博 士 （ 農 学 ） 磯 野 直 人
学位論文題名
インゲンマメ(Phaseolus vulgar ゐL ．）StarChSynthaSe アイソザイムの酵素化学的特性と
デンプン生合成に関する研究 学位論文内容の要旨
デンプンはアミロペクチンとアミロースからなるグルコースのポリマーである。アミロペ クチンはa‑l，4グルカン鎖を主鎖とし、a‑l，6結合の分岐構造を持つ分子であり、アミロ ースはほば直鎖上のQー1，4グルカン鎖である。デンプンは植物の貯蔵組織や葉で合成され、
植物にとって必要不可欠な貯蔵物質である。また、デンプンは人類の主要なカロリー源であ り、様々な産業における原材料としても重要な多糖である。しかし、植物においてデンプン が合成されるメカニズムはほとんど明らかにされていない。
Starch synthase (SS，EC 2.4.1.21）は、プライマーであるa‑l，4グルカン鎖の非還元末 端にADPグルコースのグルコース残基を転移する反応を触媒し、グルカン鎖の伸長を行う 酵素である。本酵素はアミロペクチンやアミロースの合成に関与し、デンプンの性質を決定 すると考えられている。植物体には複数のSSアイソザイムが存在し、一次構造から4種類
（SSI，SSII，ssm，GBSSI)に分類される。このうち、′デンプン粒画分にのみ存在する GBSSIクラスのアイソザイムがアミロースの合成を行っており、それ以外のクラスのアイ ソザイムはアミロペクチンの合成に関与していると考えられている。しかしながら、植物体 からの酵素精製が困難であるため、各種のSSの機能特性は理解されておらず、デンプン生 合成における各アイソザイムの詳細な役割は不明なままである。
本研究では、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris L.)を材料とし、3種類のSSアイソザ イムの一次構造の解析、生体内における各アイソザイムの局在性解析、大腸菌発現酵素の機 能解析などにより、SSアイソザイムの酵素化学的特性とデンプン生合成の関係を明らかに することを目的とした。
1 ）SS アイソザイムの一次構造および遺伝子発現
インゲンマメ登熟種子からSS アイソザイム(PvSSI 、PvSSII およびPvGBSSI) の
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cDNAを単離し、一次構造を決定した。各アイソザイムの前駆体はプラスチド移行シグナ ルを 有し 、成 熟夕 ンパ ク質 はC末 端側 の類 似性 が高 いこ とが判明した。pvsslおよび pvss2遺伝子の発現は葉において顕著であり、また登熟初期の種子でも確認された。一方、
pvgbssl遺 伝子 の発 現レ ベル は種子の登熟にともない増加した。しかし、葉における pvgbssl遺伝子の発現は確認されなかった。
2）SSアイソザイムの局在性
3種 のアイソザイムの組換え酵素(rPvSSI、rPvSSIIおよびrPvGBSSI)を大腸菌中で発 現し精製した。精製酵素に対する抗体を用いて、各アイソザイムの局在性を調べた。植物体 の可溶性画分にはいずれのアイソザイムも検出されなかったが、PvSSIおよびPvSSIIは種 子および葉のデンプン粒中に存在することが明らかとなった。一方、PvGBSSIは種子のデ ンプン粒にその存在が確認された。各登熟期の種子におけるPvGBSSIの存在量とアミロー ス含量に相関が認められないことから、PvGBSSIはアミロースだけでなくアミロペクチン の合成に関与している・ことが示唆された。葉にはPvGBSSIが存在しないため、葉のアミロ ー ス は 、 異 な るGBSSIク ラ ス の ア イ ソ ザ イ ムに よ っ て 合 成 さ れ る と 考 え られた 。
3）rPvSSIおよびrPvSSIIの諸性質
種々のマル゛トオリゴ糖や部分分解したアミロペクチンに対するrPvSSIとrPvSSIIの反 応性について詳細に解析した。それぞれの酵素活性はプライマー分子の鎖長に依存すること が確認された。速度論解析の結果、rPvSSIは鎖長の増加にともないプライマーに対する親 和性が増し、最大速度が減少することが明らかとなった。一方、rPvSSIIは鎖長の増加によ ルプライマーに対する親和性は増加するが、最大速度はほば一定であった。また、両酵素の ADPグルコースに対する親和性は、プライマーの鎖長により変化しなぃことが判明した。
アミロペクチンやグリコーゲンを基質とした場合の反応生成物を解析したところ、rPvSSI お よびrPvSSIIは それ ぞれ 重合 度10以下および15程度の鎖を選択して伸長する特性を 持っことが明らかとなった。
4) rPvGBSSIの諸性質
アミロペクチンを基質とした場合、rPvGBSSIは重合度15程度の鎖を連続的に伸長し、
極 めて 長い 鎖（ 重合 度50以上 ）を 生成 した 。こ のよう な連 続的 伸長反応はrPvSSIや rPvSSIIでは観察されなかった。GBSSIアイソザイムの連続的な伸長反応はデンプン中に おけるアミロース合成に関与する重要な特性であると考えられた。一方、マルトトリオース を基質とした場合、rPvGBSSIは非連続的な伸長反応を行いマルトテトラオースを生成する た め 、 基 質 の 種 類 に よ っ てrPvGBSSIの 伸 長 特 性 が 変 化 す る こ と が 判 明 し た 。
学位論 文審査の要旨 主 査 教 授 松 井 博 和 副 査 教 授 冨 田 房 男 副 査 教 授 横 田 篤 副査 助教授 伊藤浩之
学 位 論 文 題 名
インゲンマメ(Phaseolus vulgarisL ．）starch synthase アイソザイムの酵素化学的特性と
デンプン生合成に関する研究
デ ンプ ンは アミ ロペ クチ ンと アミ ロー ス から なる グルコースのポリマーである。ア ミロ ペク チン はa‑l，4グル カン鎖を主鎖とし、Q‐1，6結合の分岐構造を持つ分子であ り、 アミ ロー スは ほば 直鎖 上のa‑l，4グ ル カン 鎖で ある。デンプンは植物の貯蔵組織 や葉 で合 成さ れ、 植物 にと って 必要 不可 欠 な貯 蔵物 質である。また、デンプンは人類 の主 要な カロ リー 源で あり 、様 々な 産業 に おけ る原 材料としても重要な多糖である。
しか し、 植物 にお いて デン プン が合 成さ れ るメ カニ ズムはほとんど明らかにされてい ない 。
Starch synthase (SS，EC 2.4.1.21）は、プラ イマーであるa‑l，4グルカン鎖の非還 元 末 端 にADPグ ル コ ー ス の グ ル コ ー ス 残 基 を 転 移 する 反応 を触 媒し 、グ ルカ ン鎖 の 伸長 を行 う酵 素で ある 。本 酵素 はア ミロ ペ クチ ンや アミロースの合成に関与し、デン プ ン の 性 質 を 決 定 す ると 考え られ て いる 。植 物体 には 複数 のSSアイ ソザ イム が存 在 し、 一次 構造 から4種類(SSI，SSII，SSIII，GBSSI)に分類される。このうち、デンプ ン 粒 画 分 に の み 存 在 す るGBSSIク ラ ス の ア イ ソ ザ イム がア ミロ ース の合 成を 行っ て おり 、そ れ以 外の クラ スの アイ ソザ イム は アミ ロペ クチンの合成に関与していると考 え ら れ て い る 。 し か しな がら 、植 物 体か らの 酵素 精製 が困 難で ある ため 、各 種のSS の機 能特 性Iま 理解 され ておらず、デンプン生合 成における各アイソザイムの詳細な役 割は 不明 なま まで ある 。
本 研 究 で は 、 イ ン ゲ ン マ メ(Phaseolus vuみ 開mL． ） を 材 料 と し 、3種 類 のSSア イソ ザイ ムの 一次 構造 の解 析、 生体 内に お ける 各ア イソザイムの局在性解析、大腸菌 発現 酵素 の機 能解 析な どに より 、SSアイ ソ ザイ ムの 酵素化学的特性とデンプン生合成 の関 係を 明ら かに する こと を目 的と した 。
1）SSアイソザイムの一次構造および遺伝子発現
イン ゲン マメ登熟 種子からSSアイソザ イム(PvSSI、PvSSIIお よびPvGBSSI)を コー ドするcDNAを単 離し、一 次構造を決定した。各アイソザイムの前駆体はプラ スチド移行シグナルを有し、成熟夕ンパク質はC末端側の類似性が高いことが判明 した 。pvsslおよびpvss2遺 伝子の発現は葉において顕著であり、また登熟初期の 種子でも確認された。一方、pvgbssl遺伝子の発現レペルは種子の登熟にともない増 加 し た 。 し か し 、 葉 に お け るpvgbssl遺 伝 子 の 発 現 は 確 認 さ れ な か っ た 。
2）SSアイソザイムの局在性
3種 のアイソザ イムの組 換え酵素(rPvSSI、rPvSSIIおよびrPvGBSSI)を大腸菌中 で発現し精製した。精製酵素に対する抗体を用いて、各アイソザイムの局在性を調べ た。植物体の可溶性画分にはいずれのアイソザイムも検出されなかったが、PvSSIお よびPvSSIIは種子および葉のデンプン粒中に存在することが明らかとなった。一方、
PvGBSSIは 種子のデン プン粒に その存在 が確認さ れた。各登熟期の種子における PvGBSSIの 存在量とア ミロース含量に相関が認められないことから、PvGBSSIはア ミロースだけでな、くアミロペクチンの合成に関与していることが示唆された。葉には PvGBSSIが 存在しない ため、葉のアミロースは、異なるGBSSIクラスのアイソザイ ムによって合成されると考えられた。
3）rPvSSIおよびrPvSSIIの諸性質
種々のマルトオリゴ糖や部分分解したアミロペクチンに対するrPvSSIとrPvSSII の反応性について詳細に解析した。それぞれの酵素活性はプライマー分子の鎖長に依 存することが確認された。速度論解析の結果、rPvSSIは鎖長の増加にともないプライ マーに対 する親和性 が増し、 最大速度が減少することが明らかとなった。一方、
rPvSSIIは鎖長の増加によルプライマーに対する親和性は増加するが、最大速度はほ ば一定であった。また、両酵素のADPグルコースに対する親和性は、プライマーの 鎖長により変化しないことが判明した。アミロペクチンやグリコーゲンを基質とした 場合の反 応生成物を 解析した ところ、rPvSSIおよびrPvSSIIはそれぞれ重合度10 以下 お よび15程 度の鎖を 選択して 伸長する 特性を持 つことが明 らかとな った。
4）rPvGBSSIの諸性質
アミロ ペクチン を基質とし た場合、rPvGBSSIは重合度15程度の鎖を連続的に伸 長し、 極めて長 い鎖（重合 度50以上）を生成した。このような連続的伸長反応は rPvSSIやrPvSSHでは 観察され なかった。GBSSIアイソザ イムの連続的な伸長反応 はデンプン粒中におけるアミロース合成に関与する重要な特性であると考えられた。
一方、マルトトリオースを基質とした場合、rPvGBSSIは非連続的な伸長反応を行い マルトテトラオースを生成するため、基質の種類によってrPvGBSSIの伸長特性が変 化することが判明した。
以 上のよう に本研究 は、インゲ ンマヌよ り3種のstarch synthase cDNAを取得
し、それぞれのアイソザイムの植物における局在性解析や組換え酵素の諸性質解析な どを行い、各酵素の機能を明らかにした。これらは学術的に大いに価値ある成果と判 断される。
よって審査員一同は、磯野直人が博士（農学）の学位を受けるに十分な資格を有す ると認めた。
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