硝酸 イ オ ン カ タ ラーゼ メ トヘ モ グ ロ ビ ン
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(2) 844. 井. Fig. 1 (A, B). 奥. た.分. 調 整 した 正 常 及 び ア カ タ ラ. セ ミ ア マ ウ ス 溶 血 液 を1cmガ. ラ ス セ ル に採 り,. 分 光 光 度 計 にセ ッ トす る.こ. れ に亜 硝酸 ソー ダ. 水 溶 液 を 添 加 し,す し た.こ 37℃,. の 時,生 630mmに. ば や く撹 拌 し反 応 開 始 と. 成 さ れ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン を お け る吸 光 度 の 増 加 と し反 応. 時 間 と の 関 係 を経 時 的 に 記 録 し た. 添 加 す る亜 硝 酸 ソ ー ダ は,反 を0.99mM,. 1.32mM,. 也. Methemoglobin formation from hemoglobin in the hemo lysates of normal (Fig. 1 A) and acatalasemic (Fig. 1 B) mice by nitrite ion in the ranged from 0.99 to 2.60mM (Final concentration) as time lapse.. トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 測 定 0.4mgHb/mlに. 尚. 実 1.溶. 験. りの カ タ ラ ー ゼ 量 は,正. 2.亜. の条. 常 マ ウス1022±127.9. あ り,正. 成 の経 時 的変 化. 過 ホ ウ 素 酸 法10)に よ り37℃. た. カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス122. ±17.8pu/gHbで. 3.カ. タ ラーゼ 活性 度 の測 定. 績. 血 液 の カ タ ラーゼ 活 性 度. セ ミ ア マ ウ ス の 約9倍. 2.60mMと. 成. 今 回 使 用 した 溶 血 液 の ヘ モ グ ロ ビ ン1gあ. な る 様 に し た.. Feinsteinの. 録 計 は 日 立 製(100‑60型,. 使 用 し た.. pu/gHb(m±SD),ア. 応 液 中 の終 濃 度. 1.97mM,. 光 光 度 計,記. 056型)を. 常 マ ウス は ア カ タ ラ. の カ タ ラ ー ゼ 量 を示 した.. 硝 酸 ソ ー ダ添 加 後 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン生. 図1 A, Bに. おい て,横 軸 には 時 間(分)を,縦. 件 下 で 両種 マ ウ スの溶 血 液 につ い て カ タ ラーゼ. 軸 に は37℃. の 活 性 度 を定 量 した.活. 硝 酸 ソ ー ダ各 濃 度 に お け る経 時 的 な メ トヘ モ グ. 単 位(Perborate 4.ヘ. unit)で. 性 度 は過 ホ ウ素酸 塩一. モ グ ロ ビ ン量 お よ び メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃. Kampen法11)の. お け る 吸 光 度 を 表 し亜. ロ ビ ンの 生 成 を比 較 検 討 し た.両. 表 わ した.. 度 の測 定 Van. の630nmに. 較 で は,亜. 種 マ ウス の比. 硝 酸 ソ ー ダ 添 加 量0.99〜2.60mMの. い ず れ に お い て も ア カ タ ラ セ ミア の 方 が,正 改 良 法 を 用 い,測. 定 し. マ ウ ス よ り,メ. 常. トヘ モ グ ロ ビ ン を生 成 す る 速 度.
(3) 亜 硝 酸 イ オ ン に よ る 正 常 お よ び ア カ タ ラ セ ミア マ ウ ス 溶 血 液 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 差 異 に つ い て が速 い こ と が認 め られ た. 3.メ. 図2で. も に時 間 に 対 す る. メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 量 で はSigmoidal を 示 す.こ. の 現 象 は,溶. 添 加 し た 後,除. グ ロ ビ ン が 生 成 さ れ,一. 々 に,反. curve. 血 液 に亜硝 酸 ソ ー ダ を. 々 に ヘ モ グ ロ ビ ン よ り メ トヘ モ 定 のlag. phaseの. 急 速 に メ トヘ モ グ ロ ビ ン が 生 成 さ れ,次. Bで. 得 られた 正常 および ア. カ タ ラ セ ミア マ ウ ス の メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 に. トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 曲 線 の 解 析. 両 種 マ ウ ス の 溶 血 液 は,と. は,図1A,. 845. 後. いで徐. 応 が終 わ る た め で あ る と 考 え ら れ る.. お け る 誘 導 期 の 時 間 につ い て 比 較 し た.横 亜 硝 酸 ソ ー ダの 終 濃 度(mM)を 導 期 の 時 間(分)を ト し た.こ. 軸に. と り,縦 軸 に 誘. と り,そ れ ぞ れ の 値 を プ ロ ッ. の 図 よ り わ か る 様 に,正. カ タ ラ セ ミア マ ウ ス と も に,亜. 常 お よび ア. 硝 酸 ソー ダの濃. 度 の 増 加 に従 つ て 誘 導 期 間 は 短 縮 し た.亜 ソ ー ダ の 同 一 濃 度 で 比 較 した 場 合 は,い. 硝酸. ず れの. 筆 者 は メ トヘ モ グ ロ ビ ン 生 成 速 度 の 解 析 に 以 下. 濃 度 に お い て も ア カ タ ラ セ ミア マ ウ ス の 方 が 正. の 二 つ の パ ラ メ ー タ ー を使 用 し た.. 常 マ ウ ス よ り,誘. ① 誘 導 期;柿. ヘ モ グ ロ ビ ン生 成 速 度 の速 い ことが 認 め ら れ た.. 崎 ら12)に よ つ て 報 告 さ れ た亜 硝. 酸 ソ ー ダ で 馬 の オ キ シ ヘ モ グ ロ ビ ン よ り メ トヘ モ グロ ビ ン生 成 す る 際 の,生 Sigmoidal. curveの. 成 程 度 の 算 出 法 で,. 前 半 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン が. 図3で. は,横. 導 期 が 短 く,し. 軸 は 図2で. の 濃 度 の 逆 数 を,縦. た がっ て メ ト. 用 い た亜 硝酸 ソー ダ. 軸 は 図2と. 時 間 を分 単 位 で 表 示 し た.こ. 同 様 に誘 導 期 の の 時,添. 加 した 亜. 急 速 に 生 成 し始 め る ま で の 時 間 を誘 導 期 と して, 一 つ の パ ラ メー ター と した.. 硝 酸 ソ ー ダ の終 濃 度0.99〜2.60mMの. ②. 亜 硝 酸 ソ ー ダの 濃 度 の 逆 数 と誘 導 時 間 との 間 に,. 最 高 速 度;誘. 導 期 後 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン が 一. 定 の速 度 で 急 速 に生 成 す る時 の 速 度 を メ トヘ モ. 常 お よ び ア カ タ ラ セ ミア マ ウ ス 溶 血 液 は と も に,. ほ ぼ 直 線 関 係 が 認 め ら れ た.. グ ロ ビ ン生 成 期 の 最 高 速 度 と し次 の パ ラ メ ー タ. 5.最. ー と して い る .私. ロ ビ ン生 成 の 比 較. は,こ. れ らを用 い て正 常 及び. ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス の 誘 導 期 の 時 間 に よ る比 較,ま. た メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 期 の 最 高 速 度 に. 間 で,正. 高 速 度 を パ ラ メ ー タ ー と した メ トヘ モ グ. 図4の を,縦. 横 軸 は,亜. 軸 に は,. 硝 酸 ソー ダの 終 濃 度(mM). 1分 間 の630nmに. お け る吸 光 度. よ る 比 較 を行 つ た,. の 増 加 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 期 の 速 度 を. 4.メ. 表 し た.正. トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 誘 導 期 をパ ラ メ ー. 常 マ ウ ス,ア. カ タ ラセ ミアマ ウ ス と. ター と した比較. Fig. 3 Fig.. 2. Velocity of methemoglobin formation from hemoglobin in the hemolysates of normal (N) and acatalasemic (A) mice expressed as induction period.. Velocity of methemoglobin formation from hemoglobin in the hemolysates of normal (N) and acatalasemic (A) mice expressed as the reciprocal number of final concentration of NaNo2..
(4) 846. 井. 奥. 尚. 也. トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 最 高 速 度 は,ア. カ タラ セ. ミア マ ウ ス の 方 が 速 く,か つ 亜 硝 酸 ソ ー ダ の 濃 度 が 高 い ほ ど,そ. の 速 度 の差 が大 き くな る こと. が 認 め られ た. 考. 察. 自動 車 等 の 移 動 発 生 源 の 増 加 に 伴 い,都 お け る大 気 汚 染 問 題 が深 刻 と な り,特. に窒 素 酸. 化 物 の 有 毒 性 が 問 題 となって きて い る.中 は,マ. ウスのNO2ガ. 市 に. 島 ら13). ス暴 露 実験 にお い て呼 吸 器. 系 に強 い悪 影 響 を与 えるこ とを 報 告 して い る.ま た. Fig. 4. Maximal velocity of methemoglobin formation from hemolysate of normal (N) and acatalasemic (A) mice.. 血 液 の 変 化 と して, McCord5)は,熔. 接 夫 にメ ト. ヘ モ グ ロ ビ ン血 症 が み ら れ た こ と や ウ サ ギ,ラ ッ トのNO2ガ. ス 暴 露 で メ トヘ モ グ ロ ビ ン血 症 が. み ら れ た こ と な ど を 報 告 して い る. NOxはSOx も メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 速 度 は 亜 硝 酸 ソ ー ダ の. な ど に比 べ る と 水 に 溶 け に く い こ と か らSOxに. 濃 度 が 増 加 す る に した が っ て 直 線 的 に増 加 す る. 比 べ 容 易 に肺 の 深 部 まで 到 達 す る14).気. こ と が認 め ら れ た.. び 肺 を 通 して 血 液 中 に 入 る とNO2は. そ して,亜. 硝 酸 ソ ー ダの 同一 濃 度 にお け る メ. Fig. 5. び 硝 酸 と な る.ま. た,谷. 道 およ. 亜硝 酸 お よ. 口 ら8)の 報 告 に よ る 亜. Effect of hydrogen peroxide on methemoglobin formation by nitrite. (A) generation of hydrogen peroxide in the case of methemoglobin formation. (B) autoxidation of hemoglobin by hydrogen peroxide -(hemoglobin-methemoglobin cycle)15)..
(5) 亜 硝 酸 イ オ ン に よ る正 常 お よ び ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス 溶 血 液 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 差 異 に つ い て 硝 酸 の 経 口 摂 取 の 可 能 性 も 考 え られ る.. と す る小 林20)の 研 究 か らも推 定 で き る.そ して,. 亜 硝 酸 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 に つ い て は,前. 述 し た が,こ. 日 本 人 の ア カ タ ラセ ミア につ い て も同 様 の 結 果 が期 待 で き る.. れ を化 学 反 応 の 上 か ら考 察. す れ ば 以 下 の ご と くで あ る.す. 847. な わ ちオ キ シヘ. 柿 崎 らの 馬 の オ キ シ ヘ モ グ ロ ビ ン を 亜 硝 酸 ソ. モ グ ロ ビ ン を 亜 硝 酸 が 酸 化 し メ トヘ モ グ ロ ビ ン. ー ダ に よ り酸 化 す る 実 験 の 報 告 で は ,メ. トヘ モ. を生 成 す る 時, H2O2の. グ ロ ビ ン生 成 量 と 反 応 時 間 の 関 係 が,誘. 導期 を. い る(図5A).こ. 発 生 を伴 うと言 われ て. の 微 量 のH2O2に. ヘ モ グ ロ ビ ン化 が,更. よっ て メ ト. に進 む か否 か につ い ては. 現 在 で は, Keiline15)の. 述 べ る 如 く,メ. トヘ モ. グロ ビ ンは 自酸 化 的 に増 殖 す る と言 わ れ てい る (図5B).又,亜. 持 つ 反 応 で あ り,誘 導 期 の 時 間 と亜 硝 酸 ソ ー ダ の 濃 度 の 二 乗 が,逆. 比 例 す る こ と,メ. ロ ビ ン生 成 期 の 速 度 と亜 硝 酸 ソ ー ダ の 濃 度 が 正 比 例 す る こ と を述 べ て い る.. 硝 酸 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン生. 今 回 の マ ウ ス 溶 血 液 を 用 い た 実 験 で は,同. 成 に対 す る カ タ ラ ー ゼ の 抑 制 作 用 は 次 の ご と く. に誘 導 期 を持 つ 反 応 で は あ る が,前. で あ る.第1に. は,誘. はH2O2をH2OとO2と. に分 解. トヘ モ グ. 様. 者 につ いて. 導 期 の 時 間 と亜 硝 酸 ソ ー ダの 濃 度 の 逆 数. し メ トヘ モ グ ロ ビ ン がH2O2に. よ り自酸 化 的 に. が 直 線 関 係 を示 し,亜 硝 酸 ソ ー ダの 濃 度 と メ ト. 増 殖 す る の を抑 制 す る.第2に. は カ タ ラー ゼ と. ヘ モ グ ロ ビ ン生 成 期 の 速 度 は,柿. 微 量 のH2O2が. コ ン プ レ ッ ク ス を作 り こ の カ タ. 崎 らと同 様 に,. 直 線 関 係 を示 し て い る こ と が認 め られ た.. ラ ー ゼ ・H2O2が ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 作 用 に よ り亜 硝 酸 を 硝 酸 に酸 化 し, H2O2をH2OとO2に. 結 分. 解 す る こ と16,17)に よ り亜 硝 酸 に よ るヘ モ グ ロ ビ ン よ り メ トヘ モ グ ロ ビ ンの 生 成 を抑 制 す る と 考 え ら れ る が,こ. れ らの点 につ い ては 今後 検 討 し. て い くつ も り で あ る. 今 回 の 実 験 は,正. 論. 正 常 及 び ア カ タ ラ セ ミア マ ウ ス 溶 血 液 に亜 硝 酸 イ オ ン を 加 え,溶. 血 液 中の ヘ モ グ ロ ビ ンよ り. メ トヘ モ グ ロ ビ ン を 生 成 させ,そ. の際 の速 度 を. 測 定 し以 下 の 成 績 を 得 た.. 常 マ ウス と ア カ タラセ ミア. マ ウ ス の 溶 血 液 に 亜 硝 酸 ソ ー ダ を添 加 し,そ. れ. 1)両. 種 の 溶 血 液 は と も に,亜. 濃 度, 0.99〜2.60mM添. 硝酸 ソー ダの終. 加 時 に お いて ヘ モ グ ロ. ぞ れ メ トヘ モ グ ロ ビ ン を 生 成 させ た 際 に そ の 生. ビ ン よ り メ トヘ モ グ ロ ビ ンの 生 成 が 認 め られ た.. 成 速 度 に 差 を認 め た.こ. 2)メ. の 事 実 は,正. 常 マウス. トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 を,そ. の誘 導 期 と最. と ア カ タ ラ セ ミア マ ウ ス溶 血 液 に 含 ま れ る カ タ. 高 速 度 をパ ラ メ ー タ ー と し て 比 較 した 場 合,亜. ラ ー ゼ 量 の 差 に よ る も の で あ る と 考 え ら れ る.. 硝 酸 ソ ー ダの 濃 度 の い ず れ の 濃 度 に お い て も ア. 亜 硝 酸 に よ り生 成 さ れ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン に 対. カ タ ラ セ ミア マ ウ ス は,正. .す る ガ タ ラ ー ゼ の 関 係 に つ い て,中. 馬7)ら は,. カ タ ラ ー ゼ を添 加 す る こ と に よ り,メ. トヘ モ グ. 常 マ ウ ス よ り もメ ト. ヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 誘 導 期 が 短 く,か. っアカ タ. ラ セ ミ ア溶 血 液 中 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 速 度. ロ ビ ン の 生 成 を抑 制 す る 報 告 を し て い る が,私. は,正. は 正 常 及 び ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス の 溶 血 液 を用. れ た.. 常 マ ウ ス の そ れ よ り も 高 い こ と が認 め ら. い て 明 ら か に カ タ ラ ー ゼ が メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 なわ. 稿 を終 え る に あ た り,耐 えず 御 指 導,御 校 閲 い た. 対 す る高. だ いた 岡 山大 学 医 学 部 公衆 衛 生 学 教 室 緒 方 正 名 教 授. 成 に抑 制 的 に働 い て い る こ と を認 め た.す ち ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス は, NOxに 感 受 性 集 団 の 動 物 と考 え ら れ る.こ. の こ と は,. に深謝 致 し ます.. ア カ タ ラ セ ミ ア溶 血 液 の 自 酸 化 が 正 常 よ り速 い. 文 1.. Shy CM: The Chattanooga dioxide I methods. description. 献. School Children. Study;. of pollutant. exposure,. Effects. of community. and results. exposure. of ventilatory. to nitrogen. function. testing..
(6) 848. 井. J Air Pollut Control 2.. 志賀. 尚. 也. Assoc (1970)20, 539-545.. Shy CM: The Chattanooga Incidence. 3.. 奥. School Children. of acute respiratory. illness.. Study;. Effects. of exposure. to Nitrogen. dioxide. II,. J Air Pollut Control Assoc (1970) 20, 582-588.. 健:一 酸 化 窒 素 の 赤 血 球 障 害 機 構;環 境 科 学 研 究 報 告 集,文 部 省 「環 境 科 学」 特 別 研 究B‑216‑21‑3. (1984) pp 1‑10.. 4.. Mccord CP: A chemical and physiological. investiogation. of electric. arcwolding. III, Coated welding. rods, J 1 nd Hyg Toxicol (1941) 23, 200-215. 5.. 渡辺. 烈:メ. トヘ モ グロ ビ ン血 症;毒 性 学‑そ の生 化 学 的 側 面,吉 村 英 敏 編. 講 談 社 サイエ ンテ イフ イク,東. 京(1979) pp 225‑236. 6.. 上 代 皓 三:無 カ タ ラー ゼ 症;血 色 素 の 生 理 と臨 床,上 代 皓 三,中 尾 喜 久 監修,医. 学 書 院,東. 京(1958). pp. 568. 7.. 中 馬 一郎,小 坂 博 昭:亜 硝 酸塩 に よ る オキ シヘ モ グ ロ ビ ンの メ トヘ モ グ ロ ビ ンヘ の酸 化 反 応;環 境 科 学 研 究 報 告 集,文 部 省 「 環 境 科 学 」 特 別 研 究B‑216‑21‑3(1984). 8.. 谷 口 茂彦,河 (1986) 5,. 9.. 田 安 史:人 体 に お け る硝 酸 塩 の 移行,お. よ び 代 謝 生 合 成 の 口腔 内 生 態 系 の 関 与,岡. 山歯 医. 1‑11.. 河 田 安史,谷. 口 茂彦:硝. 広 島 歯誌(1978). 10. Feinstein. pp 11‑22.. 10,. 酸塩 の 移 行 と代 謝‑と. くに 口腔 内 生 態 系 を含 め た人 体 に お け る最 近 の 諸 問 題‑.. 1‑20.. RN: Perborate. as substrate. in a new assay of catalase.. J Biol Chem (1947) 180, 1197. -1202. 11. Van Assendelft Assen. OW: Spectrophotometry. Netherland. of Haemoglobin. Derivatives.. Royal Vangorcum. Ltd.. (1970).. 12. 柿 崎 敏 雄,佐 藤 光 男,鶴 田. 寛,長. 谷 川 弘 道:亜 硝 酸 ソ ー ダ に よ るオ キ シヘ モ グ ロ ビ ンの 酸化 につ い て.. 生 化 学(1964) 37, 14‑20. 13. 中 島 泰 知,楠 本 繁 子,陳 津 裕 司,原. 震 東,岡 本 一 也,服 部 正 次,建 石 竜 平,吉. 義守;窒 素 酸 化物 の 生 体 に お よぼ す 影 響(NO2の. 田. 亮,佐 藤 耕 三,井. 手 源 四 郎,大. 動 物 暴 露 実 験);光 化 学 反 応 に よ る大 気 汚 染. (1972) pp 145‑156. 14. 外 山 敏 夫;総 説,光 化 学 反 応 に よる大 気 汚 染 成 分 の 生体 影響 の 医 学 的 考 察:光. 化 学 反 応 に よる大 気 汚 染. (1972) pp 111‑122.. 15. Keilin D and Hartee EF: Reaction donors.. Nature. of methemoglobin. and catalase. with peroxides. and hydrogen. (1954) 173, 720.. 16. Heppel LA and Porterfield. VT: Metabolism. of inorganic. nitrite. and nitrate. esters.. J Biol Chem. (1949) 178, 549-556. 17. Keilin D and Hartee. EF:. Properties. of catalase.. Catalysis. of coupled. oxidation. of alcohols.. Biochem J (1945) 39, 293. 18.. 小 林 弘 治:変 99,. 389‑400.. 異 マ ウ ス 血 液 中 の カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 と メ トヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 の 関 係,岡. 山 医 学 会 雑 誌(1987).
(7) 亜 硝 酸 イ オ ン に よ る正 常 お よ び ア カ タ ラセ ミア マ ウ ス 溶 血 液 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン 生 成 の 差 異 につ い て. Methemoglobin. formation of normal. by nitrite. Department. ion in the hemolysates. and acatalasemic Naoya. mice. IOKU. of Public Health, Okayama University, 2-5-1 Shikata-cho,. 849. Medical School,. Okayama, Japan. (Director: prof. M. Ogata) The formation of methemoglobin from acatalasemic mice was studied by addition Data. indicated. that. induction. period. hemoglobin in the hemolysates of normal and of nitrite ion in the range from 0.99-2.60mM.. of methemoglobin. formation. in the acatalasemic. hemo. lysate is shorter than that in the normal hemolysate and maximal velocity in the acatalasemic hemolysate is heigher than that in the normal hemolysate. The results indicated that velocity of methemoglobin formation in the acatalasemic hemolysate is faster than that in the normal hemolysate..
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