAs]

*

**

*

**

**

**

Fig. 13 Carbonyl contents of oxidized HSAs

* P < 0.05, ** P < 0.001 as compared with control.

２-４ 各種酸化剤による標的アミノ酸残基の比較

 これまでの検討結果から、各種活性酸素により様々なアミノ酸残基が酸化されている可 能性が示唆された。そこで、酸化されるアミノ酸残基の検索をキャピラリー電気泳動法や 分光学的方法等を用いて行った。

２-４-１ Cys残基の酸化

 まず、5、5 -ジチオビス-（2-ニトロ安息香酸）

(DTNB)を用いて、フリーのCys残基の酸

HSAす

Relative ratio of oxidized Cys residue (%) Fig. 14 Relative ratio of oxidized Cys residue of oxidized HSAs

0 50 100

H1-HSA

CT0.1-HSA

H10-HSA

H100-HSA

CT1-HSA

CT10-HSA

CT50-HSA

MCO12-HSA

MCO24-HSA

MCO48-HSA

MCO72-HSA

Control

２-４-２ Met残基の酸化

 Met残基もまた酸化を受ける代表的なアミノ酸の一つである^59,60)。このMet残基の酸化の 度合いは、臭化シアン

(CNBr)

O

-HSA (H

-、H

-、H

-HSA)及びCT-HSA(CT

-、CT

-HSA)では

MCO-HSA

H

O

-HSA及びCT-HSAにおけるMet残基の酸化が観察

H 1-HSA H 10

-HSA

CT1-HSA CT10

-HSA CT50-HSA

MCO 12

-HSA MCO

24 -HSA

MCO 48-HSA

MCO 72

-HSA Control H 100

-HSA CT0.1

-HSA

M.W. M.W.

29000 20400 14000 6100 3500 Fig. 15 Cleavage of oxidized HSAs by CNBr 

M.W. ; molecular weight marker (kDa).

２-４-３ 塩基性アミノ酸残基の酸化

 ３種の酸化

HSA

CE

HSA

MCO-HSA (MCO

-

MCO

-

MCO

-HSA)

CT-HSA (CT

-HSA)

CE

(Fig.16)

い

MCO-HSA

CT-HSA

HSA

解釈される。すでに報告されている酸化蛋白質のアミノ酸修飾の結果^55-57)を考え合わせると、

ノ酸残基が酸化され陽電荷を失ったためと推察された。対照的にH₂

O

-HSAでは未修飾HSA

H

O

Migration time (min)

17 18 19 20 21 22

*

**

Fig.16 Migration times of oxidized HSAs using capillary electrophoresis

* P < 0.05, ** P < 0.001 as compared with control.

H1-HSA

CT0.1-HSA H10-HSA H100-HSA CT1-HSA CT10-HSA CT50-HSA MCO12-HSA MCO24-HSA MCO48-HSA MCO72-HSA Control

**

**

２-４-４ Trp及びTyr残基の酸化

HSA

214

Trp

Trp

Trpの酸化をHSA固有の蛍光

MCO-HSA

CT-HSA

Trp

Trp

O

-HSAでは、固有蛍光スペクトルの変化はほとんど認めら

Trp

Tyr残基の励起波長である280nm

んど起こっていないものと考えられた。

H

H

0 0.1 0.3 0.5 0.7

320 330 340 350 360 370 320 330 340 350 360 370

320 330 340 350 360 370

Wavelength (nm)

Relative fluorescence intensity

Fig.17 Intrinsic fluorescence spectra of oxidized HSAs

control

MCO

MCO

↓

CT

CT

↓

→

H

O

-HSA CT-HSA MCO-HSA

２-５ 各種酸化剤による酸化HSAの構造特性

 種々の蛋白質において、酸化修飾に伴い構造変化が生じることが報告されている。例え

ば、

in vitro

His

Met

沈殿が起こる⁶²⁾。またin vivoにおいても、老化ラットから単離したカルモジュリンでは、

Met

HSA

２-５-１ CDスペクトル

 まず、酸化

HSA

CD

HSA

MCO-HSA

CT-HSA