岡 山 医 学 会 雑 誌 第117巻May2005,pp.27-33
平成15年度岡山大学医学賞(山 田賞)受 賞論文
腫 瘍 細 胞 にお け るIGF-Iレ
セ プ タ ー の 役 割 と
婦 人 科 癌 分 子 標 的 治 療 へ の応 用
本 郷 淳 司
岡山大学医学部 ・歯学部附属病院 産科婦人科
キ ー ワ ー ド: Soluble IGF-IR,Tumorigenesis,Apoptosis,Recombinant Protein,Bystander Effect
は じ め に I型 イ ン ス リ ン様 増 殖 因 子 受 容 体(IGF-IR)は1326 ア ミノ 酸 か ら な る 細 胞 膜 に 存 在 す る受 容 体 型 チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ で あ る(図1).イ ン ス リン 受 容 体 とお よ そ70 %の ホ モ ロ ジ ー を 有 し,リ ガ ン ド と し てIGF-I,IGF -II ,そ し て 生 理 的 濃 度 以 上 の イ ン ス リ ン と結 合 し,下 流 に様 々 な 情 報 を伝 達 す る.リ ガ ン ドの 結 合 に よ りIGF -IRは 自 己 リ ン 酸 化 を生 じ,下 流 のShc,IRS-1を リ ン 酸 化 さ せ,主 と してMAP kinaseカ ス ケ ー ドお よ びPI3kinaseの 経 路 を 活 性 化 させ て 様 々 な 生 理 的 変 化 を発 生 さ せ る.IGF-IRは 各 種 の 正 常 細 胞,腫 瘍 細 胞 に お け る増 殖 と分 化 に 関 わ る の み な ら ず,多 くの 悪 性 腫 瘍 に お い て,そ の 悪 性 形 質 獲 得 お よ び 維 持 に 重 要 な 役 割 を果 た し て い る1,2).ま た こ の 情 報 伝 達 系 が 伝 達 す る細 胞 増 殖 シ グ ナ ル 自体 は他 の 増 殖 因 子 と比 較 す る と 軽 微 で あ るが,一 方 そ の 細 胞 生 存 シ グ ナ ル は 非 常 に 強 力 で あ り,正 常 細 胞 や 各 種 腫 瘍 細 胞 に お い て 様 々 な 誘 因 に よ る ア ポ トー シ ス か ら細 胞 を 防 御 す る こ とが 知 ら れ て い る3-10).我 々 は こ のIGF-IRを 分 子 標 的 と し た 癌 治 療 へ の 応 用 を検 討 して い る が,本 編 で は そ の 概 略 と,特 に 卵 巣 癌 腹 腔 内 播 種 を含 め た 婦 人 科 癌 へ の 応 用 の 可 能 性 に 関 し て 言 及 す る. 各 種 のIGF-IR Targeting法 近 年IGF-IRの 持 つ 強 力 な 細 胞 生 存 シ グ ナ ル が 明 ら か に な る に つ れ て,様 々 な 悪 性 腫 瘍 の 治 療 を念 頭 に 各 種 のIGF-IRを 分 子 標 的 と し た 治 療 戦 略 が 検 討 さ れ つ
つ あ る.IGF-IR targetingの 戦 略 と し て はIGF-Iや
IGF-IRに 対 す る抗 体11,12),アン チ セ ン ス 法13-16),triple
helix法17),ミ リス チ ン 酸 付 加IGF-IR C末 端 ペ プ チ
ド18,19),dominant negativeと し て の 各 種 変 異 型IGF
-IR20,21)
,特 異 的 チ ロ シ ン キ ナー ゼ 阻 害 薬22,23),siRNA24), IGF binding protein25)の 強 制 発 現 な ど が 検 討 さ れ て い
る.こ れ ら の 方 法 を用 い て,こ のIGF axisを 遮 断, 減 弱 す る こ とに よ り,手 法 に よ っ て は 一 度 獲 得 し た 悪 性 形 質 を 消 失 させ た り,in vivoに お い て 強 力 に ア ポ ト ー シ ス を 惹 起 させ る こ とが 報 告 さ れ て い る. 婦 人 科 癌 に 対 す るIGF-IR分 子 標 的 治 療 の 合 目 的1生 我 々 はIGF-IRを 分 子 標 的 と し た 婦 人 科 癌 治 療 の 基 礎 検 討 を 行 っ て き た.ま ず 子 宮 頚 癌 は お よ そ90%が ヒ トパ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス(HPV)陽 性 で あ る特 殊 な 腫 瘍 と 言 え る が,我 々 は こ のHPVのE6蛋 白 が 癌 抑 制 遺 平 成17年3月 受 理 〒700-8558 岡 山 市 鹿 田 町2-5-1 電 話:086-235-7320FAX:086-225-9570 E-mail:[email protected] ◆ プ ロ フ ィー ル ◆ 大 学 院 当時,病 態分 子 生 物 学教 室(関 周 司 教授)の 下 で学 位 研 究 と分 子 生物 学 的 手 法 を教 わ る と同時 に,産 婦 人 科 の 臨床 で は子 宮頚 癌 の 術 前動 注 を担 当 して お りま した が,そ の腫 瘍 部 のEGFレ セ プ タ ー量 を検 討 したの が 増殖 因 子 受 容体 研 究 の始 ま りで す.大 学 院終 了後,工 藤 尚文 前教 授 の ご高配 で フ ィラ デル フ ィアのThomas Jefferson大 学Renato Baserga先 生 の 下 に 留学 し,IGF-Iレ セプ ターの 基 礎研 究 を始 め ま した.ボ ス ドク仲 間 と共 同 して,当 時 ほ とん ど未 解 明 で あ ったIGF-Iレ セプ ター の機 能解 析 を行 い,次 い で私 が 婦 人科 医で あ った ため,主 に卵巣 癌 培 養 細 胞 を用 いた抑 制 実 験 を行 い ま した.帰 国 後 も工 藤 前教 授,平 松 祐 司 教授 の ご配 慮 で,婦 人 科癌 への トラ ンス レ ー シ ョナル リサ ー チ,ま たIGF-Iレ セ プ ター の腫 瘍 細 胞 での 転 写調 節 の 基礎 研 究 を続 け させ て い た だ いて い ます.
伝 子 産 物 で あ るp53蛋 白 をユ ビ キ チ ン 化 に よ り分 解 し, 本 来p53蛋 白 が 有 す るIGF-IR転 写 抑 制 作 用 が 機 能 的 に 低 下 し て い る た め,HPV陽 性 子 宮 頚 癌 細 胞 で はIGF -IRの 発 現 が 亢 進 す る 機 序 を 明 らか に した26).故 にIGF -IR発 現 が 亢 進 し て い る 子 宮 頚 癌 に 対 して,こ れ を分 子 標 的 とす る の は 合 目的 と言 え る.我 々 は 各 種 の 子 宮 頚 癌 培 養 細 胞 にIGF-IRに 対 す るア ンチ セ ン スmRNA 発 現 ベ ク タ ー を遺 伝 子 導 入 す る こ とに よ り,強 力 にin vitroに お け る 足 場 非 依 存 性 増 殖 能 とin vivoに お け
る腫 瘍 形 成 能 を抑 制 し う る こ と を 示 し た16), ま た 子 宮 体 癌 に お い て は,そ の 発 症 の メ カ ニ ズ ム と して,ま ず 各 種 のDNA修 復 酵 素 異 常 が 初 期 に 生 じ, そ の 為 にPTEN遺 伝 子 の 点 突 然 変 異 を 高 率 に 有 し て い る事 が 報 告 さ れ て い る.PTENは フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ と し てIGF)IRな どの リン 酸 化 を 抑 制 して お り,PTEN 機 能 失 活 に よ るIGF)IR活 性 化 が 考 え られ る 子 宮 体 癌 図1 IGF-IRの 分 子 構 造 IGF-IRは α,β サ ブ ユ ニ ッ ト各2個 か ら な る4量 体 で,細 胞 膜 に 位 置 す る受 容 体 型 チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ で あ る. に お い て もIGF-IRは よ い 分 子 標 的 と考 え ら れ る. 卵 巣 癌 は 婦 人 科 悪 性 腫 瘍 の 死 亡 原 因 の 最 多 を 占 め る 疾 患 で あ り,近 年,シ ス プ ラ チ ン(お よ び そ の 誘 導 体) や タ キ ソー ル な どの 画 期 的 な 抗 癌 剤 が 開 発 さ れ た に も か か わ ら ず そ の 死 亡 率 は さ ほ ど低 下 し て い な い.卵 巣 癌 は 初 期 に は 全 く無 症 状 で あ り,診 断 さ れ た と き に は 既 に 腹 腔 内 に 広 く播 種 を 生 じた 進 行 癌 で あ る こ と が 主 な 原 因 で あ り,こ の 様 な 腹 膜 播 種 を 制 御 す る た め の バ イ ス タ ン ダー 作 用 を も っ た 新 し い 治 療 法 の 開 発 が 待 ち 望 ま れ て い る.我 々 は こ のIGF-IR情 報 伝 達 系 が 腹 水 内 に放 出 さ れ た 足 場 非 依 存 状 態 の 卵 巣 癌 細 胞 の 生 存 に 関 与 し,腹 膜 播 種 の 形 成 に 関 与 し て お り,逆 に こ の 経 路 を 遮 断 す る事 に よ り腹 膜 播 種 を制 御 で き な い か と考 え 以 下 の 検 討 を行 っ た. 486/STOP truncated lGF-lRに よ る 卵 巣 癌 制 御 の 試 み 様 々 な 方 法 の 中 で,in vivoで ア ポ トー シ ス を 誘 導 し27-29),バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 が 期 待 さ れ る可 溶 性IGF -IRで あ る486/STOPを 採 用 し た.こ の486/STOPは 細 胞 膜 外 の リガ ン ド結 合 部 位 で あ る α サ ブ ユ ニ ッ ト内 で あ る486番 目の ア ミ ノ酸 でのtruncated受 容 体 であ り, そ の 構 造 上,発 現 細 胞 の 細 胞 膜 よ り外 に 分 泌 さ れ,周 囲 の 細 胞 に バ イ ス タ ン ダー 効 果 を 及 ぼ す こ と が 予 想 さ れ る(図2). 今 回,我 々 は 卵 巣 癌 腹 膜 播 種 に 対 す る486/STOPの 抗 腫 瘍 作 用 を検 討 す る た め に,ヒ ト卵 巣 癌 由 来CaOV -3細 胞 を 用 い た 恒 久 的 遺 伝 子 導 入 ク ロ ー ン を樹 立 し , in vitro,in vivoで の 抗 腫 瘍 作 用 を 検 討 し た.ま た そ の 培 養 上 清 か ら 精 製 し た486/STOP組 み 換 え 蛋 白 を用 図2 486/STOPの 作 用 機 序 486/STOPは 発 現 細 胞 か ら周 囲 に分 泌 され,内 因 性 のIGF-IRと ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成 し て 作 用 す る と考 え ら れ る.
婦 人 科 癌 とIGF-Iレ セ プ ター:本 郷 淳 司 い て バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 を検 討 し,遺 伝 子 導 入 法 と 比 較 検 討 し た. 1.材 料 と方 法 1) プ ラ ス ミ ド 可 溶 性IGF-IR(486/STOP)ベ ク ターpIGF-IRso127) は ヒ トIGF-IR cDNAをSV40プ ロ モ ー タ ー 下 に 発 現 す るpCvn IGF-IRをAgeIに て 切 断,Klenow処 理 後blunt end ligationす る 事 に よ りframe shift mutationに よ り486番 目の ア ミ ノ酸 の 後 で ス トッ プ コ
ドン を作 成 し た も の で あ る. 2) 細 胞 株 と遺 伝 子 導 入
CaOV-3細 胞 は ヒ ト卵 巣 癌 由 来 培 養 細 胞 でATCC よ り購 入 し,10%FBS添 加DMEMに て 培 養 し た. pIGF-IRsolも し くはempty vectorはTransfectam
(Promega)に よ る リ ポ フ ェ ク シ ョ ン法 に て 遺 伝 子 導 入 し,800mg/mlのG418存 在 下 で 発 現 ク ロー ン を選 択 し
た.
3) ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト
486/STOPの 検 出 に は75μgのtotal cell lysateを 用 い てSDS-PAGEを 行 い,一 次 抗 体 と し て 抗IGF-IRα サ ブ ユ ニ ッ ト抗 体(N20,Santa Cruz Biotechnology)
を 用 い た.Conditioned medium(CM)よ りの486/ STOPの 検 出 に は48時 間 培 養 後 の 上 清 をMicrocon 30(Millipore)を 用 い て20倍 に 濃 縮 し た 後 に 同 様 に 行 っ た. 4) 単 層 培 養 細 胞 増 殖 能 CaOV-3由 来 各 ク ロー ン の 単 層 培 養 に お け る 細 胞 増 殖 能 と し て,5×104個 の 細 胞 を6穴 マ ル チ プ レ ー トに 植 え,24時 間 培 養 後,洗 浄 して各 々serum-free medium (SFM),20ng/ml IGF-I(Life Technology,Inc.) 添 加SFM,10%FBS添 加SFMを 加 え て 更 に48時 間 培 養 し た 後,細 胞 数 を 算 出 し た. 5) 軟 寒 天 培 地 に お け る 細 胞 増 殖 能 足 場 非 依 存 性 増 殖 能 の 検 討 の た め に,0.2%寒 天 を含 ん だ 培 地 中 に35mmプ レー トあ た り3×104個 の 細 胞 を植 え て 検 討 し た.バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 の 検 討 に は48時 間 培 養 後 のCMを 用 い て 作 成 し た軟 寒 天 培 地 を使 用 した. 6) ヌ ー ドマ ウ ス に お け る 腫 瘍 形 成 能 各 ク ロー ン をSFM中 で24時 間 培 養 後,PBSに て 洗 浄 し,100μ4のPBSに 懸 濁 し た5×106個 の 細 胞 を5週 齢 の オ スBALB/cヌ ー ドマ ウ ス に 接 種 し た.バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 の 検 討 の た め に,各 ク ロー ン とCaOV-3 親 細 胞 を1:1に 混 和 し て24時 間 共 培 養 し た 後,同 様 に1×107個(そ れ ぞ れ5×106個)の 細 胞 を 接 種 した. ま た バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 発 現 時 間 の検 討 の た め に,486/ STOP#49ク ロー ン と親 細 胞 を1:1に 混 和 して 各 種 時 間 共 培 養 し た 後,同 様 に1×107個 の 細 胞 を 接 種 し検 討 し た. 7) Invivoに お け る ア ポ トー シ ス の 検 出 1×107個 の486/STOP#49ク ロ ー ン を ヌー ドマ ウ ス に 接 種 し,48時 間 後 形 成 し た腫 瘍 を摘 出,ホ ル マ リ ン 固 定 パ ラ フ ィ ン 包 埋 後,切 片 を 作 成 し た.ア ポ トー シ ス はApo Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection kit(Intergen),お よ びHE染 色 に て 検 討 し た. 8) 486/STOP蛋 自 に よ る腫 瘍 増 殖 抑 制 486/STOP組 み 換 え蛋 白 調 整 の ため に486/STOP#49 ク ロ ー ン を100mmプ レ ー ト内SFM中 で48時 間 培 養 し た CMをCentriplus YM-50(Millipore)を 用 い て4℃ で20倍 に 濃 縮 精 製,再 度2mlのPBSで 洗 浄,再 濃 縮 し て 用 い た.5×106個 のCaOV-3細 胞 を ヌー ドマ ウ ス に 接 種 し た1週 後 よ り毎 週,形 成 し た腫 瘍 近 傍 に100 μ4の組 み 換 え 蛋 白 を注 射 し腫 瘍 増 殖 の 変 化 を検 討 した. 対 照 と し てempty vector#21を 用 い て 同 様 に 調 整 し た 溶 液 を用 い た. 2.結 果
1)Total cell lysate,Conditioned mediaか らの486/ STOP蛋 白 検 出
樹 立 し た486/STOPお よ びempty vectorグ ロ ー ン の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ トを 図3に 示 す.今 回,2つ のempty vectorク ロー ン#21,#22そ し て 中 等 量 の486/STOPを 発 現 す る ク ロ ー ン#48,486/STOPを 過 剰 発 現 す る ク ロ ー ン#49を 用 い た.ま た 各 グ ロ ー ン の 培 養 上 清 か ら同 様 の486/STOP蛋 白 が 細 胞 外 に 分 泌 さ れ て い る事 が 確 認 さ れ た(図4). 1 2 3 4
図3 486/STOPのtotal cell lysate中 の 発 現 レ ベ ル 各 ク ロ ー ン のtotal cell lysateか ら の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト を 示 す.Lanes:1,empty vector#21;2,empty vector #22;
1 2 3 4
図4 培 養 上 清 に 分 泌 さ れ た486/STOPの 検 出
分 泌 さ れ た486/STOPを 培 養 上 清 よ り ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ トに て 検 出 し た.Lanes:1,empty vector#21;2,empty vector #22;3,486/STOP#48;4,486/STOP#49.
図5 遺 伝 子 導 入CaOV-3ク ロ ー ン の 単 層 培 養 増 殖 能 5×104個 の 細 胞 を6穴 プ レ ー トに植 え,24時 間D-MEM士10% FBSに て 培 養 後,無 血 清 培 地(SFM)(closedbars),SFM+
20ng/ml IGF-I(open bars),SFM+10%FBS(striped bars) に て さ ら に48時 間 培 養 し,そ の 増 加 率 を 示 した. 2) 単 層 培 養 に よ る 細 胞 増 殖 能 樹 立 し た 各 グ ロー ン の 単 層 培 養 に お け る細 胞 増 殖 能 を 図5に 示 す.我 々 が 以 前 よ りIGF-I axisの 変 調, 遮 断 で は 単 層 培 養 細 胞 増 殖 に 変 化 が ほ と ん ど な い と報 告 し て い る よ う に16,18),SFM,IGF-I,10%FBSい ず れ に お い て も明 ら か な変 化 を認 め な か っ た. 3) 軟 寒 天 培 地 に お け る細 胞 増 殖 能 一 方 ,表1に 示 す よ う に486/STOP発 現 ク ロ ー ン で は,軟 寒 天 培 地 に お け る 足 場 非 依 存 性 増 殖 能 は 著 明 に 抑 制 さ れ て い た.ま た 各 ク ロー ン よ り得 たCMを 用 い て作 成 した 軟 寒 天 培 地 にCaOV-3親 細 胞 を植 え た と こ ろ,486/STOP発 現 ク ロ ー ン で は 抑 制 が 得 ら れ た が, empty vectorク ロ ー ン は 無 効 で あ っ た(表2). 4) 486/STOP発 現 ク ロ ー ン の 腫 瘍 形 成 能 樹 立 各 ク ロ ー ン の ヌ ー ドマ ウ ス で の 腫 瘍 形 成 能 を 図 6に 示 す.2つ のempty vectorク ロ ー ン は 親 細 胞 と 表1 軟 寒 天 培 地 に お け る コ ロ ニ ー 形 成 各 種 のCaOV-3ク ロー ン3×104個 を35mmプ レー ト中 の0.2%軟 寒 天 培 地 に植 え,直 径200μm以 上 の コ ロ ニ ー 数 を 算 定 し た. 表2 In vitroに お け る486/STOPの バ イ ス タ ン ダー 効 果 各 ク ロー ン のCMよ り作 成 した軟 寒 天 培 地 に3×104個 のCaOV -3親 細 胞 を植 え,直 径125μm以 上 の コ ロ ニ ー 数 を5週 後 に 算 定 し た.
図6 遺 伝 子CaOV-3ク ロ ー ン のin vivoで の 腫 瘍 形 成 能 各 ク ロー ン各 々5×106個 の 細 胞 を ヌー ドマ ウ ス 皮 下 に 接 種 し, 形 成 した 腫 瘍 の 体 積 変 化 を 示 した.(○),wild type CaOV-3 cells;(口),empty vector#21 cells;(■),empty vector#22 cells;(△),486/STOP#48 cells;(▲),486/STOP#49 cells.
同 様 に ヌ ー ド マ ウ ス 皮 下 に 腫 瘍 を 形 成 し た が,2つ の 486/STOP発 現 ク ロ ー ン の 腫 瘍 形 成 能 は 全 く 欠 如 し て い た . 5) 486/STOPのin vivoに お け る バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 の 検 討 486/STOP発 現 ク ロ ー ン よ り分 泌 さ れ た 組 み 換 え 蛋 白 が,実 際 にin vivoに お い て 親 細 胞 の 腫 瘍 形 成 能 を 抑 制 し う る か ど う か を 検 討 す る た め に,486/STOP発 現 ク ロ ー ン も し く はempty vectorク ロ ー ン と 親 細 胞
婦 人 科 癌 とIGF-Iレ セ プ タ ー:本 郷 淳 司 を1:1に 混 和 し て24時 間 共 培 養 し た 後 に ヌ ー ドマ ウ ス 皮 下 に 接 種 し,腫 瘍 形 成 能 の 変 化 を検 討 し た と こ ろ 486/STOP発 現 ク ロ ー ン に よ る バ イ ス タ ン ダー 作 用 に よ る腫 瘍 形 成 能 の 抑 制 を 認 め た(表3).次 に486/STOP #49ク ロ ー ン と親 細 胞 を用 い て,様 々 な 時 間 で 共 培 養 し た 後 の 腫 瘍 形 成 抑 制 効 果 を比 較 し た(図7).48時 間 以 上 共 培 養 す る と腫 瘍 形 成 は 完 全 に 抑 制 さ れ た が,24時 間 で は6匹 中3匹 が 腫 瘍 を形 成 し た.単 に 混 和 し た の み で 事 前 の 共 培 養 な し で は,腫 瘍 形 成 能 は 親 細 胞 の み の 場 合 と同 じで あ っ た.
6) 486/STOP発 現 細 胞 のin vivoで の 動 態
一 般 にIGF-IRの 発 現 量 や 機 能 が 阻 害 さ れ た 場 合, 表3 In vivoに お け る486/STOPの バ イ ス タ ン ダ ー 効 果 CaOV-3親 細 胞(wt)と 各 ク ロー ン を同 数 混 和 し,単 層 で48時 間 培 養 し た後,1×107個 の 細 胞 を ヌ ー ドマ ウ ス 皮 下 に 接 種 し た. 8週 後 の 腫 瘍 形 成 を検 討 し た. 腫 瘍 細 胞 は24時 間 以 内 の 短 時 間 に 急 速 に ア ポ トー シ ス に 陥 る18,30).我々 の 共 培 養 の 結 果 で は,充 分 な バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 を得 る に は48時 間 以 上 を要 す るた め,in vivo で48時 間 後 に486/STOP発 現 細 胞 が ど の 程 度 ア ポ トー シ ス に 陥 っ て い る か を検 討 し た.CaOV-3親 細 胞 は 接 図7 in vivoに お け る486/STOPの バ イ ス タ ン ダ ー 効 果 CaOV/3親 細 胞 と486/STOP#49細 胞 を 同 数 混 和 し,SFM中 で各 時 間 培 養 した 後,1×107個 の 混 和 細 胞 を ヌー ドマ ウ ス 皮 下 に接 種 し,6週 間 の あ い だ 腫 瘍 形 成 を観 察 し た.(○),5×106 の 親 細 胞 の み;(●),共 培 養 な し の 混 和 細 胞;(△),24時 間 共 培 養;(▲),48時 間 共 培 養;(口),72時 間 共 培 養.
図8 486/STOPに よ るin vivoで の ア ポ トー シ ス 誘 導
CaOV-3親 細 胞 も し くは486/STOP#49細 胞 を ヌ ー ドマ ウ ス 皮 下 に接 種 し,48時 間 後 回 収 し た.ホ ル マ リン 固 定 後,H & E染 色 も し く はTUNEL法 に て ア ポ トー シ ス を検 討 した.
種 後48時 間 で触 知 す る腫 瘍 を形 成 し,HE染 色 でviable ceilか ら な る腫 瘍 を 認 め た(図8A).TUNEL陽 性 の ア ポ トー シ ス 細 胞 は ご く少 数 で あ っ た(図8B).一 方,486/STOP#49細 胞 で は,HE染 色 で は 細 胞 質,核 と も凝 縮 し(図8C),TUNEL染 色 に て 広 汎 な ア ポ ト ー シ ス を 認 め た(図8D) . 7)486/STOP組 み 換 え 蛋 白 に よ る腫 瘍 形 成 抑 制 図9に 示 す よ う に486/STOP発 現 細 胞 よ り精 製 し た 組 み 換 え 蛋 白 の 投 与 に よ り既 存 のCaOV-3細 胞 に よ る ヌ ー ドマ ウ ス 皮 下 形 成 腫 瘍 の 増 殖 を 抑 制 す る こ と が 可 能 で あ っ た.一 方,同 様 に 調 整 さ れ たempty vectorク ロ ー ン 由 来 の 製 剤 投 与 で は,無 治 療 のCaOV-3親 細 胞 の 腫 瘍 形 成 と全 く変 化 を認 め な か っ た.こ の486/STOP 組 み 換 え 蛋 白 投 与 に よ る腫 瘍 形 成 抑 制 作 用 は 投 与 期 間 の6週 間 持 続 し て 認 め ら れ た が,そ の 後 投 与 を 中 止 す る と再 び 腫 瘍 は 再 増 殖 を 認 め た. 3.考 察 卵 巣 癌 の 死 亡 率 が 高 い の は,比 較 的 初 期 か ら腹 腔 内 播 種 を 生 じ る た め 手 術 に よ る治 癒 切 除 が 困 難 な こ と が 多 い た め と,一 時 的 に は 抗 癌 剤 に 反 応 す る が,そ の う ち に 抵 抗 性 を 示 す こ とが 多 い た め で あ る.本 研 究 で は も し腹 腔 内 に 投 与 す る と,そ の バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 が 腹 膜 播 種 の 制 御 に 有 効 と考 え られ る486/STOPの 有 用 性 を 検 討 し た.最 近 の 研 究 で,IGF-IRと そ の リガ ン ド で あ るIGF-Iは 単 な る増 殖 因 子 の み な ら ず,強 力 な 細 胞 生 存 因 子 と して 着 目 され て い る.我 々 は486/STOPが 悪 性 形 質 を 消 失 させ る こ と,ま た バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 図9 486/STOP組 み 換 え蛋 白投 与 に よ る腫 瘍 形 成 抑 制 CaOV-3親 細 胞 接 種 に て 形 成 した ヌー ドマ ウ ス 皮 下 腫 瘍 の 近 傍 に 精 製 し た486/STOP組 み 換 え蛋 白 を 毎 週 投 与 し た.(口,▲, △),486/STOP#49よ りの 組 み 換 え 蛋 白 投 与 マ ウ ス;(○,●), 対 照 と してempty vector#21細 胞 よ りの 上 清 を 同 様 に処 理 し投 与 し た マ ウ ス. が 期 待 さ れ る こ と よ り本 法 を採 用 し て 検 討 した が,そ の 抗 腫 瘍 作 用 機 序 は 現 在 ま で 全 て は 解 明 さ れ て い な い. 486/STOPは α サ ブ ユ ニ ッ ト内 で,リ ガ ン ドと の 結 合 に 必 須 で あ る692-702番 の ア ミ ノ酸 配 列 を有 して い な い た め,内 因 性 のIGF-IRと リガ ン ド との 結 合 を競 合 阻 害 す る も の で は な く,む し ろ486/STOPは 内 因 性 の IGF-IRと ヘ テ ロ ダ イ マ ー を形 成 し て 作 用 す る と考 え ら れ て い る29).我 々 が 樹 立 し た 内 因 性 のIGF-IRよ りは る か に 過 剰 発 現 し て い る ク ロー ン で も受 容 体 の チ ロ シ ン 自 己 リン 酸 化 やAktの セ リン リン 酸 化 に は ほ とん ど 減 弱 を認 め な か っ た.こ の こ とは486/STOPの 効 果 は 典 型 的 なdominant negative作 用 で は な く,む し ろ通 常 のIGF-IR情 報 伝 達 系 とは 独 立 し た 機 序 の 可 能 性 を 示 唆 す る. 今 回 の 検 討 で486/STOPを 過 剰 発 現 す る ク ロ ー ン を 樹 立 す る こ とが 出 来 た た め,我 々 は
486/STOP
のCaOV 一3細 胞 に 対 す る抗 腫 瘍 効 果 をin vitro,in vivo両 者で解 明 出 来 た.ま た そ の 過 剰 発 現 の た め,充 分 な 組 み 換 え 蛋 白 を精 製 して 検 討 す る こ とが 可 能 で あ っ た.我 々 の 結 果 で は,486/STOP発 現 細 胞 が 周 囲 の 細 胞 に 抗 腫 瘍 作 用 をお よぼ す た め に は 最 低48時 間 が 必 要 で あ っ た. しか しな が ら,様 々 な 手 法 でIGF-IRを 阻 害 し た 場 合, 腫 瘍 細 胞 は24時 間 内 に 急 速 に ア ポ トー シ ス に 陥 る こ と が わ か っ て お り,こ の こ と か ら考 え る と486/STOP遺 伝 子 導 入 法 で は 充 分 な バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 は期 待 で き ず,む し ろ486/STOP組 み 換 え 蛋 白 の 腹 腔 内 投 与 が 有 用 で は な い か と考 え られ た.ま た こ の 方 法 は ウ イ ル ス ベ ク タ ー を 用 い な い た め,ベ ク タ ー に よ り も た ら さ れ る可 能 性 が あ る副 作 用 を 回 避 で き る と思 わ れ る. 最 後 に 結 論 と し て,我 々 の486/STOP過 剰 発 現 ク ロ ー ン に よ る検 討 よ り,1)486/STOPはCaOV-3細 胞 のin vitroで の 足 場 非 依 存 性 増 殖 能 を消 失 さ せ た. 2)ま たin vivoで の 腫 瘍 形 成 能 を 阻 害 し た.3)こ れ らの 抗 腫 瘍 作 用 はバ イ ス タ ン ダ ー 作 用 を 伴 っ て い た. 4)精 製 し た486/STOP組 み 換 え 蛋 白 の 投 与 は 既 に 形 成 したCaOV-3細 胞 の ヌー ドマ ウ ス 皮 下 腫 瘍 の 増 殖 を 抑 制 し た.5)486/STOP組 み 換 え 蛋 白 投 与 法 は 遺 伝 子 導 入 法 と比 較 し て,バ イ ス タ ン ダ ー 作 用 の 点 で 優 位 と考 え られ た.こ れ ら の 成 績 は 腹 腔 内 播 種 を有 す る卵 巣 癌 治 療 に 対 す る486/STOP組 み 換 え 蛋 白 の 投 与 の 有 用 性 を充 分 に 裏 付 け る も の で あ る.今 後,動 物 を も ち い た 腹 腔 内 播 種 病 巣 の 治 療 モ デ ル な ど を 含 め た よ り一 層 の 検 討 が 必 要 で あ る.
婦 人 科 癌 とIGF-Iレ セ プ タ ー:本 郷 淳 司 お わ り に 今 回,我 々 の486/STOPを 用 い た 卵 巣 癌 培 養 細 胞 の 抑 制 実 験 の 結 果 を主 に,各 種 のIGF-IRを 分 子 標 的 と し た 悪 性 腫 瘍 細 胞 抑 制 の 戦 略 を 紹 介 し た.こ れ ら各 種 の 手 法 で あ るが,そ の 分 子 生 物 学 的 な 作 用 機 序 と して は,お そ ら く2つ に 大 別 す る こ とが 出 来 よ う.ま ず1 つ はIGF-IR発 現 の 抑 制 や リガ ン ド結 合 に よ る活 性 化 の 抑 制 な ど に よ り,IGF-IRの 自 己 リ ン酸 化 や 下 流 の 情 報 伝 達 の 遮 断 や 減 弱 化 を生 じ させ,そ の 結 果 と してIGF -IRの 持 つ 悪 性 形 質 転 換 シ グ ナ ル や 細 胞 生 存 シ グ ナ ル の 低 下 に よ りア ポ トー シ ス に 陥 らせ る も の で あ る.も う1つ は,今 回 の486/STOPや ミ リス チ ン 酸 付 加IGF -IRC末 端 ペ プ チ ド,そ の 他 幾 つ か の 手 法 で 報 告 さ れ て い る よ う に,IGF-IRの 自 己 リン 酸 化 やErk,Akt な どの リ ン 酸 化 な どIGF-IR本 来 の 情 報 伝 達 経 路 の 変 化 な し に 強 力 な ア ポ トー シ ス を惹 起 させ る もの で あ る. IGF-IRのC末 端 のdeletion mutantで の 検 討31)で指 摘 さ れ て い る様 にIGF-IRに は 本 来 ア ポ トー シ ス 誘 導 能 を そ のC末 端 に 有 し て い る が,通 常 はIGF-IR全 体 の 強 力 な 抗 ア ポ トー シ ス 能 で 打 ち 消 さ れ て い る と考 え ら れ て い る.こ の ア ポ トー シ ス 誘 導 の 情 報 伝 達 は 通 常 のIGF-IR情 報 伝 達 経 路 とは 異 な っ て い る 可 能 性 が あ り,今 回 の486/STOPや ミ リス チ ン 酸 付 加IGF-IR C 末 端 ペ プ チ ド等 は こ の 経 路 を独 立 し て 活 性 化 させ て い る か も知 れ な い.現 在,486/STOPの ア ポ トー シ ス 誘 導 経 路 を検 討 し て お り,今 後 こ の 分 子 メ カ ニ ズ ム の 解 明 と ま た 臨 床 応 用 を 目指 して,よ り低 分 子 量 のtruncat-ed IGF-IRを 作 成 し検 討 し て い る と こ ろ で あ る. 文 献
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