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沖縄県産野菜の抗酸化能及び抗酸化成分に関する研究

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ISSN 1882−9481

BULLETIN OF THE OKINAWA PREFECTURAL AGRICULTURAL

RESEARCH CENTER

No.2

March, 2009

沖縄県農業研究センター研究報告

第 2 号

平成 21 年 3 月

[別刷]

沖縄県農業研究センター研究報告 2:1-29, 2009

沖縄県産野菜の抗酸化能及び抗酸化成分に関する研究

前田剛希

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沖縄県農業研究センター研究報告 2: 1∼29,2009

沖縄県産野菜の抗酸化能及び抗酸化成分に関する研究

前 田 剛 希

Studies on antioxidant activities of Okinawan vegetables and those antioxidant substances

Gouki MAEDA

目 次 第 1 章 緒 論 ・・・・・・・・・・・・・・・・・1 第 2 章 沖縄県産野菜のポリフェノール含量と抗酸化能 2.1. 緒言・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2 2.2. 実験方法 2.2.1. 試薬・・・・・・・・・・・・・・・・・・2 2.2.2. 試料及び試料溶液の調・・・・・・・・・・4 2.2.3. 総ポリフェノール含量の測・・・・・・・・4 2.2.4. 抗酸化能の測定 (1) DPPH ラジカル (DPPH・) 消去・・・・・・ 4 (2) スーパーオキサイドラジカル (O2−・) 消去 能・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4 (3) t-BuOO ラジカル (t-BuOO・) 消去能 ・・・・4 (4) リノール酸 β - カロテン退色法・・・・・・4 2.3. 結果及び考察 2.3.1. 沖縄県産野菜の総ポリフェノール含量・・・5 2.3.2. 沖縄県産野菜の抗酸化能 (1) DPPH ラジカル(DPPH・) 消去能 ・・・・・6 (2)スーパーオキサイドラジカル (O2−・)消去能・・6 (3) t-BuOO ラジカル (t-BuOO・) 消去能 ・・・・6 (4) リノール酸 β-カロテン退色法・・・・・・・7 2.4. 小括 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10 第 3 章 ホソバワダンのポリフェノール 3.1. 緒言 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10 3.2. 実験方法 3.2.1. 試薬・・・・・・・・・・・・・・・・・11 3.2.2. 沖縄県野菜のポリフェノール分布パターンの 比較・・・・・・・・・・・・・・・・・11 3.2.3. ホソバワダンポリフェノールの分離・同定 (1) ホソバワダン抽出液の調製・・・・・・・11 (2) ホソバワダンポリフェノールの分離・精 製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・11 (3) ホソバワダンポリフェノールの LC/MS 及び NMR 分析・・・・・・・・・・・・・・12 3.3. 結果及び考察 3.3.1. ホソバワダンなど沖縄県野菜のポリフェノー ル分布パターンの比較・・・・・・・・・12 3.3.2. ホソバワダンポリフェノールの同定・・・12 3.4. 小括・・・・・・・・・・・・・・・・・13 第 4 章 ホソバワダンポリフェノールの低密度リポタン パク質(LDL)抗酸化能 4.1. 緒言・・・・・・・・・・・・・・・・・・・16 4.2. 実験方法 4.2.1. 試薬・・・・・・・・・・・・・・・・・17 4.2.2. 試料及び試料溶液の調製・・・・・・・・17 4.2.3. ホソバワダンのポリフェノール含量の測 定・・・・・・・・・・・・・・・・・・17 4.2.4. ホソバワダンポリフェノールの DPPH・消去 能・・・・・・・・・・・・・・・・・・18 4.2.5. ホソバワダン抽出液及びホソバワダンポリフ ェノールの LDL 抗酸化能の測定・・・・・18 4.3. 結果及び考察 4.3.1. ホソバワダンのポリフェノール含量の測 定・・・・・・・・・・・・・・・・・18 4.3.2. ホソバワダンポリフェノールの DPPH・消去 能・・・・・・・・・・・・・・・・・・18 4.3.3. ホソバワダン抽出液及びホソバワダンポリフ ェノールのLDL抗酸化能の測定・・・・19 4.4. 小括 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・22 第 5 章 ラットにおけるホソバワダンポリフェノールの 血中動態 5.1. 緒言 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・22 5.2. 実験方法 5.2.1. 試薬・・・・・・・・・・・・・・・・・22 5.2.2. 試料及び試料溶液の調製・・・・・・・・23 5.2.3. 動物実験・・・・・・・・・・・・・・・23 5.2.4. 血漿中のポリフェノールの抽出及び Glucuronidase/ Sulfatase 処理・・・・・・・23 5.2.5. 血漿中のポリフェノールの HPLC 及び LC/ MS 分析 ・・・・・・・・・・・・・・・・・23 5.3. 結果及び考察 5.3.1. ラットにおけるホソバワダンポリフェノー ル類の血中動態・・・・・・・・・・・23 5.4. 小括 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・25 第 6 章 総 括・・・・・・・・・・・・・・・・26 謝 辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・27 参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・27

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第 1 章 緒 論 伝統的な日本式の食スタイル,つまり,穀類,魚介類, イモ類,豆類,野菜・果実類をバランスよく組み合わせた 和食は,生活習慣病の予防という観点から国際的に注目さ れている.しかしながら,皮肉なことに我が国の食スタイ ルは欧米化が進み,野菜,魚中心の和食から肉中心の洋食 が増えている.さらに核家族の増加,ファーストフードな どの外食産業やコンビニエンスストアの増加,食品加工技 術の進歩による食の孤食化,個食化が進み,食スタイルは 非常に多様化している. 食スタイルの欧米化は,肥満や高脂血症,糖尿病,高血 圧症など生活習慣病の増加の原因と考えられている.これ ら 4 つの病態のうちいずれかを合併するメタボリックシ ンドロームという病態は動脈硬化の危険因子が集積して いる状態であり,アテローム性血栓症の発症を著しく増加 させる.動脈硬化を基盤として発症する心筋梗塞や脳梗塞 は我が国の死因のトップを占めており,生活習慣病の予防 やコントロールは大きな社会的課題の一つになっている. 長寿県として知られる沖縄県も例外ではなく,食スタイル の変化に伴う肥満など生活習慣病の増加が指摘されてい る.社会保険庁の調査によれば,2000∼2004 年度の政府 管掌健康保険「生活習慣病予防検診」受診者のうち,BMI (体格指数:体重(kg)÷ 身長(m)÷ 身長(m))が 25 以上で“肥満”と診断される人の割合は,沖縄県が男女とも に全国一位である.また,厚生労働省の大臣官房統計情報 部人口動態保険統計課によると,沖縄県の男性の平均寿命 は 1985 年には 1 位であったが,1990,1995 年は 5 位,2000 年には 26 位にまで低下している.男性の平均寿命が全国 1 位から 26 位まで急激に低下した事実は“26 ショック”と 呼ばれ,沖縄県では大きな問題となっている.沖縄県は, 戦後のアメリカ統治という歴史的事情から,国内でもいち 早く食の欧米化が進み,食スタイルが激変した地域である. “26 ショック”が,従来の沖縄式食スタイルから肉食中心 の欧米式食スタイルへの変化によるものかは不明である. しかしながら,メタボリックシンドロームが社会問題とし てクローズアップされる状況下,沖縄県が戦後数十年とい う短期間で平均寿命全国一位から失墜し,全国一の肥満地 域に変貌した事実は,沖縄の伝統的な食文化,食材の見直 しという社会的気運の高まりに繋がっている.かつては長 寿地域であった沖縄県の伝統的な食材は,生活習慣病に予 防的作用を有する可能性がある食材として,改めて注目さ れている. 沖縄県で利用される食材には他府県では見られないも のが多い.その理由として,中国など近隣アジア諸国の影 響を強くうけた沖縄の食文化は日本の中でも独特である こと,亜熱帯地域に位置するために本州と異なる生物相を 有し,食材の種類が豊富であることが考えられる.温帯地 域の本州と比べると,沖縄で栽培されている野菜,果実の 種類は非常に多様である.他府県とは異なる様々な食材を 利用してきた従来の沖縄式食スタイルは,豚肉を中心とし た脂肪の摂取が多い反面,緑黄色野菜,薬草,海草の摂取 が多いことを特徴とする1).中でも特筆すべきは,国内 で最も豚肉の利用が多いことである.さらに興味深いこと に,沖縄県は国内で最も高脂肪摂取地域であるにも関わら ず,動脈硬化に起因する心臓病,脳溢血などの循環器系疾 患による死亡が少ないという相反する現象が見られてい る2).この現象に類似したものとして有名なのが,フラ ンスは高脂肪摂取国であるにも関わらず循環器系疾患に よる死亡が少ないという矛盾した現象“フレンチパラドッ クス”である3).フランスの例では,フランス人が日常的 に飲用している赤ワインに含まれる抗酸化成分のポリフ ェノールが抗動脈硬化作用を示すことが明らかにされて いる4-8).フランスの例と同様に,沖縄県で伝統的に利用 されてきた食材も,動脈硬化に起因する循環器系疾患に対 して予防的効果を有するポリフェノールなどの抗酸化成 分を多く含んでいることが十分に期待される.先述したよ うに沖縄県は高脂肪摂取地域であるが,一方では野菜の摂 取も多い地域であり,一人あたりの緑黄色野菜の年間消費 量は他府県に比べて約 30%以上多い2) .さらに沖縄県では 薬草として用いられる野菜を日常食に多く利用している. 例えばニシヨモギ,ホソバワダンは解熱などに,ウイキョ ウやボタンボウフウは咳止めなどに効くとされる薬草で あるが9) ,汁物の具材など野菜として日常的に食べられて いる.これらの事実と伝承から,沖縄で食されてきた野菜 が何らかの生理活性を有していることは十分に予想され る. そこで本研究では,まず沖縄で利用されている野菜,特 に茎・葉菜類,果菜類の抗酸化能を評価するために,沖縄 県内で入手した 45 品目の野菜のポリフェノール含量を調 べるとともに,分光測定法によるDPPHラジカル消去能や スーパーオキサイドラジカル消去能などin vitroの実験系 により抗酸化活性を測定した.さらに,ホソバワダンにつ いては抗酸化成分であるポリフェノールの単離を行い, 1 H-NMR, 13C-NMR,MSスペクトル分析によって,数種類 のポリフェノールを同定した.抗酸化物質であるポリフェ ノール類は動脈硬化発症要因の一つとされる低密度リポ タンパク質(Low density lipoprotein; LDL)の酸化を抑制す ることが明らかにされている.LDL抗酸化能を有するアン トシアニンやカテキンなどのポリフェノールを含むワイ ンやお茶の摂取後は血中の被酸化性が低下することも報 告されている10,11).したがって,ワインやお茶のように LDL抗酸化能を有し,摂取後は血中へ移行するポリフェノ ールを多く含む素材は,血中の状態を良好に保ち動脈硬化 に予防的に作用することが期待される.そこで,構造が明 らかになったホソバワダンポリフェノールについてはさ

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らに研究を進め,各成分のヒトLDLに対する抗酸化能を測 定した.また,LDL抗酸化能を示した成分の体内吸収性を 明らかにするために,ラットにホソバワダン抽出物を投与 し,ホソバワダンポリフェノールの血中動態について検討 した. 本論文では,まず第 2 章に,沖縄で入手した野菜 45 品 目のポリフェノール含量及び抗酸化能を評価した結果を 述べた.第 3 章では,ホソバワダンに含まれるポリフェノ ールの単離精製及びその構造決定についてまとめた.第 4 章では,ホソバワダンに含まれるポリフェノールの LDL 抗酸化能を,in vitro で調べた結果を述べた.さらに第 5 章では,ホソバワダン抽出物を投与したラット血中のホソ バワダンポリフェノールの動態を HPLC などで分析した 結果をまとめた.最後に第 6 章で,本研究の全内容を総括 した. 第 2 章 沖縄県産野菜のポリフェノール含量と抗酸化能 2.1. 緒言 沖縄の伝統的な食文化は,日本の他の地域と比較すると 1)海草の摂取が多い,2) 緑黄色野菜の摂取が多い,3) 薬草の摂取が多い,4)脂肪の摂取が多い,5)塩分の摂取 が少ないという特徴を有していた1).注目すべき点は, 沖縄は豚肉の摂取量が多い高脂肪摂取地域であるにもか かわらず,動脈硬化に起因する循環器系の疾病,例えば虚 血性心疾患や脳溢血による死亡が少ないことである2) フランスでも同じような現象が見られ,フランスは欧米諸 国の中でも高脂肪摂取国である割に循環器系疾患による 死亡が少ない.この現象はフレンチパラドックスとして有 名であり3),フランス人の日常的な赤ワイン摂取が動脈硬 化疾患のリスクを軽減させており,その関与物質として赤 ワイン中のポリフェノールが血中の抗酸化活性を上昇さ せ,低密度リポタンパク質(Low density lipoprotein;LDL) の酸化を抑制することで抗動脈硬化作用を示していると 考えられている4-8).これと同様に,沖縄で日常食べられ ている食材も,抗酸化成分として動脈硬化に抑制的に作用 するポリフェノールを含んでいることが期待される. ポリフェノールは,植物中に多く見られるカテコール構 造を有する化合物の総称であり,その多くは抗酸化能を有 する.生体内で過剰に発生した活性酸素やフリーラジカル は細胞やDNAなどを損傷し,老化,癌,さらには動脈硬 化など生活習慣病の発症要因になるとされている.生体内 で最初に生成されるフリーラジカルはスーパーオキサイ ドラジカル(O2 −・)である.O 2 −・自体はそれほど毒性は 高くないが,O2 −・の生成に引き続きヒドロキシルラジカ ル(OH・)などの反応性が高く毒性の強いラジカル種が生 成する.さらに,生体内で発生したフリーラジカルによる 連鎖的脂質過酸化反応により,細胞膜の脂質は過酸化脂質 (LOOH)となり様々な疾患の原因となる12,13) .抗酸化能 を示すポリフェノールは,活性酸素やフリーラジカルによ って発症すると考えられている疾患に予防的に作用する ことが予想され,ポリフェノールを多く含む食材は人の健 康維持に有用であることも期待される. 本章では,沖縄で利用されている野菜,特に茎・葉菜類, 果菜類の抗酸化能評価を目的とし,県内で入手した野菜 45 品目のポリフェノールの定量,比色法によるDPPHラジ カル(DPPH・)消去能を測定した.さらに高ポリフェノー ルで強いDPPH・ 消去能を示した野菜については,O2−・, t-BuOOラジカル(t-BuOO・)消去能などin vitroの実験系に より,詳細に抗酸化能を調べた. 2.2. 実験方法 2.2.1. 試薬

2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate(MES), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH),Trolox は和光純薬工 業(株)から購入した.diethylenetriamine-

N,N,N’,N”,N”-pentaacetic acid(DTPA)は同人化学社製を用

いた.hipoxanthine(HPX)は Sigma 社製,xanthine oxidase (XOD,牛乳由来)と superoxide dismutase(SOD,ウシ赤 血球由来)は Rosche Diagnositics 社製を用いた.

5,5-dimethyl-1-pyroline-N-oxide(DMPO)はラボテック(株) から購入した.その他の試薬は,市販の特級試薬を使用し た.

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Table 1. Vegetables used as experimental materials, obtained from retail stores in Okinawa Prefecture

Sample No. Japanese name* English name Scientific name Parts used

1 Akageuri ** Cucumber Cucumis sativus L. flesh

2 Akapiiman Red pepper Capscicum annuum L. flesh

3 Aojiso Japanes Perilla Perilla ocymoides L. leaf

4 Asuparagasu Asparagus Asparagus officinalis L. young stalk

5 Bajiru Sweet basil Ocimum basilicum L. leaf

6 Botanbouhuu Peucedanum japonicum Thunb. leaf

7 Burokkori Broccoli Brassica oleracea L. var. italica Plenck bud

8 Ensai Water convolvulus Ipomoea aquatica Forsk. leaf, stalk

9 Hadaikon Japanese radish Raphanus sativus L. leaf

10 Hechima Loofah Luffa cylndrica M.J.ROEM. flesh

11 Hihatsumodoki Long pepper Piper retrofractum Vahl leaf

12 Hosobawadan Crepidiastrum lanceolatum Nakai leaf

13 Hourensou Spinach Spinacia oleracea L. leaf

14 Karashina Mustard green Brassica juncea Czern.et Coss. leaf 15 Komatsuna Chinese mustard Brassica campestris L. (rapa.group) leaf

16 Kureson Watercress Nasturtium officinale R.Br. leaf, stalk

17 Kuwansou ** Day lily Hemerocallis fuluva L. leaf

18 Kyabetsu Cabbage Brassica oleracea L. var. capitata L. leaf

19 Kyuuri Cucumber Cucumis sativus L. flesh

20 Makomo Manchurian wild rice Zizania latifolia (GRISEB.) STAPF young stalk

21 Maruokura Okra Abelmoschus esculentus Moench. whole fruit

22 Mitsuba Japanese honewort Cryptotaenia japonica Hassk. leaf

23 Moroheiya Jew's mallow Corchorus olitorius L. leaf

*The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa.

** Plants of unknown Japanese names were indicated by the local names used in Okinawa.

Table 1. Vegetables used as experimental materials, obtained from retail stores in Okinawa Prefecture

Sample No. Japanese name* English name Scientific name Parts used

1 Akageuri ** Cucumber Cucumis sativus L. flesh

2 Akapiiman Red pepper Capscicum annuum L. flesh

3 Aojiso Japanes Perilla Perilla ocymoides L. leaf

4 Asuparagasu Asparagus Asparagus officinalis L. young stalk

5 Bajiru Sweet basil Ocimum basilicum L. leaf

6 Botanbouhuu Peucedanum japonicum Thunb. leaf

7 Burokkori Broccoli Brassica oleracea L. var. italica Plenck bud

8 Ensai Water convolvulus Ipomoea aquatica Forsk. leaf, stalk

9 Hadaikon Japanese radish Raphanus sativus L. leaf

10 Hechima Loofah Luffa cylndrica M.J.ROEM. flesh

11 Hihatsumodoki Long pepper Piper retrofractum Vahl leaf

12 Hosobawadan Crepidiastrum lanceolatum Nakai leaf

13 Hourensou Spinach Spinacia oleracea L. leaf

14 Karashina Mustard green Brassica juncea Czern.et Coss. leaf 15 Komatsuna Chinese mustard Brassica campestris L. (rapa.group) leaf

16 Kureson Watercress Nasturtium officinale R.Br. leaf, stalk

17 Kuwansou ** Day lily Hemerocallis fuluva L. leaf

18 Kyabetsu Cabbage Brassica oleracea L. var. capitata L. leaf

19 Kyuuri Cucumber Cucumis sativus L. flesh

20 Makomo Manchurian wild rice Zizania latifolia (GRISEB.) STAPF young stalk

21 Maruokura Okra Abelmoschus esculentus Moench. whole fruit

22 Mitsuba Japanese honewort Cryptotaenia japonica Hassk. leaf

23 Moroheiya Jew's mallow Corchorus olitorius L. leaf

*The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa.

** Plants of unknown Japanese names were indicated by the local names used in Okinawa.

Table 1. Vegetables used as experimental materials, obtained from retail stores in Okinawa Prefecture

Sample No. Japanese name* English name Scientific name Parts used

1 Akageuri ** Cucumber Cucumis sativus L. flesh

2 Akapiiman Red pepper Capscicum annuum L. flesh

3 Aojiso Japanes Perilla Perilla ocymoides L. leaf

4 Asuparagasu Asparagus Asparagus officinalis L. young stalk

5 Bajiru Sweet basil Ocimum basilicum L. leaf

6 Botanbouhuu Peucedanum japonicum Thunb. leaf

7 Burokkori Broccoli Brassica oleracea L. var. italica Plenck bud

8 Ensai Water convolvulus Ipomoea aquatica Forsk. leaf, stalk

9 Hadaikon Japanese radish Raphanus sativus L. leaf

10 Hechima Loofah Luffa cylndrica M.J.ROEM. flesh

11 Hihatsumodoki Long pepper Piper retrofractum Vahl leaf

12 Hosobawadan Crepidiastrum lanceolatum Nakai leaf

13 Hourensou Spinach Spinacia oleracea L. leaf

14 Karashina Mustard green Brassica juncea Czern.et Coss. leaf 15 Komatsuna Chinese mustard Brassica campestris L. (rapa.group) leaf

16 Kureson Watercress Nasturtium officinale R.Br. leaf, stalk

17 Kuwansou ** Day lily Hemerocallis fuluva L. leaf

18 Kyabetsu Cabbage Brassica oleracea L. var. capitata L. leaf

19 Kyuuri Cucumber Cucumis sativus L. flesh

20 Makomo Manchurian wild rice Zizania latifolia (GRISEB.) STAPF young stalk

21 Maruokura Okra Abelmoschus esculentus Moench. whole fruit

22 Mitsuba Japanese honewort Cryptotaenia japonica Hassk. leaf

23 Moroheiya Jew's mallow Corchorus olitorius L. leaf

*The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa.

** Plants of unknown Japanese names were indicated by the local names used in Okinawa.

Table 1. Vegetables used as experimental materials, obtained from retail stores in Okinawa Prefecture

Sample No. Japanese name* English name Scientific name Parts used

1 Akageuri ** Cucumber Cucumis sativus L. flesh

2 Akapiiman Red pepper Capscicum annuum L. flesh

3 Aojiso Japanes Perilla Perilla ocymoides L. leaf

4 Asuparagasu Asparagus Asparagus officinalis L. young stalk

5 Bajiru Sweet basil Ocimum basilicum L. leaf

6 Botanbouhuu Peucedanum japonicum Thunb. leaf

7 Burokkori Broccoli Brassica oleracea L. var. italica Plenck bud

8 Ensai Water convolvulus Ipomoea aquatica Forsk. leaf, stalk

9 Hadaikon Japanese radish Raphanus sativus L. leaf

10 Hechima Loofah Luffa cylndrica M.J.ROEM. flesh

11 Hihatsumodoki Long pepper Piper retrofractum Vahl leaf

12 Hosobawadan Crepidiastrum lanceolatum Nakai leaf

13 Hourensou Spinach Spinacia oleracea L. leaf

14 Karashina Mustard green Brassica juncea Czern.et Coss. leaf 15 Komatsuna Chinese mustard Brassica campestris L. (rapa.group) leaf

16 Kureson Watercress Nasturtium officinale R.Br. leaf, stalk

17 Kuwansou ** Day lily Hemerocallis fuluva L. leaf

18 Kyabetsu Cabbage Brassica oleracea L. var. capitata L. leaf

19 Kyuuri Cucumber Cucumis sativus L. flesh

20 Makomo Manchurian wild rice Zizania latifolia (GRISEB.) STAPF young stalk

21 Maruokura Okra Abelmoschus esculentus Moench. whole fruit

22 Mitsuba Japanese honewort Cryptotaenia japonica Hassk. leaf

23 Moroheiya Jew's mallow Corchorus olitorius L. leaf

*The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa.

** Plants of unknown Japanese names were indicated by the local names used in Okinawa.

Table 1. Vegetables used as experimental materials, obtained from retail stores in Okinawa Prefecture (continued)

Sample No. Japanese name* English name Scientific name Parts used

24 Muji ** Stem of Taro Colocasia esculenta Schott stem

25 Nasu Egg plant Solanum melongena L. whole fruit

26 Nigauri Bitter gourd Momordica charantia L. flesh

27 Nira Chinese chive Allium tuberosum ROTTLER leaf

28 Nishiyomogi Mugwort Artemisia princeps Pamp. leaf

29 Papaya Papaya Carica papaya L. flesh

30 Paseri Parsley Petroselinum crispum Nym. leaf

31 Piiman Sweet pepper Capscicum annuum L. flesh

32 Retasu Head lettuce Lactuca sativa L. var. L.capitata L. leaf

33 Ryukyuyomogi Field mugwort Artemisia campestris L. leaf

34 Sayaingen Field snap bean Phaseolus vulgaris L. var. humulis Alef. pod

35 Serurii Celery Apium graveolens L. stem

36 Shimaoutaniwatari Bird's nest fern Asplenium nudus young leaf

37 Shimatougarashi ** Pepper Capscicum frutescence L. whole fruit 38 Shishitou Small sweet green pepper Capscicum annuum L. whole fruit

39 Suberihiyu Purslane Portulaca oleracea L. leaf, stalk

40 Suizenjina Gynura Gynura bicolor DC. leaf

41 Shungiku Garland chrysanthemum Chrysanthemumu coronaium L. leaf

42 Tougan Wax gourd Benincasa hispida COGN. flesh

43 Uikyou Fennnel Foeniculum vulugare Mill. leaf

44 Wakegi Green onion Allium fistulosum L. leaf

45 Yaeyamakazura Sweet potato leaf Ipomoea batatas LAM. leaf, stalk *The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa.

** Plants of unknown Japanese names were indicated by the local names used in Okinawa.

Table 1. Vegetables used as experimental materials, obtained from retail stores in Okinawa Prefecture (continued)

Sample No. Japanese name* English name Scientific name Parts used

24 Muji ** Stem of Taro Colocasia esculenta Schott stem

25 Nasu Egg plant Solanum melongena L. whole fruit

26 Nigauri Bitter gourd Momordica charantia L. flesh

27 Nira Chinese chive Allium tuberosum ROTTLER leaf

28 Nishiyomogi Mugwort Artemisia princeps Pamp. leaf

29 Papaya Papaya Carica papaya L. flesh

30 Paseri Parsley Petroselinum crispum Nym. leaf

31 Piiman Sweet pepper Capscicum annuum L. flesh

32 Retasu Head lettuce Lactuca sativa L. var. L.capitata L. leaf

33 Ryukyuyomogi Field mugwort Artemisia campestris L. leaf

34 Sayaingen Field snap bean Phaseolus vulgaris L. var. humulis Alef. pod

35 Serurii Celery Apium graveolens L. stem

36 Shimaoutaniwatari Bird's nest fern Asplenium nudus young leaf

37 Shimatougarashi ** Pepper Capscicum frutescence L. whole fruit 38 Shishitou Small sweet green pepper Capscicum annuum L. whole fruit

39 Suberihiyu Purslane Portulaca oleracea L. leaf, stalk

40 Suizenjina Gynura Gynura bicolor DC. leaf

41 Shungiku Garland chrysanthemum Chrysanthemumu coronaium L. leaf

42 Tougan Wax gourd Benincasa hispida COGN. flesh

43 Uikyou Fennnel Foeniculum vulugare Mill. leaf

44 Wakegi Green onion Allium fistulosum L. leaf

45 Yaeyamakazura Sweet potato leaf Ipomoea batatas LAM. leaf, stalk *The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa.

** Plants of unknown Japanese names were indicated by the local names used in Okinawa.

Table 1. Vegetables used as experimental materials, obtained from retail stores in Okinawa Prefecture (continued)

Sample No. Japanese name* English name Scientific name Parts used

24 Muji ** Stem of Taro Colocasia esculenta Schott stem

25 Nasu Egg plant Solanum melongena L. whole fruit

26 Nigauri Bitter gourd Momordica charantia L. flesh

27 Nira Chinese chive Allium tuberosum ROTTLER leaf

28 Nishiyomogi Mugwort Artemisia princeps Pamp. leaf

29 Papaya Papaya Carica papaya L. flesh

30 Paseri Parsley Petroselinum crispum Nym. leaf

31 Piiman Sweet pepper Capscicum annuum L. flesh

32 Retasu Head lettuce Lactuca sativa L. var. L.capitata L. leaf

33 Ryukyuyomogi Field mugwort Artemisia campestris L. leaf

34 Sayaingen Field snap bean Phaseolus vulgaris L. var. humulis Alef. pod

35 Serurii Celery Apium graveolens L. stem

36 Shimaoutaniwatari Bird's nest fern Asplenium nudus young leaf

37 Shimatougarashi ** Pepper Capscicum frutescence L. whole fruit 38 Shishitou Small sweet green pepper Capscicum annuum L. whole fruit

39 Suberihiyu Purslane Portulaca oleracea L. leaf, stalk

40 Suizenjina Gynura Gynura bicolor DC. leaf

41 Shungiku Garland chrysanthemum Chrysanthemumu coronaium L. leaf

42 Tougan Wax gourd Benincasa hispida COGN. flesh

43 Uikyou Fennnel Foeniculum vulugare Mill. leaf

44 Wakegi Green onion Allium fistulosum L. leaf

45 Yaeyamakazura Sweet potato leaf Ipomoea batatas LAM. leaf, stalk *The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa.

** Plants of unknown Japanese names were indicated by the local names used in Okinawa.

Table 1. Vegetables used as experimental materials, obtained from retail stores in Okinawa Prefecture (continued)

Sample No. Japanese name* English name Scientific name Parts used

24 Muji ** Stem of Taro Colocasia esculenta Schott stem

25 Nasu Egg plant Solanum melongena L. whole fruit

26 Nigauri Bitter gourd Momordica charantia L. flesh

27 Nira Chinese chive Allium tuberosum ROTTLER leaf

28 Nishiyomogi Mugwort Artemisia princeps Pamp. leaf

29 Papaya Papaya Carica papaya L. flesh

30 Paseri Parsley Petroselinum crispum Nym. leaf

31 Piiman Sweet pepper Capscicum annuum L. flesh

32 Retasu Head lettuce Lactuca sativa L. var. L.capitata L. leaf

33 Ryukyuyomogi Field mugwort Artemisia campestris L. leaf

34 Sayaingen Field snap bean Phaseolus vulgaris L. var. humulis Alef. pod

35 Serurii Celery Apium graveolens L. stem

36 Shimaoutaniwatari Bird's nest fern Asplenium nudus young leaf

37 Shimatougarashi ** Pepper Capscicum frutescence L. whole fruit 38 Shishitou Small sweet green pepper Capscicum annuum L. whole fruit

39 Suberihiyu Purslane Portulaca oleracea L. leaf, stalk

40 Suizenjina Gynura Gynura bicolor DC. leaf

41 Shungiku Garland chrysanthemum Chrysanthemumu coronaium L. leaf

42 Tougan Wax gourd Benincasa hispida COGN. flesh

43 Uikyou Fennnel Foeniculum vulugare Mill. leaf

44 Wakegi Green onion Allium fistulosum L. leaf

45 Yaeyamakazura Sweet potato leaf Ipomoea batatas LAM. leaf, stalk *The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa.

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2.2.2. 試料及び試料溶液の調製 試料の沖縄県産野菜 45 品目は,2003 年に沖縄県那覇市 の小売店で入手した(ヒハツモドキのみ民家の庭木より採 取)(Table 2-1).試料の皮や種,茎などの非可食部は除去 し,凍結乾燥した.乾燥物はミルで粉砕して,分析に用い るまで−20˚C で保存した.凍結乾燥試料(生鮮物 1.6 g 相 当量)に 80%エタノール 8 mL を加え,80˚C で 30 分間抽 出した.抽出液は 1600 × g,10 分間の遠心分離を行い,上 清を試料溶液とした. 2.2.3. 総ポリフェノール含量の測定 総ポリフェノール含量はFolin-Denis法14)で測定した. すなわち,蒸留水で適宜希釈した試料溶液 2 mLにフォー リン試薬(タングステン酸ナトリウム 25 g,リンモリブデ ン酸 5 g,リン酸 12.5 mLと蒸留水 188 mLを混合し,2 時 間の環流煮沸後,蒸留水で全量を 1 Lとした)2 mL加えて 3 分後,10%炭酸ナトリウム溶液 2 mLを加えて室温で 1 時 間静置し,700 nmの吸光度を分光光度計(UV-160A,島津 製作所)で測定した.検量線は没食子酸を用いて作成し, 総ポリフェノール含量は生鮮物重量 100 gあたりの没食子 酸相当量として算出した. 2.2.4. 抗酸化能の測定 (1) DPPH ラジカル(DPPH・)消去能 DPPH・消去能は沖ら15) の方法に準じて測定した.すな わち 96 穴マイクロプレートに 80%エタノールで段階的に 希釈した試料溶液,0.2 M MES緩衝液(pH 6.0),20%エタ ノールをそれぞれ 50 µL入れ,0.8 M DPPH溶液 50 µLを加 えて攪拌し,室温で 20 分間放置後,マイクロプレートリ ーダー(Benchmark,日本BioRad)で 540 nmの吸光度を測 定した.標準物質にはα-tocophenolの水溶性同族体である Troloxを用いた.吸光度を縦軸,試料添加量を横軸にグラ フを作成し,吸光度が直線的に変化する範囲で試料添加X µLに対する吸光度の減少量(∆540)を求め,その∆540 に 相当するTrolox量を求めた.DPPH・消去能は,生鮮物 100 g あたりのTrolox相当量(µmol Trolox eq./100 g)として算出 した. (2) スーパーオキサイドラジカル(O2・)消去能 O2−・ 消去能の測定は,XOD/HPX系で発生するO2− をスピントラップ剤DMPOでトラップし,そのスピン アダプトであるDMPO - O2 −・のシグナルを電子スピン 共鳴(ESR)測定装置で計測するスピントラップ法で測 定した16).すなわち,スピッツ型小型試験管に反応混合 液(2 mM HPX : 5.5 mM DTPA : DMPO = 50 : 35 : 15)100 µL, 検体溶液(分析試料,エタノール,100 mMリン酸緩衝液 (pH 7.4)を含有)50 µLを加え,0.4 U/ mL XOD(50 µL) を添加,撹拌して反応を開始した.捜引は,反応液を入れ た扁平水溶液セル(JEOL LC-11 cuvette,日本電子)をESR 装置(JES-RE1X,日本電子)にセットし,XOD添加 60 秒後から開始した(ESR測定条件:マイクロ波出力;8 mW,磁場掃引幅;335.85 mT,磁 場変調;100 kHz,0.1 mT,増幅率;400,応答時間;0.1 秒).DMPO - O2 −・の シグナル強度は装置内部標準Mn2+ のシグナル強度と 比較して求めた.標準物質はSODを用い,SOD無添加 時のシグナル強度の比(DMPO- O2 − / Mn2+)をI0,SOD 添 加時の シ グ ナ ル 強 度 の 比 を Iとし,I0/ I− 1 を 縦 軸 , SOD添 加量(unit/ assay)を 横軸に プロッ トし検 量線 を作成し,傾きを求めた.試料も同様にして,直線性 が維持される範囲で傾きを求め,検量線の傾きとの比 からO2 −・消去能をSOD単位数として算出した.試料抽 出液は 80%エタノールで 5 段階に希釈して測定に用い,活 性は生鮮物 100 g当たりのSOD単位数に換算した. (3) t-BuOO ラジカル (t-BuOO・)消去能 脂質ペルオキシドラジカル消去能は前田ら16)のtert-ブ チルヒドロペルオキシド/へミン/ ルミノール系による t-BuOOラジカル発生系を用いた方法を一部改変して,評 価した.すなわち,試料抽出液 120 µL(80% エタノール で 4 段階に希釈)と混合液 960 µL(6 mM DTPA 120 µL, 12 mM t-BuOOH 120 µL,60 µM luminal 120 µL,phosphate buffered saline(pH 7.3)600 µL)を 24 穴プレートに分注 し,0.6 mg/ mL methemoglobin 120 µLを加えて反応を開始 した.反応液の化学発光は,CCDカメラを装備した分析装 置(type CLA-IMG2,東北電子産業)で測定した.t-BuOO・ 消去能は,α-tocophenolの水溶性同族体であるTroloxを比 較 対 照 に 用 い て , 発光の程度を比較する事で評価した. (4) リノール酸 β - カロテン退色法 リノール酸過酸化物によるβ - カロテンの退色を利用し た津志田ら18)の方法で抗酸化能を測定した.0.1% β - カ ロテン,10% リノール酸,20% ツイーン 40 のクロロホ ルム溶液をそれぞれ 0.5 mL,0.1 mL,1.0 mLずつ三角フラ スコに取り,窒素ガスでクロロホルムを完全に蒸発させた 後,100 mLの蒸留水に溶解させ,リノール酸 - β -カロテ ン溶液とした.次に,調製したリノール酸 - β -カロテン 溶液 45 mLに 4 mLの 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.8)を加え撹拌した後,4.9 mLずつ試験管に分注した. 100 µLの試料溶液を添加後,50℃の反応槽に移し,反応を 開始した.標準溶液として 3(2)-t-ブチル-4-ヒドロキシ アニソール(BHA)の 1 mg/ 100 mL溶液を用いた.抗酸化 能(A)は蒸留水をコントロールとして,反応後 45 分と 15 分の吸光度を用いて次式により算出した.

A = (V45 min – V15 min)/(B45 min – B15 min) ここで,V45 minは試料添加時の反応後 45 分の吸光度,V15 min は試料添加時の反応後 15 分の吸光度,B45 minはBHA 1 mg 添加時の反応後 45 分の吸光度,B15 minはBHA 1 mg添加時 の反応後 15 分の吸光度とした.

(8)

2.3.1. 沖縄県産野菜の総ポリフェノール含量 Table 2-2 に,供試した 45 品目のポリフェノール含量を示 した.ポリフェノール含量の平均値は 141.8 mg/ 100 g 生鮮 物であった.45 品目中,最も含量が多かったのはニシヨ モギ(786.3 ± 12.6 mg/ 100 g 生鮮物)であり,最も少なか ったトウガン(5.8 ± 0.3 mg/ 100 g 生鮮物)と比較すると約 135 倍の値であった.この結果から,ポリフェノール含量 は品目により非常に広い範囲の分布を示すことが明らか になった.興味深いことに,ポリフェノール含量が平均値 以上の野菜 11 品目のうち,8 品目(ニシヨモギ,リュウ キュウヨモギ,ホソバワダン,エンサイ,ヤエヤマカズラ, ボタンボウフウ,スイゼンジナ,ウイキョウ)は沖縄で伝 統的に食べられている野菜であった.

Table 2-2. Polyphenol contents and antioxidant activities of vegetables from Okinawa prefectu

Japanese name* Nishiyomogi 786.3 ± 12.6 4390.3 ± 434.5 Ryukyuyomogi 590.0 ± 40.0 2754.0 ± 263.5 Aojiso 563.9 ± 3.6 4943.3 ± 448.6 Moroheiya 511.4 ± 11.5 1804.8 ± 70.3 Hosobawadan 407.8 ± 4.2 1847.6 ± 265.5 Bajiru 399.1 ± 56.6 2230.6 ± 653.2 Ensai 349.1 ± 18.4 1085.9 ± 62.9 Yaeyamakazura 295.4 ± 17.4 1036.4 ± 63.4 Suizenjina 263.9 ± 11.7 1016.3 ± 16.5 Botanbouhuu 245.5 ± 18.7 904.5 ± 116.8 Uikyou 171.7 ± 1.9 1068.0 ± 28.9 Hihatsumodoki 132.1 ± 6.2 736.1 ± 37.7 Shimatougarashi 125.9 ± 2.0 800.1 ± 3.3 Shishitou 101.5 ± 1.5 525.7 ± 44.8 Akapiiman 100.5 ± 3.6 846.7 ± 80.8 Burokkori 93.3 ± 4.8 346.7 ± 23.5 Mitsuba 88.1 ± 4.1 415.6 ± 22.0 Muji 87.1 ± 6.6 343.9 ± 14.9 Kureson 83.9 ± 5.0 424.9 ± 44.9 Nasu 80.5 ± 7.2 403.4 ± 1.2 Hourensou 74.1 ± 10.4 149.6 ± 15.2 Shungiku 67.1 ± 10.7 335.0 ± 89.3 Piiman 65.9 ± 8.3 146.9 ± 15.5 Shimaoutaniwatari 55.0 ± 0.7 177.6 ± 7.7 Nira 52.8 ± 2.5 176.9 ± 11.9 Asuparagasu 51.0 ± 2.2 164.2 ± 11.9 Kuwansou 48.0 ± 7.9 164.3 ± 4.7 Suberihiyu 47.5 ± 6.2 784.0 ± 83.8 Hadaikon 45.5 ± 3.8 160.1 ± 25.3 Maruokura 43.9 ± 10.2 533.3 ± 124.7 Paseri 43.2 ± 1.1 353.9 ± 28.6 Sayaingen 42.9 ± 1.4 205.9 ± 13.5 Nigauri 38.1 ± 1.4 63.9 ± 12.2 Karashina 35.9 ± 2.8 174.7 ± 8.1 Komatsuna 30.4 ± 6.8 137.3 ± 11.6 Kyabetsu 27.9 ± 5.5 98.9 ± 1.9 Retasu 27.6 ± 8.6 81.9 ± 1.0 Wakegi 21.7 ± 1.1 88.9 ± 6.2 Papaya 19.5 ± 3.5 63.4 ± 9.2 Kyuuri 16.5 ± 1.6 36.5 ± 5.2 Serurii 14.3 ± 2.4 15.5 ± 6.8 Akageuri 13.1 ± 0.5 29.9 ± 2.7 Hechima 7.9 ± 1.0 49.7 ± 52.9 Makomo 7.8 ± 0.6 19.7 ± 0.6 Tougan 5.8 ± 0.3 96.2 ± 3.5 Average value of 45 vegetables 141.8 716.3

*The underline denotes vegetables which are traditionally eaten in Okinawa. Each value represents the mean ± SD (n=3).

(mg-gallic acid eq./100 g f. wt.)

DPPH・ scavenging activity (µ mol-Trolox eq./100 g f. wt.) Polyphenol content

(9)

-10

20

30

40

50

-

200

400

600

800

polyphenol content

(mg-gallic acid eq./100g f.wt.)

DP

P

H

・ s

cave

n

gi

n

g

ac

ti

vt

y

mol

-T

rol

ox e

q

./

100g f

.w

t

)

Ryukyuyomogi

R = 0.9287

Nishiyomogi

Hosobawadan

Ensai

Yaeyamakazura

Suizenjina

Botanbouhuu

Uikyou

0

0

Fig. 2-1. Correlation between polyphenol contents and DPPH・scavenging activites of vegetables from Okinawa prefecture

2.3.2. 沖縄県産野菜の抗酸化能 (1) DPPH ラジカル(DPPH・)消去能 Table 2-2 に,供試した 45 品目の野菜のDPPH・消去能を 示した.DPPHは濃い紫色を呈した安定したフリーラジカ ルであり,517nmに特異的な吸収を持つ。DPPHは,ラジ カル消去物質が存在すると非ラジカル体に変化し,517nm の吸収が減少,退色する.DPPHの色の変化を利用した分 光測定法は,抗酸化能の簡単な指標として良く用いられて いる19,20).DPPH・消去能とポリフェノール含量は相関す ることが報告されており20,21),本研究で高ポリフェノー ル含量を示した野菜(ニシヨモギ,リュウキュウヨモギ, ホソバワダン,エンサイ,ヤエヤマカズラ,ボタンボウフ ウ,スイゼンジナ,ウイキョウ)も,DPPH・消去能は強か った. そこで,供試した沖縄の野菜 45 品目の DPPH・消去能と ポリフェノール含量の相関を調べた結果,高い相関(R = 0.9287)が確認され,沖縄の野菜の DPPH・消去能にはポリ フェノールが関与していることが推察された(Fig. 2-1). 特に,ポリフェノール含量が平均値以上だった伝統野菜 8 品目に限れば,DPPH・消去能とポリフェノール含量の相関 係数は R=0.9672 であり,ポリフェノールが抗酸化能の寄 与成分として,大きく影響していることが推察された. (2) スーパーオキサイドラジカル(O2・)消去能 Fig. 2-2 に示すように,O2−・は生体内のミトコンドリア電 子伝達系やミクロソーム電子伝達系などでO2から生成さ れる最初の活性酸素種であり,O2 −・を起点として速やか に他の活性酸素種(OH・,H2O2, 1 O2,ROO・)が生成され ていく12).さらにO 2 −・は生体にとって重要な働き(血管 平滑筋弛緩作用など)を有する一酸化窒素(NO)とも反 応してNOの作用を消滅させる.次式に示すように,O2 − とNOの反応はNOを失活するだけではなく,毒性の強いペ ルオキシナイトライト(ONOO−)を生じることから,O 2 − の過剰な産生を抑えることは生体にとって重要な意味を 持つ12,13) . NO・ + O2−・ → ONOO−+ H+ 本研究において,高ポリフェノール含量の沖縄伝統野菜 8 品目は,いずれもO2−・消去能を示した.特に最もポリフ ェノール含量の多かったニシヨモギの活性が最も強く,次 いでホソバワダン,ヤエヤマカズラ,リュウキュウヨモギ などが強い活性を示した(Fig. 2-3). (3) t-BuOO ラジカル(t-BuOO・)消去能 脂質ペルオキシドラジカル(LOO・)は,過酸化脂質 (LOOH)とヘム鉄などとの反応から生じるラジカルであ る(Fig. 2-4).LOO・は他のラジカル類と比較すると反応 性は弱いが寿命は長く,DNAの損傷や発癌促進作用を有 することが報告されている12,13).したがってLOO・の消去 物質は,LOO・由来の発癌促進作用に対し防御的に働くこ とが期待される.

(10)

水溶性のt-BuOOHとヘモグロビン(Hb3+)を緩衝液中で 反応させると次式のように,t-BuOO・とHb4+ が生成される. t-BuOO・とアミノフタール酸(Luminol)を共存させると アミノフタール酸は励起状態のアミノフタール酸・ジアニ オンとなり,基底状態(アミノフタール酸)に戻る際に光 を発する.本測定法はこの現象を利用し た LOO・消去能の測定法であり,視覚的に抗酸化能を確認 できる.

2 t-BuOOH + Hb3+ → t-BuOO・ + t-BuOH + Hb4+ (=O) t-BuOO・+アミノフタール酸 (Luminol) →アミノフタール酸・ジアニオン(励起状 態) →アミノフタール酸(基底状態)+ 光 Furuta et al.22) は,21 品目のサツマイモで,ポリフェノ ール含量の多いものほどt-BuOO・消去能が強くなること を明らかにしている.本研究で沖縄伝統野菜 8 品目の t-BuOO・消去能を調べた結果,いずれも用量依存的に活性 を示した(Fig. 2-5).特にポリフェノール含量の多いニシ ヨモギ,リュウキュウヨモギ,ホソバワダンなどが強い活 性を示した.これらの野菜についてもポリフェノールが t-BuOO・消去能の寄与成分として大きく影響しているこ とが推察された. (4) リノール酸 β-カロテン退色法 リノール酸β-カロテン退色法は,リノール酸の自動酸化 で生じるLOOHと,β-カロテンの二重結合の反応によって, β-カロテンが退色するのを利用した測定法である.津志田 らは本測定法で測定した野菜の抗酸化能がポリフェノー ル含量と高い相関を示すことを明らかにしている18) . 高ポリフェノール含量だった沖縄伝統野菜の 8 品目(ニ シヨモギ,リュウキュウヨモギ,ホソバワダン,エンサイ, ヤエヤマカズラ,ボタンボウフウ,スイゼンジナ,ウイキ ョウ)をリノール酸β-カロテン退色法で調べた結果,標準 物質として用いた合成抗酸化剤 BHA と比較して,いずれ も強い抗酸化能を示した(Fig. 2-6). この結果と前述した 2.3.2.(3) の結果から,8 品目の野菜 は脂質の酸化を防ぎ,連鎖的に進行する脂質過酸化反応 (自動酸化)を抑制していることが明らかになった.

HOO・

hydroperoxyl radical

transition metal (Fe2+, Cu+) 3

O

2

triplet oxygen(oxygen in the air)

O

2

superoxide

1

O

2

singlet oxygen

H

2

O

2

hydrogen peroxide

H

2

O

radial ray ultraviolet ray

superoxide dismutase

HO・

hydroxyl radical

catalase

photosensitizing reaction (porphyrin)

HOO・

hydroperoxyl radical

transition metal (Fe2+, Cu+) 3

O

2

triplet oxygen(oxygen in the air)

O

2

superoxide

1

O

2

singlet oxygen

H

2

O

2

hydrogen peroxide

H

2

O

radial ray ultraviolet ray

superoxide dismutase

HO・

hydroxyl radical

catalase

photosensitizing reaction (porphyrin)

(11)

O

2

・ scavenging activity

( SOD units/100g fresh wt.)

0

1000

2000

3000

4000

Nishiyomogi

Ryukyuyomogi

Hosobawadan

Yaeyamakazura

Suizenjina

Ensai

Botanbouhuu

Uikyou

Fig. 2-3. Superoxide radical scavenging activity of Okinawan traditional vegetables

LH

lipid

LOOH

lipid peroxide

LOO・

lipid peroxyl radical

L・

lipid radical

LH

lipid

O

2

oxygen

free radical

LH

lipid

LOOH

lipid peroxide

LOO・

lipid peroxyl radical

L・

lipid radical

LH

lipid

O

2

oxygen

free radical

(12)

Sample (µl/assay)

Sample (µl/assay)

0.1 0.2 0.5 12.0

0.1

0.2

0.5 12.0

Botanbouhuu

Ensai

Suizenjina

Uikyou

Hosobawadan

Yaeyamakazura

Nishiyomogi

Ryukyuyomogi

Trolox

Trolox

0

4

8

16

0

4

8

16

100 µM Trolox (µl/assay)

100 µM Trolox (µl/assay)

Fig. 2-5. t-BuOO・ scavenging activity of Okinawan traditional vegetables

3.73

1.00

0.21

0.14

0.25

0.22

0.28

0.20

0.30

0.26

-

1

2

3

4

Control

BHA

Nishiyomogi

Ryukyuyomogi

Hosobawadan

Yaeyamakazura

Suizenjina

Ensai

Botanbouhuu

Uikyou

Antioxidant activty (A)

0

Fig. 2-6. Antioxidant activity by β-caroten discoloration method of Okinawan traditional vegetables

A = (V45min – V15min)/(B45min – B15min), where V45min = absorbance at 45 min, with vegetable extract or control; V15min =

absorbance at 15 min, with vegetable extract or control; B45min = absorbance at 45 min, with BHA; B15min = absorbance at 15

(13)

2.4. 小括 沖縄県は国内でも高脂肪摂取地域であるが,動脈硬化に 起因する疾患での死亡は少ないという相反する現象が見 られる.この要因として,沖縄の伝統的な食スタイルの影 響が考えられる.沖縄県は他府県と比較して緑黄色野菜や 薬草を多く摂取しており,これらの食材がポリフェノール などの生理活性成分を含み,動脈硬化などの疾患に予防的 に作用していたことも予想される.そこで本章では,沖縄 で利用されている野菜 45 品目のポリフェノール含量及び DPPH・消去能を調べた.さらに,高ポリフェノール含量で 強いDPPH・消去能を示した野菜は,O2 −・,t-BuOO・消去能 などin vitroの実験系により,詳細に抗酸化能を調べた. 対象とした野菜 45 品目中、沖縄の伝統野菜であるニシ ヨモギ,リュウキュウヨモギ,ホソバワダン,エンサイ, ヤエヤマカズラ,ボタンボウフウ,スイゼンジナ,ウイキ ョウは,特に高ポリフェノールで強いDPPH・消去能を有す ることが明らかになった.これら 8 品目の野菜は,O2 − 消 去 能 を 有 し て お り , リ ノ ー ル 酸 の 自 動 酸 化 や t-BuOOHを 用 い た 測 定 法 で も 強 い 抗 酸 化 能 を 示 し た . また,ポリフェノール含量と抗酸化能の強さはいずれも相 関する傾向を示した. 以上の結果から,高ポリフェノール含量の沖縄伝統野菜 8 品目は,O2−・などのフリーラジカルを消去するととも に,脂質の自動酸化を抑制することで,総合的に高い抗酸 化能を発揮することが予想された. 第 3 章 ホソバワダンのポリフェノール 3.1. 緒言 沖縄では苦いものほど滋養になるという考え方から,ニ シヨモギやホソバワダンなど薬草としても用いられる野 菜を日常の食事の中で頻繁に利用している.このような医 食同源的な考え方を基本とする沖縄の伝統的な食スタイ ル,食材は長寿の要因のひとつであったと考えられ23) ,沖 縄の食材が注目されている.本研究では,第 2 章において, ニシヨモギやホソバワダンなど沖縄伝統野菜 8 品目が高 ポリフェノール含量で強い抗酸化能を有することを明ら かにした.これらの野菜は強い抗酸化能を有するポリフェ ノールを含んでいることが期待される. そのうちの一つであるホソバワダン(Crepidiastrum lanceolatum)は,西日本の広い範囲に分布するキク科アゼ トウナ属の多年生草本で,海岸の岩場などに自生している 野草だが.沖縄では栽培されたものが小売店などで販売さ れており,比較的容易に入手できる伝統野菜である24(Fig. ) 3-1).沖縄では独特の苦みを呈することからニガナと呼ば れ,白和えやイカ墨汁の具材として古くから食されており 25),食用以外にも,風邪をひいた際の解熱を始め,アメ ーバ赤痢,大腸カタール,リンパ腺腫,健胃・整胃作用, 回虫駆除,心臓病,高血圧などに効果がある薬草として伝 統的に利用されている植物である26,27,28).第 2 章で明ら かになった科学的知見と合わせて,伝承されている効能か らも,ホソバワダンは単なる野菜としてだけではなく,有 用な生理活性物質を含んだ植物であることが十分に期待 される. 第 2 章で着目した 8 品目のうち,ホソバワダン以外の野菜 については含有する抗酸化成分について幾つかの報告が ある29-33).しかしながら,ホソバワダンについては科学 的知見自体が非常に少なく,その情報24,34-37)も断片的で, 抗酸化成分を特定した報告は見当たらない. そこで,本章ではホソバワダンに含まれる抗酸化成分を 明らかにすることを目的として,実験を行った.まず,ホ ソバワダン抽出液を調製し,HPLCでポリフェノール組成 のパターンを他の野菜と比較した.さらに抗酸化性を有す るポリフェノール成分を単離し,1 H-NMR, 13C-NMR,MS スペクトル分析により,構造を解析した.

(14)

(Wild Hosobawadan) (Cultivated hosobawadan) Japanese name : Hosobawadan

Scientific name : Crepidiastrum lanceolatum Nakai

Hosobawadan is used as an edible plant and as a folk medicine for colds, diarrhea, arteriosclerosis, and hypertension and for treatment of gastrointestinal diseases in Okinawa, where it is known by the local name of "Nigana" or "Njana". Fig. 3-1. Profile of Hosobawadan

3.2. 実験方法 3.2.1. 試薬

caffeic acid(CA),chlorogenic acid(ChgA)は和光純薬 工業(株)から購入した.

3,4-O-dicaffeoylquinic acid(3,4-diCQA),4,

5-O-dicaffeoylquinic acid(4,5-diCQA),3,5-O-dicaffeoylquinic acid(3,5-diCQA),3,4,5-O-tricaffeoylquinic acid

(3,4,5-triCQA)は独立行政法人農業技術機構九州沖縄農 業研究センターから譲与していただいた.その他の試薬は, 市販の特級試薬を使用した. 3.2.2. 沖縄県産野菜のポリフェノール分布パターンの比 ホソバワダンのポリフェノール分布パターンを,HPLC (LC-10A,島津製作所)を用いて他の数品目の野菜と比 較,検討した.HPLC 分析用試料は,第 2 章の 2.2.2.で調 製した試料溶液を適宜希釈後,0.45 µm メンブレンフィル ターで濾過して用いた.HPLC は次の条件で分析した.カ ラム;Wakosil II 5C 18RS(250 × 4.6 mm i.d.,和光純薬工 業(株)),移動相;A)0.1%ギ酸及び B)0.1%ギ酸/ メタ ノール,グラジェント条件;5→100% B(0∼30 min,リニ アグラジェント),流速;1 mL/ min,カラム温度;40˚C, 検出波長;330 nm.各成分は標準物質の溶出時間と UV ス ペクトルとの一致で同定した.標準物質は CA,ChgA, 3,4-diCQA,4, 5-diCQA,3,5-diCQA,3,4,5-triCQA を用い た. 3.2.3. ホソバワダンポリフェノールの分離・同定 (1) ホソバワダン抽出液の調製 試料のホソバワダンは,2004 年 1 月に沖縄県那覇市の 小売店で入手した.試料の非可食部は除去し凍結乾燥した. 乾燥物はミルで粉砕して,実験に用いるまで−20˚C で保存 した.凍結乾燥試料(生鮮物 1 Kg 相当量)に 50%エタノ ール 8 L を加え,80˚C で 30 分間抽出した.抽出液は吸引 濾過し,濾液をホソバワダンポリフェノールの分離に用い た. (2) ホソバワダンポリフェノールの分離・精製 ホソバワダンポリフェノールの分離・精製は,DPPH・ 消去能(2.2.4. (1))を指標とし,津志田らの方法18) 準じて行った.ホソバワダン抽出液をロータリーエバポレ ーターで濃縮乾固後,蒸留水 1 Lに溶かし,ヘキサンで洗 浄した.ヘキサン洗浄後の水相を濃縮乾固後,適当量の 0.2%ギ酸に溶解した粗抽出物をToyoPearl HW - 40F (TOSHO)を充填したカラム(50 × 4 cm i.d.)に吸着させ た後,100%までメタノール濃度を増加させる濃度勾配溶 出を行った.分画した画分の 280,330 nmにおける吸光度 を測定し,ピークが検出された画分を回収した.回収した 画分は濃縮後,HPLCでさらに分画した.HPLCは,カラ ムにShimadzu-Shimpack PRC-ODS(250 × 20 mm i.d.)(島 津製作所)を使用し,0.2%ギ酸とメタノールの混合による 5∼100% メタノール濃度勾配による溶出で行い,330 nm で検出される成分を回収した.HPLCによる精製を繰り返 し,抗酸化成分を精製した.

(15)

(3) ホソバワダンポリフェノールの LC/MS 及び NMR 分析 ホソバワダンから精製した成分はLC/MS装置(JNM-400, 日本電子)を用いたMSスペクトル分析と,NMR装置 (JMS-700,日本電子)を用いた1 H-NMR及び13C-NMRス ペクトル分析により構造を解析した.比旋光度はDIP-180 digital polarimeter(日本分光)で測定した. 3.3. 結果及び考察 3.3.1. 沖縄県野菜のポリフェノール分布パターンの比較 第 2 章で,ニシヨモギ,リュウキュウヨモギ,ホソバワ ダン,ヤエヤマカズラ,エンサイなどは高ポリフェノール で抗酸化能も強いことを明らかにした.これらの野菜のう ち,ニシヨモギについては,市場ら32) によって 3,5-diCQA と 3,4-diCQAなどが主要なポリフェノールであることが報 告されている.リュウキュウヨモギにはChgA類縁体や Quercetin配糖体などが含まれている30).ヤエヤマカズラ は沖縄で生食用とされている甘藷葉であるが,甘藷葉から はChgAと 3,4-diCQA,,3,5-diCQA,4,5-diCQA,3,4,5-triCQA が抗酸化成分として単離されている33).また,甘藷葉と 同様にヒルガオ科の植物であるエンサイについても, ChgAと 3,4-diCQA,3,5-diCQA,4,5-diCQA,3,4,5-triCQA が抗酸化成分として単離されている31).ボタンボウフウ についてはChgAとneoChgAが含まれていることが明らか にされている29) .このように高等植物の多くにはChgA などのCA誘導体が含まれている事が多く,本研 究でポリフェノールを多く含むことが確認された沖縄伝 統野菜からも CA 誘導体が多く確認されている.しかしな がらホソバワダンのポリフェノールについては,これまで 報告がない. そこで,HPLC 分析を行い,ホソバワダンのポリフェノ ール分布パターンを主要な成分が確認されている野菜と 比較した結果,ホソバワダンはニシヨモギやヤエヤマカズ ラと比較的類似したパターンのクロマトグラムを示し,複 数のピークが検出された(Fig. 3-3).ピーク 1 とピーク 2 は,標準物質と比較した結果,それぞれ ChgA と CA と推 察された.しかしながら,主要なピーク 4 の溶出時間は, ニシヨモギやヤエヤマカズラの主要なポリフェノールで ある 3,5-diCQA と近似しているが完全には一致しなかっ た.また 3,4,5-triCQA とも一致しなかった.さらにホソバ ワダンからは未同定ピーク 5,6 が検出された.これらの 結果から,ホソバワダンには ChgA と CA と推察される成 分以外に,他の沖縄野菜にも含まれていないポリフェノー ルが複数含まれていることが明らかになった. 3.3.2. ホソバワダンポリフェノールの同定 3.3.1.で,ホソバワダンはChgAとCAと推察される成分及び 未知のポリフェノールを複数含んでいることが明らかに なった.そこで,ホソバワダン抽出液から抗酸化成分の単 離・精製作業を行った結果,5 成分を単離した(Fig. 3-3). 得られた 5 つの成分は,文献値38-42)1 H 及び13C NMR, MS,UVスペクトルを比較して同定した.Compound 1 と 2 については,HPLCの溶出時間とUV及びMSスペクトルの 一致から,それぞれChgA,CAと同定した(Fig. 3-4). Compound 3 はFig. 3-2 で示したHPLCクロマトグラムのピ ーク 4 の成分であり,chicoric acid(ChA)と同定した. ChAは分子内に酒石酸を有するため,Fig. 3-5 に示すよう に,D体,L体,Meso体の 3 種類の立体異性体が存在する43) .そこで,ホソバワダンから単離したChAの立体配置を決 定するため,比旋光度を測定した結果,[α] 24 D +321(c = 1.30,メタノール)であった.文献値39)([α] 22D +340(c = 1.08,メタノール))との比較により,ホソバワダンに含 まれるChAはD(+)-chicoric acidであることが明らかにな った(Fig. 3-4).同じキク科のニシヨモギだけでなく,ヤ エヤマカズラやボタンボウフウなど他の沖縄野菜に含ま れる主要なポリフェノールは,ChgAや 3,5-diCQAなどの CAとキナ酸のエステル化合物である29-33) .ホソバワダン がCAと酒石酸のエステル化合物であるChAを含んでいる ことは,他の沖縄伝統野菜と比較すると特徴的なことであ ると考えられる.また,Compound 4 と 5 は,Fig. 3-2 で示 したピーク 5 と 6 の成分であり,文献値41-42)と各スペク ト ル を 比 較 し た 結 果 , そ れ ぞ れ luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside ( LU-glc ) , luteolin 7-O-β-D-glucuronide(LU-gluc)と同定した(Fig. 3-6)

得られた単離物質の各種スペクトルデータは次のとお りであった.

Compound 2, chlorogenic acid(5-caffeoyl quinic acid):

白色粉末; UV(80%エタノール)λmax 327 nm; ESI-MS (negative)m/z 353 [M - H]− ; 1H NMR(CD3OD, 500 MHz) δ7.41(1H, d, J = 15.9 Hz, H-7'), 7.03(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 6.98(2H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-6'), 6.76(1H, d, J = 8.1 Hz, H-5'), 6.14(1H, d, J = 15.9 Hz, H-8'), 5.06(1H, d, J = 18.0 Hz, H-3), 3.92(1H, dd, J = 3.5, 7.0 Hz, H-5); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz)δ175.0(C-7), 165.8(C-9), 148.4 (C-4'), 145.7(C-7'), 145.0(C-3'), 125.7(C-1'), 121.5 (C-6'), 115.8(C-5'), 114.8(C-2'), 114.3(C-8'), 73.5 (C-1), 70.9(C-4), 70.4(C-3), 68.2(C-5), 37.3(C-6), 36.3(C-2)

Compound 3, D(+)-chicoric acid(di-E-caffeoyl-(2S, 3S) -(+)-tartaric acid): 白色粉末; UV(80%エタノール)λmax 331 nm; ESI-MS (negative) m/z 473 [M - H]− ; 1H NMR(CD3OD, 500 MHz) δ 7.67(2H, d, J = 15.7 Hz, H-7', H-7''), 7.11(2H, d, J = 2.0 Hz, H-2', H-2''), 7.01(2H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz, H-6', H-6''), 6.82(2H, d, J = 8.1 Hz, H-5', 5''), 6.39(2H, d, J = 15.9 Hz, H-8', 8''), 5.86(2H, s, H-2, H-3); 13C NMR(CD3OD, 125 MHz)δ 169.4(C-1, 4), 167.5(C-9', 9''), 149.8(C-4', 4''), 148.5(C-7', 7''), 146.6 (C-3', 3''), 127.3(C-1', 1"), 123.4 (C-6', 6''), 116.6(C-5', 5''), 115.2(C-2', 2''), 113.5 (C-8',

(16)

8''), 72.3(C-2, 3); [α]24D +321(c = 1.30, メタノール)

Compound 4, luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside:

黄色粉末; UV(80%エタノール)λmax 350 nm; APCI-MS (negative)m/z 447 [M - H]− ; 1H NMR(DMSO-d6, 500 MHz) δ 7.44(1H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-6'), 7.41(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 6.90(1H, d, J = 8.2 Hz, H-5'), 6.78(1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.74(1H, s, H-3), 6.43(1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.07 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1"), 3.43-3.16(4H, m, H-2", 3", 4", 5"); 13C NMR(DMSO-d6, 125 MHz)δ 181.9(C-4), 164.5 (C-2), 162.9(C-7), 161.1(C-5), 156.9 (C-9), 150.0 (C-4'), 145.8(C-3'), 121.3(C-1'), 119.1(C-6'), 116.0 (C-5'), 113.6(C-2'), 105.3(C-10), 103.2(C-3), 99.9 (C-1'"), 99.9(C-6), 94.7(C-8), 77.2(C-5'"), 76.4(C-3'"), 73.1(C-2'"), 69.5(C-4'"), 60.6 (C-6'")

Compound 5, luteolin 7-O-β-D-glucuronide:

Yellow powder; UV(80%エタノール)λmax 350 nm; APCI-MS(negative)m/z 461 [M - H]−; 1H NMR(DMSO-d6, 500 MHz)δ 7.44(1H, dd, J = 8.4, 2.3 Hz, H-6'), 7.41(1H, d, J = 2.1 Hz, H-2'), 6.90(1H, d, J = 8.2 Hz, H-5'), 6.81(1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.72(1H, s, H-3), 6.45(1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 5.27(1H, d, J = 7.3 Hz, H-1"), 4.03(1H, d, J = 9.5 Hz, H-5"), 3.41-3.27(3H, m, H-2", 3", 4"); 13C NMR(DMSO-d6, 125 MHz)δ 181.9(C-4), 164.6(C-2), 162.5(C-7), 161.2 (C-5), 157.1(C-9), 150.0(C-4'), 145.8(C-3'), 121.4 (C-1'), 119.2(C-6'), 116.0(C-5'), 121.4(C-2'), 105.5 (C-10), 103.2(C-3), 99.4(C-1'"), 99.4(C-6), 94.6(C-8), 75.4(C-5'"), 75.7(C-3'"), 72.8(C-2'"), 71.3(C-4'"), 70.3 (C-6'").

10

15

20

25

1

1

1

3

2

3

4

2

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6

Retention time (min)

A

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1

1

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2

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Retention time (min)

A

B

C

Fig. 3-2. HPLC chromatogram of 80% EtOH extract (A, Yaeyamakazura; B, Nishiyomogi; and C, Hosobawadan) Peak 1, chlorogenic acid; peak 2, caffeic acid; peak 3, isochlorogenic acid; and peaks 4, 5, and 6, unknown. 3.4. 小括 第 2 章で,ニシヨモギやホソバワダンなど沖縄の伝統野 菜 8 品目はポリフェノール含量が高く,強い抗酸化能を有 することを明らかにした.その中の一つホソバワダンは, 沖縄では独特の苦みを呈することからニガナと呼ばれ,食 素材や薬草として伝統的に利用されてきた植物である.第 2 章で明らかになった科学的知見と合わせて,伝承されて いる効能からも,ホソバワダンは単なる野菜としてだけで

(17)

はなく,有用な生理活性物質を多く含んでいることが期待 される.そこで,本章ではまず,ホソバワダンに含まれる 抗酸化成分を明らかにすることを目的として,ホソバワダ ン抽出液のポリフェノール組成のパターンをHPLCで分析 し,他の野菜と比較した.さらに,ホソバワダン抽出液か らポリフェノールを単離し,1 H-NMR,13C-NMR,MSスペ クトル分析により構造を解析した. ホソバワダンのポリフェノール分布パターンを主要な 成分が確認されている野菜と比較した結果,ホソバワダン にはchlorogenic acid(ChgA)とcaffeic acid(CA)と推定さ れる成分以外に,他の高ポリフェノールの沖縄伝統野菜に は含まれていないポリフェノールも複数含まれているこ とが推察された.そこで,ホソバワダンからポリフェノー ルを単離した結果,5 つの成分を得た. 1 H-NMR,13C-NMR, MSスペクトル分析によって,得られた成分はCA,ChgA,

D(+)-chicoric acid(ChA),luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside, luteolin 7-O-β-D-glucuronideであることが明らかになった. 同じキク科のニシヨモギだけでなく,ヤエヤマカズラや ボタンボウフウなど他の沖縄野菜に含まれる主要なポリ フェノールは ChgA や 3,5-diCQA のように CA とキナ酸の エステル化合物であるが,ホソバワダンは CA と酒石酸の エステル化合物である ChA を多く含む特徴を有すること が示唆された.

Dry leaf powder of Hosobawadan (1000 g fresh weight eq.)

50% EtOH extraction (80℃, 30 min)

Crude extract

partitioned with n -hexane/water

n -Hexane layer

Water layer

concentration

dissolved in 0.2% formic acid

Toyopearl HW40F column chromatography

0.2% formic acid/MeOH, 100%/0% to 0 %/100 % gradient

Fraction 1

Fraction 2

Fraction 3

Fraction 4

HPLC (Shim-pack PRC-ODS)

HPLC (Shim-pack PRC-ODS)

Compound 1 (32.6 mg)

Compound 2 (130.3 mg)

Compound 3 (0.5 mg)

Compound 4 (11.0 mg)

Compound 5 (23.5 mg)

Table 2-2.  Polyphenol contents and antioxidant activities of vegetables from Okinawa prefectu
Fig. 2-1. Correlation between polyphenol contents and DPPH・scavenging activites of vegetables from Okinawa prefecture
Fig. 2-2. Generation of active oxygen in vivo 12)
Fig. 2-4. Lipid peroxidation by free radical chain reaction 12)
+7

参照

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