赤血球 中のヘモグロビンヘムの 酸化開裂物質ヘマチ ン酸の定量

岡大医短紀要

, 1 :

^77‑82,1990

Bull.Sch.HealthS°i.OkayamaUnlV.

赤血球 中のヘモグロビンヘムの 酸化開裂物質ヘマチ ン酸の定量

簾 田 和 弘1) 佐 々木 健 二2) 簾 田 喬2)

Determination ofHematinicAcid Produced by OxidativeCleavageofHemoglobin Hemein Red Blood Cells

KazuhiroHtROTAl),KenjiSASAKI2)and TakashiHIROTA2)

Ourpreviousstudiesonthemechanism ofphenylhydrazine‑inducedhemolytlCanemiahaveshownthat hematinicacid.oneofoxldativecleavageproductsofheme,isformedbythereactionofhemoglobinwith phenylhydrazime.Develomentofthedeterminat10mOfhematinlCacidformedbythlSreactionlnredblood cells(RBC)wasrequiredtostudythemechanismofthehemolysis.Hemolysatespreparedbylysisoffresh humanRBCwithwaterwasmixedwithstandardhematinicacid.AsolutionconsIStingofhydrochlorlCacid, methanol,andacetonewasadded,andmostofhemoglobinpreclpitatedwasremovedbycentrifugation.

HematinicacidwasderivedtothemethylesterbyIncubationwithmethanolcontainlngSulfuricacld The esterwaspassedtotwotypeofsilicagelcolumntoremoveinterferences,andwasanalysedonareversed‑

phasehigh‑performanceliquidchromatographiccolumn.Hematinicacidcouldbedeterminedlntherange 1.0‑20.OFLmOl

/

n

e

RBC.Recoveryfromhemolysatewas65.0%±3.5%.

StandardcompoundsofhematinlCacidanditsmethylesterwerepreparedbytheoxidationofhemlnWith hydrogenperoxide,andwereconfirmedbyelementalanalysesandmassspectra.

KeyWords:hematinicacid,high ‑performanceliquidchromatography,redbloodcells,heme

緒 言

ヘマチ ン酸 (HA, 2,5‑dihydr0‑4‑methy1‑2,5‑

dioxo‑1H‑pyrrole‑3‑propanoicacid)は,つ ぎに 示す ようにマ レイ ミ ドの カルボ ン酸誘導体 であ り, ビリル ビン1)や ウロクローム2)の酸化生成物 の1つであることか ら,新生児黄症 の光治療や尿 色素の研究において取 り上げ られて きた化合物で ある｡

本著者 らは,溶血毒であるフェニル ヒ ドラジン の溶血機構 を研究す る途上, フェニルヒ ドラジン がヘモ グロビン (Hb)のヘムを酸化 開裂 してHA を生成することを見出 した3)5)｡ この毒物 による

1)岡山大学医療技術短期大学部

2)岡山大学薬学部

" 3 .

Cf

S

c

.

"2

C

"2

C O

O "

H

図1 ヘ

^マチン酸

( H A)

溶血性 と赤血球中におけるHAの生成 との関係 を 研究す るため, HAの定量法 を検討 したので報告 す る｡ 人の溶血液 にHA標 品 を添加 し, Hbや膜 成分な どの分析妨害成分 を除去 した後, HAを硫 醍 ‑メタノール溶液でメチルエステルに誘導 し, 高速液体 クロマ トグラフィー(HPLC)で分析 した｡

‑ 77‑

試 薬 と 機 器

試薬 は

1

級品 を用い,溶液の%表示 は,硫酸 は W/Vで,その他 はⅤ/Vを示す｡

HAメチルの合成 のための分取 カラムクロマ ト グラフィーは,高速液体 クロマ トグラフ(LC‑5A, 島津製作所)のポ ンプと紫外吸収検 出器 (大岳製 作 所) を連結 し,280nmで検 出 して行 った｡ こ の際用 い るカ ラムは, 中庄 ガ ラス カ ラム (47×

1.4cm,桐 山製作所)に169シ リカゲル (Kieselge1 60,230‑400mesh,Merck)を乾式で真空で吸引 し なが ら詰 めて製作 した ものであった｡溶離液 は n‑ヘキサ ン/酢酸エチル/ メタノール

(1/ 1/

0.013)溶液であった｡

薄 層 ク ロ マ トグ ラ フィー (TLC) は, pre‑ coatedplate(シリカゲル60,F254,厚 さ0.25mm, Merck)を用 いた｡展 開溶媒 は,HAに対 してク ロロホルム/ アセ トン/酢酸 (5/ 1/0.1)浴 液およびHAメチルに対 して四塩化炭素/ シクロ ヘキサ ン/酢酸エチル (5/ 1/ 3)溶液であっ た｡展 開 後 の ス ポ ッ トの検 出 は紫 外 線 ラ ンプ

(254nm)で行 った｡

HAの定量 に用いる順相 シ リカゲルカラムは, 和光 ゲルC‑200 (2.3g)をガラス管 (0.8×10cm)

に詰めた もので,酢酸エチル (long)を通 し洗浄 した後,30%酢酸 エチル‑ a‑ヘ キサ ン溶液で平 衡化 した ものであった｡ また同 じ目的で使用 した 逆 相 シ リカ ゲ ル ミニ カ ラ ム (SEP‑PAR,C‑18, watersAssociates,Inc.)は,あ らか じめメタノー ルで洗浄 した後10%メタノール‑水溶液で平衡化

した ものであった｡

HAの定量 に用 いたHPLCは,紫外吸収検 出器 (SPD‑2A)付 きHPLC (LC‑3A, 島津 製作所) を使 用 し,280mmで検 出 して行 った｡分析 カ ラ ム と して逆相 シ リカゲ ル (ODS)カ ラム (15×

0.46cm,ガスクロ工業)を,またプ レカラム (1.0

×0.65cm)と して,Deverosil(野村化 学) を詰 めた ものを用いた｡ これ らのカラムは46℃に加温 し,溶離液 は35%メタノール‑水,検 出は280nm, そ して流速 は0.7me/minで分析 した｡

EI質量分析 は, 島津‑LKB9000を用 いて行 っ た｡

方 法

標準HAとそのメチルエステルの合成 1.HA

schaeferら6)のヘ ミンの酸化分解の方法 を改良 して行 った｡ヘ ミン (1.0g)を濃 ア ンモニ ア水 (1.One)に溶か し,水 (100me)を加 え希釈 した｡

60℃に加温 しなが ら,過酸化水素水(35%,25me), 水 (25mg)お よび濃 ア ンモニ ア水 (1.5mg)か ら なる溶液 を10分間で加 え,その後1時間加温 を続 けた｡ 2N塩酸 (7me)を加 え酸性 に し沈殿する 茶褐色物質 を液過 し除いた｡褐色渡液 を酢酸エチ ルで抽 出 し,抽 出液 を無水硫酸ナ トリウムで乾燥 し,濃縮乾固 した｡褐色残直 をアセ トンに溶解 し 分取TLCを行 った｡Rf値0.35のバ ン ドをか き取

り,酢酸エチルで抽 出 し,濃縮乾固 した｡淡褐色 残査 を酢酸エチ ル

/n

‑ペ ンタン (1/3)溶液 か ら

3回再 結 晶 し白色 結 晶 (10m9)を得 た｡ 融 点 115‑116℃ (文 献 値114.4‑115.℃ 7).元 素 分析, C8H9NO4 (MW :183)計算値:C,52.46;H, 4.92;N,7.65.実測値 :C,52.37;H,4.90

;N,7.60.EI質量分析m/Z (相対 強度):165 (69%,M十一H20),137(100%,M十一H20‑CO), 119 (17%, M+‑2Hz0‑CO), 109 (29%,M+

‑ H20‑ CO‑ C2H4), 94 (230/0, M+ ‑H20‑

coNHCO).

2.HAメチル

上 のHAの分取TLC前 の褐色残査 に2%硫酸

‑メタノール溶液 (50me)を加 え,60℃, 1時間 加温 した｡冷後濃 アンモニアを加 え中和 し,エス テルを酢酸エチル (lone)で4回抽 出 した｡抽 出 液 を無水硫酸ナ トリウムで乾燥 し,濃縮乾固 した｡

残漆 を酢酸エチル (3me)に溶か し,分取 カラム クロマ トグラフィーを行 った｡ 1フラクシ ョンあ た り12mg集め,各 フラクシ ョンにつ いてTLCを 行 い,Rf値0.58を与 える2番 か ら5番の フラク シ ョンを集め濃縮乾固 した｡残至査をアセ トンに溶 解 し分取TLCを行 った｡上記Rf値のバ ン ドをか き取 り,酢酸エチルで抽 出 し,濃縮乾固 した｡再 結 晶 を試 みたが結 晶化 しなか った｡TLCお よび HPLCで純度 を調べ た結果,他 の成分 は認め られ な か った｡ EI質 量 分 析 m/Z (相 対 強 度):197

(4%,M+), 165 (100%, M+‑CH30H), 137 (85%,M+‑CH30H‑CO).

RBC中のHAの定量 1.採血 とRBCの分離

人静脈か らヘパ リン入 り採血管で採血 し, 7本 の試験 管 の各 々に血 液

( 3. 5 m e )

を入 れ た｡遠心 分離機 にか け (3,000rpm, 5分),上層 の血柴 を 除去 し, RBCを生 理 食 塩 水 で3回洗 浄 し, 水

( 2m e )

を加 え溶血 させ た｡検量線作製のため, 標 準HAO, 4, 8, 12, 16, 20FLgを含 む水 溶 液 (0.1me)を加 えた｡

2.HAの抽 出

上 記 の 標 準HAを含 む水 溶 液 に, 6 N塩 酸 (1me),メタノール(2me)お よびアセ トン(5me) を順 次 に 加 え そ の 都 度 撹 拝 し た｡ 遠 心 分 離

(3,000rpm, 5分) し沈殿 のHbタンパ クな どを 除いた｡沈殿 に残存す るHAを抽 出す るため, ア セ トン (2

m e )

を加 え撹拝 し,同 じように遠心分 離 し上清 を分離 した｡ ここで得 た上清 を前 の上清 と合 わせ,突沸防止 のためベ ンゼ ン (3me)を加 え,40℃で減圧下濃縮 して褐色残査 を得 た｡

3.HAのエステル化

残蔭 に20/o硫酸 ‑メタノール溶液 (

l o n e )

を加 え60℃, 1時間加温 しエステル化 した｡冷却後濃 ア ンモニア水で中和 し濃縮乾 固 し,褐色残査 を得 た｡

4.

順相 シ リカゲルカラム処理

残渡 に酢酸エチル (3me)を加 え潜解 し,n‑ヘ キサ ン (3me)を加 え生成す る沈殿 を遠心分離機 にか け (3,000rpm, 5分) 除去 した｡ 上清 を順 相 シ リカゲルカラムに注入 し30%酢酸エチル‑m‑ ヘキサ ン溶液

( 1 6 m e )

を通 し,溶 出液 を濃縮乾 固

し残達 を得 た｡

5.逆相 シ リカゲルカラム処理

残査 に10%メタノールー水溶液 (4mg)を加 え 溶解 し, この溶液 を逆相 シ リカカ ラムに通 しHA を吸着 させ た｡ さ らに10%メ タノール ‑水 溶 液

(5mg)を通 し爽雑物 を洗 い流 した後,35%メ タ ノールー水溶液 (4mg)を通 しHAメチル を溶 出 した｡

6.HAメチルのHPLC分析

溶出液 (0.1me)につ いてHPLC分析 を行 った｡

15分 の保持時間で出るピークの高 さを測定 し検量 線 を作製 した (図5参照)0

結 果 と 考 察

ここで合成 したHAとそのメチルエステルにつ いて,融 点 測定,元 素 分析 , 質量 分析,TLCお よびHPLCを行 い, 同定 と純度 を確認 した｡

1.溶血液か らHAの抽 出

溶血液 に添加 したHAは,塩酸酸性 に して初 め てその溶液 に溶 出す ることが わか った｡従 って, 溶血液 を塩酸酸性 に した後,除 タンパ ク剤 として メタノール とアセ トンの混合溶液 を加 え,膜の脂 質 や タンパ ク,Hb,Hbの酸分解で生 じたヘ ミン な どの爽雑物 をまず沈殿 と して除去 した｡ この沈 殿物 にまだ吸着 し残存 してい るHAが あ り, アセ トンと撹拝 しこれ を溶 出 した｡ ここで除 タンパ ク 剤 として繁用 されているアセ トニ トリルを上の混 合溶液の代 わ りに用 いる と,生成す る沈殿 はペ ー ス ト状 とな り, この沈殿 に吸着 しているHAのア セ トンによる溶 出が困難であ った｡ この ように し て得 られた溶 出液 は,ヘ ミンな どの褐色成分 をは

じめ多種 の爽雑物 を多 く含 んでいた｡

HPLC分析 まで には以下 の順相 と逆相 の二つの 型の シ リカゲルカラム処理が必要であ り, この方 法の検討 に多 くの時間 を費や した｡

2.エステル化

硫酸 ‑メ タノール溶液 に よるHAのエ ステル化 は,上 の条件 で完結 す る こ とが,反応 後 のTLC お よびHPLC分析 で確認で きた｡ この場合,反応 液の水分含量が, 7%以上である とこの反応 は完 結 しなか った (詳細 なデー タ省 略)｡ このため試 料 は,水 をで きるだけ含 まない ように乾固 してお

く必要があ った｡

3.

順相 シ リカゲルカラム

ここで用 いたシ リカゲル には,HPLCでHAメ チル と同 じ保持 時間に溶 出す る不純物 を含 んでい たので,酢酸エチル を通 して前 もって洗浄除去す る必要があ った｡その最小容量 は10meであ った｡

HAのエステル化後 の褐色 爽雑物 を含 む残査 を

‑ 79‑

n‑ヘ キサ ンを溶媒 に して この カラム に通す と, こ の褐色成分 はカ ラム先端 に強 く吸着 され るが, 同 時 に HA メチ ル も同様 に吸着 され溶 出 されない｡

反対 に極性 溶媒 の酢酸エチル に代 える と両方 とも 全 く吸着 されず に溶 出 され る｡褐色成分が吸着 さ れ HA メチ ルが 溶 出 され るn‑ヘ キサ ンに対 す る 酢酸エチ ルの濃度 を検討 した｡褐色成分 に HA メ チ )i,標 品 を添加 して クロマ トグラフ ィー を行 った 結果 ,図2に示 す ように,酢酸 エチルの濃度 を30%

に上 げ る と初 めて HA メチ ルの全部が溶 出 し,褐 色 成 分 もほ とん どカ ラム先 端 に吸 着 し除去 され た｡ しか し, この溶 出液 には まだ淡黄色 の爽雑物 が含 まれていた｡

(｡＼

｡

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図2 順相カラムによるHAメチルの溶出に及ぼす 酢酸エチル濃度の影響

方法の項に示すようにHAのエステル化後の 残査を,溶離液として異なる濃度をもつ酢酸 エチル (n‑ヘキサ ンに対 して)を用いてクロ マ トグラフィーを行った｡溶出液について HAを定量 し,その回収率を求めた｡詳細は 方法の項参照｡

4.逆相 シ リカゲルカ ラム

上 の黄色成分 を含 む溶 出液 を水 に洛解 して この カ ラム に通す と,HA メチ ル も黄色 成 分 も完全 に 吸着す るが,溶離液 にメ タノール を含 ませ る と黄 色成分が吸着 して HA メチルが溶 出 され て くる濃 度 が存在 していた｡ メ タノール濃度 を変化 し,港 出試 験 を した結 果, 図3に示 す よ うにそ の メ タ ノール濃度 は35%であ った. この こ とは,黄色成 分 は HA メチル よ り疎水性 が強 く,逆相 シ リカゲ ル に よ り強 く吸着す る性 質 を持 ってい ることが わ

か るo使用後 の カ ラムは, メ タノール (4me)を 通す と黄色成分 は完全 に溶 出 され るので再使用が 可能で あ った｡

I̲ ‑II .･･M

(｡

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0

10 20 30 40 50 Methqnol(○/｡)

図3 逆相カラムによるHAメチルの溶出に及ぼす メタノール濃度の影響

順相カラムの溶出液から得た残査を方法の項 に示すように逆相カラムにかけた｡溶離液 と して異なる濃度をもつメタノール (水に対 し て)を用いてクロマ トグラフィーを行った｡

溶出液について HAを定量 し,その回収率を 求めた｡詳細は方法の項参照｡

二

Retention time(min) 図4 HAメチルの高速液体クロマ トグラム

A:順相カラムからの溶出液について分析 し たもの｡

B:順相カラムからの溶出液を逆相カラムに 通 し,得 られた溶出液について分析 したも の｡図中の矢印は HAメチルのピークを示 す｡分析の条件などは試薬と機器および方 法の項参照｡

このカラムを通 させ ない試料 をHPLC分析す る と,図4Aに示す ように,HAメチルの溶 出のあ と40分 まで種々の爽雑物が溶出 した｡一方,カラ ムを通 した場合,図4 Bに示す ように,HAの溶 出後 に出るほとん どの爽雑物が除去 されているこ とがわか る｡ このカラム処理 は,HAメチルの分 析が終わると,つ ぎの試料注入が可能 とな り,分 析 の迅速化 に寄与 した｡

5.HPLC分析

HAの ピーク高か ら検量線 を作 った ところ,図 5に示 されるように,1.0120.OFLmO

l /

meRBCの 範囲で直線性が認め られた (HAメチルのHPLC については図4B参照)0

RBCの容量 は,採血後 のヘ マ トク リッ ト値 を 測定 し, この値 か ら求めた｡ HAの無添加 の赤血 球か らはHAメチルに相当す るピークが認め られ

なかった (クロマ トグラムは省略)0

(uJ

u)tLJB

芯

LJヱDad

1

号

｢ 図5 HAの検量曲線

HA添加赤血球を抽出,エステル化,カラム の各操作を行い,HAメチルをHPLC分析 し た｡HAメチルのピーク高から検量線を作製 した｡詳細は方法の項参照｡

6.回収率

赤血球 に添加 したHAが一連の定量操作 中に回 収 される量 について検討 した｡添加 した同 じ量の HAを硫酸 ‑メ タノール溶 液で直接 エ ス テル化 し,得 られたHPLCの ピーク高 と比較 した結果, HAの各 添 加 量 につ い て平 均 した と こ ろ65±

3.5%の回収率が得 られた｡ 2種の カラム処理で はほ とん ど定量的に回収 されているので,溶血液 か らHAの抽 出の ところに問題があるもの と思わ れる｡

7.終わ りに

本定量法 によって, 目的である赤血球中で溶血 毒 フェニル ヒ ドラジ ンとHbの反応で生 じるHA を定量で きるようになった｡赤血球試料 だけでな く, この方法で得 られた爽雑物の除去法 を工夫 し て,他 の生体試料 中のHAも定量で きる もの と思 われる｡ この際,HPLCの溶離 液のメタノール濃 度 を減少す るとHAメチルの保持時間が大 きくな り,他 の爽雑物 との分離が可能 となるもの と思わ れる｡

文 献

1)Lightner,DA.andQuistad,G.B :Hematinicacid andpropentdyopentsfrom bilirublnphoto‑0XidatlOn invitro.FEBSletters.,25:94‑96,1972

2)stoll,M.S :Formation,metabolism,andproperties ofpyrroliccompoundsappearlnglnthegut;inBili‑ rubinVol.2.Metabolism,Heirwegh,冗 P.M.and Brown,S.B.eds,CRC Presslnc.,BocaRaton,Flor‑ ida,pplO3‑131,1982

3)広田和弘,佐々木健二 :ヘモグロビンのヘム酸化が 契機となる血液毒の溶血機構.第29回 日本薬学会 中 四国支部大会講演要 旨集.36頁,1990

4)Hirota,K.,Hatanaka,T.andHlrOta,T.I.Isolationof N‑phenylprotoporphyrinIX from theredcellsand spleen of the phenylhydrazlne‑treated rat.Arch.

Biochem.Biophys"255:42147,1987

5)Hirota,KHYamamoto,S.andltano,H.A.:Urinary excretionofisomersofbiliverdinafterdestruction in vivoofhaemoproteinsand heamin.Biochem.J., 229:477‑483,1985

6)schaefer.W.H.,Harris,T M.andGuengericb,F.P.

:Characterizationof也eenzymaticandnonenzyma‑

ticperoxidativedegradationofIronpOrphyrinsand cytochromep‑450heme.Biochemistry.,24 :3254‑

3263,1985

7)Wittenberg,∫ andShemin,D.∫.:Thelocationin protoporphyrinofthecarbonatomsderivedfromthe a‑carbonatom ofglycine.J.Biol.Chem..185:1031 116,1950

‑ 81‑

要 約

フェニルヒ ドラジン惹起性溶血貧血機構の著者 らの研究 において,ヘモグロビンとフェニルヒ ドラジン との反応でヘムの酸化的開裂物質の1つであるヘマチ ン酸が生成することが示 された｡ この反応 によって 赤血球 (RBC)中で生 じたヘマチ ン酸 を定量する方法の確立が,溶血機構研究のため必要 となった｡人の RBCを水で溶血 し,ヘマチ ン酸の標品を加 えた｡塩酸, メタノール, アセ トンの溶液 え加 え,ほ とん ど のヘモグロビンを沈殿除去 した｡ メタノール‑硫酸溶液で加温 し,ヘマチ ン酸 をメチルエステルに誘導 し た｡爽雑物 を2種のシ リカゲルカラムを通す ことによって除去 し,逆相カラムを用いた高速液体 クロマ ト グラフィーで分析 した｡ヘマチ ン酸 は,1.0‑20.OFLmO

l / m e

RBCの範囲で定量で き,回収率 は65.0±3.5%

であった｡

ヘマチ ン酸 とこのメチルエステルの標品は,ヘ ミンを過酸化水素酸化す ることによって合成 し,元素分 析 と質量分析 によって確認 した｡

(1990年11月1日受理)