Studies on the prediction of
transpoter-mediated drug-drug interaction
in intestinal drug absorption
March, 2015
Akiko Mizuno-Yasuhira
略語
α-GI ：α-glucosidase inhibitor AIC ： Akaike information criterion AUC ： area under the curve
CL ： total clearance
Cma x ： maximum concentration
CV ： coefficient of variation DDI ： drug-drug interaction Fa ： fraction absorbed value
FDA ： U.S. Food and Drug Administration Fg ： intestinal availability
Fh ： hepatic availability FPE ： first pass effects
HPLC ： high-performance liquid chromatography
[I2] ： concentration of inhibitor in the gastrointestinal tract based on
highest approved dose dissolved in 250 mL IC5 0 ： 50% inhibitory concentration
IS ： internal standard
k1 2 ： rate constant for compartment 1 to 2
k2 1 ： rate constant for compartment 2 to 1
Ka ： absorption rate constant
LC-MS/MS ： liquid chromatography/tandem mass spectrometry LLOQ ： lower limit of quantification
M&S ： modeling and simulation Pe ff ： effective permeability
PD ： pharmacodynamics PK ： pharmacokinetics PPT ： protein precipitation Qh ： hepatic blood flow QC ： quality control RE ： relative error S.D. ： standard deviation
S/N ： signal/noise
SPE ： solid phase extraction t1 / 2 ： terminal half-life
TAIC ： time spent above a value 10-fold higher than the IC5 0 value
Tma x ： time for Cma x
TP ： transporter
て 重 要 で あ る た め 、新 薬 の 開 発 に お い て 必 須 の 検 討 項 目 に な っ て い る 。通 常 、in
vitro 試 験 の 結 果 か ら DDI 発 現 リ ス ク が 想 定 さ れ る 場 合 に 、臨 床 DDI 試 験 を 実 施
す る が 、こ れ に は 多 大 な コ ス ト や 時 間 な ど が か か る た め 、リ ソ ー ス 削 減 が 可 能 な 信 頼 性 の 高 い 代 替 評 価 法 の 開 発 が 望 ま れ る 。
ル を 適 用 し た DDI ポ テ ン シ ャ ル 予 測 法 を 構 築 す る こ と に し た 。
第 1 章 生体試料中単糖類の LC-MS/MS 分析に向けたクリーン
アップ法の構築
一 般 的 な 単 糖 類 の 分 析 法 と し て 、HPLC に よ る 示 唆 屈 折 率 検 出 法 1 3 )、蛍 光 検 出 法 1 4 )、電 気 化 学 検 出 法 1 5 ) な ど が 知 ら れ て い る 。示 唆 屈 折 率 検 出 法 は 、測 定 対 象 物 と 移 動 相 に 屈 折 率 の 差 が あ れ ば 検 出 で き る 汎 用 検 出 法 で あ り 、糖 類 の 分 析 に は 広 く 用 い ら れ て い る も の の 、検 出 の 選 択 性 は 低 い 。さ ら に 分 配 法 で の 分 離 の 場 合 、 移 動 相 の 平 衡 状 態 が 僅 か な 温 度 変 化 に よ っ て 変 化 し 、ベ ー ス ラ イ ン に う ね り が 生 じ る た め 、高 感 度 測 定 は 困 難 で あ る 。蛍 光 検 出 法 は 、選 択 性 や 感 度 で 優 れ て い る も の の 、分 析 対 象 物 質 が 蛍 光 性 で あ る こ と が 必 要 で あ る 。電 気 化 学 検 出 法 は 、高 感 度 な 検 出 法 で あ る が 、反 応 液 を 強 ア ル カ リ に 保 つ 必 要 が あ り 、ま た 、検 出 の 選 択 性 は 高 く な い た め 、夾 雑 物 質 と の 分 離 が 難 し い 。血 漿 中 の 単 糖 類 の 測 定 用 と し て は 、 酵 素 法 を 採 用 し た assay kit1 9 ) や assay device2 0 ) な ど も 開 発 さ れ て い る が 、選 択 性 に 乏 し く 、 ng/mL レ ベ ル の 測 定 は 不 可 能 で あ り 、 ま た 多 検 体 測 定 が 必 須 の 体 内 動 態 研 究 用 と し て は ス ル ー プ ッ ト が 低 い た め 不 向 き で あ る 。 一 方 、LC-MS/MS 法 は 、選 択 性 、感 度 及 び ス ル ー プ ッ ト も 高 い こ と か ら 、生 体 試 料 中 の 薬 物 や 内 因 性 成 分 の 微 量 分 析 法 と し て 汎 用 さ れ て い る 1 6 )。 し か し な が ら 単 糖 類 に つ い て は 、こ れ ま で 生 体 試 料 中 の 夾 雑 物 質 に よ る イ オ ン 化 抑 制 に よ っ て 効 率 的 か つ 安 定 に イ オ ン を 生 成 で き な か っ た こ と か ら 、LC-MS/MS で 高 感 度 か つ 堅 牢 に 分 析 す る こ と は 困 難 で あ っ た 。こ れ を 克 服 す る た め に は 、イ オ ン 化 抑 制 物 質 を 除 去（ ク リ ー ン ア ッ プ ）す る こ と が 重 要 で あ る と 考 え ら れ る が 、単 糖 は 極 性 が 高 い た め 十 分 な ク リ ー ン ア ッ プ は 難 し い 。そ こ で 著 者 ら は 、効 果 的 な ク リ ー ン ア ッ プ 法 を 構 築 し 、 イ オ ン を 安 定 し て 生 成 さ せ る 手 法 を 確 立 す べ く 、 glucose の analog で あ る 5-thio-D-glucose（ Fig. 1）を モ デ ル 化 合 物 と し 、血 漿 サ ン プ ル を 用 い て 検 討 を 行 っ た 。
1-1
実験方法
標 準 物 質 及 び 試 薬
5-Thio-D-glucose は Fluka/Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) か ら 購 入 し た 。 安 定 同 位 体 標 識 さ れ た 内 標 準 物 質（ internal standard: IS） の 1 3
C6-5-thio-D-glucose
Fig. 1 Chemical structures of 5-thio-D-glucose, 1 3C6-5-thio-D-glucose (IS), D(+)-glucose and D(-)-fructose.
生 体 試 料
検 量 線 や quality control（ QC）試 料 の 調 製 に 使 用 し た ラ ッ ト 及 び ヒ ト ブ ラ ン ク 血 漿 は 北 山 ラ ベ ス （ 株 ） も し く は コ ス モ ・ バ イ オ （ 株 ） よ り 購 入 し た 。測 定 条 件
最 終 的 に 設 定 し た LC-MS/MS 条 件 を 以 下 に 示 す 。 LC 設 定 条 件バ ル ブ ポ ジ シ ョ ン ： Time（ min） バ ル ブ ポ ジ シ ョ ン 0.00 5.00 10.00 Divert MS Divert 流 速 ： 0.2 mL/min パ ー ジ 溶 媒 ： ア セ ト ニ ト リ ル ／ 水 （ 85:15、 v/v） ニ ー ド ル ウ ォ ッ シ ュ 溶 媒 及 び プ ラ ン ジ ャ ー シ ー ル ウ ォ ッ シ ュ 溶 媒 ： ア セ ト ニ ト リ ル ／ 水 （ 30:70、 v/v） カ ラ ム 温 度 ： 40°C オ ー ト サ ン プ ラ ー 温 度 ： 5°C 試 料 注 入 量 ： 3 µL MS/MS 設 定 条 件
機 器 ： 2795 Separation module（ Waters, Milford, MA） イ オ ン 化 法 ： Electrospray ionization（ESI）（Turbo Ion Spray） イ オ ン ス プ レ ー 電 圧 ： -4500 V ヒ ー タ ー ガ ス 温 度 ： 600°C ネブライザーガス（GS1：ドライエアー）： 40 psi（ 約 276 kPa） タ ー ボ ガ ス （ GS2： ドライエアー）： 20 psi（ 約 138 kPa） カ ー テ ン ガ ス （ 窒 素 ）： 50 psi（ 約 345 kPa） コ リ ジ ョ ン ガ ス （ 窒 素 ）： #2 マ ル チ プ ラ イ ヤ ー 電 圧 ： 2000 V 検 出 モ ー ド ： 負 イ オ ン 検 出 モ ー ド
Multiple reaction monitoring（ MRM） モ ニ タ ー イ オ ン 及 び コ リ ジ ョ ン エ ネ ル ギ ー ：
測 定 対 象 物 質 Precursor ion Product ion コ リ ジ ョ ン エ ネ ル ギ ー（ V） 5-Thio-D-glucose m/z 195 m/z 105 -14
IS m/z 201 m/z 108 -14
標 準 溶 液 の 調 製
ブランク試料 （血漿量：各 50 µLa） ゼロ試料、検量線用標準試料溶液及び QC 試料（血漿量：各 50 µLa） 水 10 µLb IS 溶液（1000 ng/mL）10 µLb アセトニトリル／メタノール（90:10、v/v） 300 µLc ボルテックスミキサーにて 30 秒間撹拌 遠心分離（設定値：4°C、10000g、5 分間） 沈殿物 上清 60°C（設定値）加温下窒素ガスにて蒸発乾固 水 100 µL
Bond Elut DEA（100 mg/1 mL）
血 は 単 回 投 与 後 1、 2、 4、 8、 24 h、 さ ら に 50 mg/kg/day 投 与 群 に つ い て は 7 日 間 反 復 投 与 後 24 h、 14 日 間 反 復 投 与 前 及 び 投 与 後 1、 2、 4、 8、 24 h に 、 ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 処 理 し た 注 射 筒 を 用 い て 頸 静 脈 よ り 行 っ た 。採 取 し た 血 液 は 速 や か に 氷 中 に 保 存 後 、 血 漿 分 離 し 、 LC-MS/MS に よ る 分 析 ま で -80°C で 保 管 し た 。
PK 解 析
50 mg/kg/day 投 与 群 の PK 解 析 に つ い て は 、 WinNonlin software（ Professional version 6.1; Pharsight ） に て 、 2‐ コ ン パ ー ト メ ン ト モ デ ル 解 析 に よ り 、 薬 物 動 態 パ ラ メ ー タ を 算 出 し た 。
1-2 結果及び考察
生 体 試 料 中 単 糖 類 の LC-MS/MS を 用 い た 高 感 度 定 量 法 を 開 発 す る に は 、 イ オ ン 源 に て 微 量 な 単 糖 を 安 定 に イ オ ン 化 す る 必 要 が あ る た め 、イ オ ン 化 を 抑 制 す る 夾 雑 物 質 の 除 去（ ク リ ー ン ア ッ プ ）が 重 要 と 考 え ら れ る 。そ こ で 本 章 で は 、血 漿 に 含 ま れ る 5-thio-D-glucose を ケ ー ス ス タ デ ィ ー と し て 単 糖 類 の 分 析 に 最 適 な ク リ ー ン ア ッ プ 法 の 構 築 を 目 的 と し た 。す な わ ち 、イ オ ン 化 を 抑 制 す る 夾 雑 物 質 を 除 去 す る た め の 方 法 と し て 、(1)LC に よ る 分 析 対 象 物 質 と 干 渉 物 質 と の ク ロ マ ト 分 離 条 件 、 及 び (2)サ ン プ ル の 前 処 理 に よ る ク リ ー ン ア ッ プ 法 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。1-2-1 LC による 5-thio-D-glucose と D(+)-glucose 及び D(-)-fructose とのク
ロマト分離条件の検討
ン 化 抑 制 を 回 避 す る こ と に 成 功 し た 。
Fig. 2 Typical MRM chromatograms of synthetic compounds in aqueous solutions using Asahipak NH2P column: (A) D(-)-fructose (m/z 179→89); (B) 5-thio-D-glucose (m/z 195→105) and (C) D(+)-glucose (m/z 179→89).
1-2-2 サンプル前処理によるクリーンアップ
ラ ッ ト 血 漿 試 料 を 用 い た 検 討
Fig. 3 Representative chromatograms of 5-thio-D-glucose and IS in rat plasma (A: single blank, B: 10 ng/mL lower limit of quantification (LLOQ) sample). 5-Thio-D-glucose (left panel), IS (right panel).
Table 2 Calibration curves for 5-thio-D-glucose in rat plasma
1st day 2nd day 3rd day 1st day 2nd day 3rd day
10 9.94 9.91 10.0 -0.6 -0.9 0.0 30 30.6 30.6 29.8 +2.0 +2.0 -0.7 100 100 102 100 0.0 +2.0 -0.2 300 299 302 310 -0.3 +0.7 +3.3 1000 993 972 982 -0.7 -2.8 -1.8 3000 2980 2970 2980 -0.7 -1.0 -0.7 Slope 0.00657 0.00634 0.00650 Y-intercept -0.00545 0.00248 0.00317 ra 0.9999 0.9998 0.9998 Relative error (%) Back-calculated concentration (ng/mL) Rat plasma Nominal concentration (ng/mL)
Table 3 Precision and accuracy for the determination of 5-thio-D-glucose in rat plasma
Fig. 4 Representative chromatograms of 5-thio-D-glucose and IS in human plasma (A: single blank, B: 10 ng/mL LLOQ sample). 5-Thio-D-glucose (left panel), IS (right panel).
Table 4 Calibration curves for 5-thio-D-glucose in human plasma
1st day 2nd day 3rd day 1st day 2nd day 3rd day
Table 5 Precision and accuracy for the determination of 5-thio-D-glucose in human plasma %CV %RE %CV %RE 10 3.6 -0.6 3.0 -0.6 24 1.5 +1.7 2.1 +0.8 240 0.8 -1.3 0.8 -1.3 2400 1.1 -3.3 1.4 -3.8 Human plasma Inter-assay (n=15) Nominal concentration (ng/mL) Intra-assay (n=5)
Table 6 Recoveries of 5-thio-D-glucose and IS from human plasma Nominal concentration (ng/mL) Recovery (%) SD %CV 24 61.0 1.3 2.1 240 65.6 1.4 2.1 2400 67.4 2.7 4.0 IS 200 67.7 2.3 3.4 Human plasma (n=5) 5-Thio-D-glucose
1-2-3 ラットにおける 5-thio-D-glucose の PK プロファイルの測定
後 24 h ま で の 血 漿 中 濃 度 測 定 を 行 っ た 。 そ の 濃 度 推 移 に つ い て 2‐ コ ン パ ー ト メ ン ト モ デ ル で 解 析 を 行 っ た 結 果 、実 測 値 と 解 析 結 果 は 非 常 に 良 好 に 合 致 し（ Fig. 5）、5-thio-D-glucose の ラ ッ ト 体 内 か ら の 消 失 は 比 較 的 緩 慢（ t1 / 2α: 1.6 h、t1 / 2β: 31 h）で あ る と い う 新 規 で 有 用 な 知 見 が 得 ら れ た 。な お 、PK 検 体 を 測 定 す る に あ た り 、 予 め 5-thio-D-glucose の 血 漿 中 安 定 性 や 希 釈 の 影 響 に つ い て も 問 題 が な い こ と を 確 認 し た （ Table 8, 9）。 以 上 の よ う に 、前 項 で 構 築 し た ク リ ー ン ア ッ プ 法 を 適 用 す る こ と に よ っ て 、こ れ ま で 不 可 能 で あ っ た ラ ッ ト 血 漿 中 の 微 量 の 5-thio-D-glucose を 定 量 す る こ と が 可 能 と な り 、 ラ ッ ト に お け る PK プ ロ フ ァ イ ル を 収 集 す る こ と が で き た 。
Table 7 Plasma concentrations of 5-thio-D-glucose in male rats given single oral administration of 5-thio-D-glucose
Fig. 5 Experimental values of plasma concentration (■) and WinNonlin modeling simulation (—) for 14 repeat oral doses of 5-thio-D-glucose (50 mg/kg/day).
Table 8 Stability of 5-thio-D-glucose in rat plasma
Storage conditions Nominal
concentration (ng/mL)
Remaining (%)
Freeze-thaw stability (6 cycles) 24 106.3
2400 100.0
Short-term stability (room temperature for 4h) 24 98.6
2400 110.9
Long-term stability (-20°C for 42 days) 24 105.9
2400 102.7
Long-term stability (-70°C for 42 days) 24 107.7
2400 102.3
Post-preparative stability (5°C for 72 h) 24 109.5
構 造 を 保 有 し て お り5 4 ) , 5 5 ) 、弱 い な が ら も SGLT1 の 阻 害 活 性 を 併 せ 持 っ て い る5 1 )。 Luseogliflozin は そ の 中 で も 比 較 的 選 択 性 は 高 い が 、臨 床 用 量（ 5 mg）を 水 250 mL に 溶 か し た 濃 度 （ [I2]） は SGLT1 の IC5 0値 よ り 10 倍 以 上 高 く な る た め 、 FDA の DDI ド ラ フ ト ガ イ ダ ン ス 5 ) に 示 さ れ た 臨 床 DDI 試 験 の 実 施 を 考 慮 す る ケ ー ス （ [I2]/SGLT1 IC5 0 ≥ 10） に 該 当 す る 。
以 上 の 背 景 か ら 、 miglitol と luseogliflozin の 併 用 に よ っ て 、 miglitol の 吸 収 が 阻 害 さ れ る か ど う か の 検 討 を モ デ ル ケ ー ス と し て 、腸 管 吸 収 に お け る TP を 介 し た DDI ポ テ ン シ ャ ル 予 測 法 の 構 築 を 行 う こ と と し た 。
第 1 節 ラット血漿中 miglitol の高感度定量法の開発と PK プロファイル
の解明
DDI 予 測 法 構 築 に は 、 ま ず 、 miglitol の ラ ッ ト に お け る PK プ ロ フ ァ イ ル が 必 要 で あ る 。 こ れ ま で に ラ ッ ト で の 3 H-miglitol の PK デ ー タ 5 6 )は 報 告 さ れ て い る が 、総 放 射 能 量 を 測 定 対 象 と し た 結 果 で あ り 、ク ロ マ ト 分 離 を 伴 わ な い こ と か ら 選 択 性 に 欠 け 、 代 謝 物 な ど も 計 り 込 ん で い る 可 能 性 を 否 定 で き な い 。 そ こ で 、本 節 で は ま ず 、第 １ 章 で 構 築 し た 方 法 論 を 適 用 し 、血 漿 中 miglitol の LC-MS/MS を 用 い た 高 感 度 測 定 法 を 開 発 し 、ラ ッ ト に お け る PK プ ロ フ ァ イ ル の 検 討 を 行 っ た 5 7）。2-1-1
実験方法
標 準 物 質 及 び 試 薬
生 体 試 料
ブ ラ ン ク 血 漿 検 量 線 や QC 試 料 の 調 製 に 使 用 し た ラ ッ ト 血 漿 は チ ャ ー ル ス リ バ ー（ 株 ）よ り 購 入 し た 。装 置 及 び 測 定 条 件
最 終 的 に 設 定 し た LC/MS/MS 条 件 を 以 下 に 示 す 。 LC 設 定 条 件機 器 ： Shimadzu LC-20AD pumps, SIL-HTc autosampler, CTO-10AC column oven（ Shi madzu, Tokyo, Japan） 分 析 カ ラ ム ： XBridgeT MAmide column（ 50 mm×4.6 mm I.D.、 粒
MS/MS 設 定 条 件
機 器 ： TQ5500（ AB SCIEX, Foster City, CA, USA） イ オ ン 化 法 ： Electrospray ionization（ESI）（Turbo Ion Spray） イ オ ン ス プ レ ー 電 圧 ： 3000 V ヒ ー タ ー ガ ス 温 度 ： 550℃ ネブライザーガス（GS1：ドライエアー）： 60 psi タ ー ボ ガ ス （ GS2： ドライエアー）： 80 psi カ ー テ ン ガ ス （ 窒 素 ）： 30 psi コ リ ジ ョ ン ガ ス （ 窒 素 ）： #8 検 出 モ ー ド ： 正 イ オ ン 検 出 モ ー ド
Multiple reaction monitoring（ MRM）
モ ニ タ ー イ オ ン 及 び コ リ ジ ョ ン エ ネ ル ギ ー ：
動 物 実 験
す べ て の 動 物 飼 育 及 び 実 験 は 大 正 製 薬 株 式 会 社 の 動 物 実 験 に 関 す る 規 程 及 び Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments （ 日 本 学 術 会 議 ） に 従 っ て 行 っ た 。 Miglitol を 雄 性 ラ ッ ト（ sprague-dawley、日 本 チ ャ ー ル ス・リ バ ー ）に 絶 食 下 、 1.5 mg/kg の 用 量 で 単 回 静 脈 内 投 与 （ n=3） 及 び 単 回 経 口 投 与 （ n=6） し た 。 採 血 は 投 与 後 0.083、 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8、 24 h に 、 ヘ パ リ ン ナ ト リ ウ ム 処 理 し た 採 血 管 を 用 い て 尾 静 脈 よ り 行 っ た 。 採 取 し た 血 液 は 速 や か に 血 漿 分 離 し 、 LC-MS/MS に よ る 分 析 ま で -80°C で 保 管 し た 。
PK 解 析
除 タ ン パ ク 及 び SPE の 平 衡 化 溶 媒 と し て ア セ ト ニ ト リ ル /28% ア ン モ ニ ア 溶 液 （ 98:2, v/v） を 採 用 す る こ と に よ っ て 、 ① PPT→② SPE（ C18-CX） の 2 ス テ ッ プ で 、 回 収 率 75%以 上 （ Table 10） の 結 果 を 得 る こ と が で き た 。 ま た 、 6 個 体 の ブ ラ ン ク 血 漿 を 用 い て 、マ ト リ ッ ク ス の 影 響 に つ い て 確 認 し た と こ ろ 、得 ら れ た 定 量 値 の 精 度 （ %CV） は 2.9%、 真 度 （ %RE） は -4.4～ +4.4%で あ り （ Table 11） 、 バ ラ ツ キ の 少 な い 良 好 な 結 果 が 得 ら れ た 。 0.8 74.7 1.7 2.2 8 75.6 1.2 1.6 80 75.5 1.1 1.5 I.S. (n=5) 25 78.5 1.6 2.0
Table 10 Recoveries of miglitol and IS from rat plasma
Miglitol (n=5) Analyte SD %CV Nominal concentration (ng/mL) Recovery (%) 0.800 0.0 0.815 -1.9 0.803 -0.4 0.765 4.4 0.835 -4.4 0.799 0.1 0.8 0.803 0.023
Table 11 Matrix effect for the determination of miglitol in rat plasma
Fig. 7 Representative chromatograms of miglitol and IS in rat plasma (A, zero sample; B, 0.5 ng/mL LLOQ sample; C, 100 ng/mL ULOQ sample; D, 1-h post-dose sample following single oral dose of miglitol). Miglitol (left panel), IS (right panel).
以 上 の 検 討 に よ り 、微 量 の miglitol の イ オ ン を 安 定 か つ 効 率 的 に 生 成 さ せ る こ と が で き 、 0.5 ng/mL の ピ ー ク を 十 分 な S/N 比 と と も に 検 出 す る こ と に 成 功 し た （ Fig. 7） ｡さ ら に 、 検 量 線 を 3 回 作 成 し た 結 果 、 相 関 係 数 は 0.5～ 100 ng/mL の 濃 度 範 囲 に お い て 0.9984～ 0.9993、 検 量 線 各 濃 度 の 相 対 誤 差 （ %RE） は -9.4～ +8.7%で あ り 、 良 好 な 直 線 性 が 確 認 さ れ た （ Table 12）。 日 内 再 現 性 に お け る 精 度 （ %CV） は 0.6～ 3.3%、 真 度 （ %RE） は -4.8～ +3.4%、 日 間 再 現 性 に お け る 精 度 （ %CV） は 1.5～ 3.3%、 真 度 （ %RE） は -5.0～ +3.0%で あ っ た （ Table 13）。 以 上 の 結 果 よ り 、高 選 択 、高 感 度（ 定 量 下 限：0.5 ng/mL）の ラ ッ ト 血 漿 中 miglitol の 定 量 法 を 開 発 す る こ と が で き た 。
1st day 2nd day 3rd day 1st day 2nd day 3rd day 0.5 0.492 0.496 0.492 -1.6 -0.8 -1.6 1 1.01 0.997 1.00 1.0 -0.3 0.0 3 3.09 3.11 3.26 3.0 3.7 8.7 5 5.20 5.15 5.13 4.0 3.0 2.6 10 10.2 10.1 10.1 2.0 1.0 1.0 30 30.5 30.1 29.7 1.7 0.3 -1.0 50 49.3 49.8 49.8 -1.4 -0.4 -0.4 100 90.6 93.4 90.8 -9.4 -6.6 -9.2 Slope 0.253 0.252 0.260 Y-intercept 0.00921 0.01060 0.01400 r : Correlation coefficient 0.9988 0.9993 0.9984
Table 12 Calibration curves for miglitol in rat plasma
Relative error (%) Back-calculated concentration (ng/mL) Analyte Miglitol Nominal concentration (ng/mL) %CV %RE %CV %RE 0.5 0.6 -1.4 2.2 -1.8 0.8 3.3 +0.8 3.3 -0.4 8 1.1 +3.4 1.5 +3.0 80 1.1 -4.8 1.7 -5.0
Table 13 Precision and accuracy for the determination of miglitol in rat
Miglitol
Intra-assay (n=5) Inter-assay (n=15) Nominal
2-1-2-2 ラット血漿中 miglitol 濃度測定法バリデーション
前 項 で 開 発 し た 分 析 法 を 用 い 、 FDA の Bioanalytical method validation ガ イ ド ラ イ ン 6 0 ) を 参 考 に 、 ラ ッ ト 血 漿 中 miglitol 濃 度 測 定 法 の バ リ デ ー シ ョ ン 試 験 を
行 っ た 。検 討 項 目 は 、選 択 性 、検 量 線 、再 現 性 、回 収 率 、安 定 性 、希 釈 の 妥 当 性 及 び マ ト リ ッ ク ス の 影 響 で あ り 、い ず れ の 評 価 項 目 に お い て も 良 好 な 結 果 を 示 し 、 す べ て の 評 価 項 目 で バ リ デ ー シ ョ ン の 判 断 基 準 を 満 た し た 。
Freeze-thaw stability (-20°C, 3 cycles)
0.8 0.824 103.4
80 75.1 101.1
Freeze-thaw stability (-80°C, 3 cycles)
0.8 0.827 103.8
80 74.8 98.7
Short-term stability (room temperature for 6 hours)
0.8 0.798 99.3
80 75.7 99.0
Long-term stability (-20°C for 16 weeks)
0.8 0.784 99.0
80 76.9 101.5
Long-term stability (-80°C for 16 weeks)
0.8 0.796 100.5
80 77.5 102.2
Post-preparative stability (10°C for 72 hours)
0.8 0.822 103.8
80 77.5 102.2
Table 14 Stability of miglitol in rat plasma
Miglitol (n=3) Nominal concentration (ng/mL) Remaining (%) Mean of calculated concentration (ng/mL) Analyte
希 釈 の 妥 当 性
希 釈 の 妥 当 性 の 結 果 を Table 15 に 示 す 。ラ ッ ト 血 漿 に お け る 希 釈 の 影 響 試 験 用 QC 試 料 を 希 釈（ 5、10、50 倍 ）し て 測 定 し た 結 果 、得 ら れ た 定 量 値 の 精 度（ %CV） は 0.6～ 1.1%、真 度（ %RE）は -4.8～ -3.3%で あ り 、バ リ デ ー シ ョ ン の 判 断 基 準 を 満 た し た 。 300 ×5 290 1.6 0.6 -3.3 600 ×10 578 6 1.0 -3.6 3000 ×50 2856 30 1.1 -4.8Table 15 Influence of dilution with rat plasma
2-1-2-3 ラットにおける miglitol の PK プロファイルの解明
前 節 で 開 発 し た ラ ッ ト 血 漿 中 miglitol 濃 度 測 定 法 を 使 用 し 、 miglitol を ラ ッ ト へ 静 脈 内 及 び 経 口 投 与 後 の PK デ ー タ を 収 集 し た 。ラ ッ ト に miglitol を 1.5 mg/kg 単 回 静 脈 内 投 与 後 、消 失 半 減 期（ terminal half-life: t1 / 2）4.2 h、全 身 ク リ ア ラ ン ス
は 1170 mL/h/kg で 消 失 し た 。分 布 容 積 は 942 mL/kg で あ っ た 。単 回 経 口 投 与 後 、 0.46 h で Cma x は 867 ng/mL に 達 し た 。静 脈 内 投 与 後 と 経 口 投 与 後 の area under the
curve（ AUC）か ら 算 出 し た bioavailability は 68.9％ で あ り 、ラ ッ ト に お い て miglitol の 生 物 学 的 利 用 能 は 高 い と 考 え ら れ た 。 経 口 投 与 後 の AUC は 905 ng･h/mL で あ り（ Table 16, Fig. 8）、こ れ は 3 H-miglitol を 用 い て 定 量 し た 既 報 の デ ー タ 5 6）を 投 与 量 換 算 し た も の に 対 し 70%程 度 の 値 で あ っ た 。 mean ± SD mean ± SD CL (mL/h/kg) 1170 ± 220 Vd (mL/kg) 942 ± 421 t1/2(h) 4.2 ± 2.3 2.8 ± 2.1 Cmax(ng/mL) 867 ± 173 Tmax(h) 0.46 ± 0.10 AUC0-t(ng･h/mL) 1310 ± 223 905 ± 77.9 AUC0-∞(ng･h/mL) 1320 ± 223 909 ± 78.6 Bioavailability (%) – 68.9 – –
Table 16 Pharmacokinetic parameters after a single oral and intravenous administration of miglitol (1.5 mg/kg) to rats.
Pharmacokinetic parameter Intravenous administration (n=3) Oral administration (n=6)
–
CL, total plasma clearance; Vd, vo lume o f distributio n; t1 / 2, terminal half-life; Cm a x, maximu m
level; Tm a x, time o f Cm a x; AUC0 - t, area und er the curve fro m zero to time t; AUC0 - ∞, area under
第 2節 ラット腸管吸収における薬物‐薬物間相互作用ポテンシャル予測
法の開発
本 節 で は 、 第 １ 節 で 収 集 し た miglitol の ラ ッ ト PK プ ロ フ ァ イ ル を も と に 、 miglitol の 吸 収 が luseogliflozin の 併 用 に よ っ て 阻 害 さ れ る か ど う か の 検 討 を モ デ ル ケ ー ス と し て 、 ダ イ ナ ミ ッ ク モ デ ル （ ACAT､GastroPlusT M） を 用 い た 評 価 法 を 構 築 し 、 そ の 妥 当 性 を 検 証 し た 。2-2-1
実験方法
標 準 物 質 及 び 試 薬
Luseogliflozin ((1S)-1, 5-anhydro-1-[5-(4-ethoxybenzyl)-2-methoxy-4-methylphenyl]-1-thio-D-glucitol) 、 2H5-luseogliflozin は 大 正 製 薬（ 株 ）で 合 成 し た も の を 用 い た 。Phlorizin は Toronto
Research Chemicals Inc.（ North York, Ontario, Canada） か ら 購 入 し た （ Fig. 9）。 Miglitol 及 び 2H4-miglitol は 前 章 と 同 様 の も の を 使 用 し た 。
Methyl-α-D-glucopyranoside (α-MG) 及 び [1 4C] α-MG は そ れ ぞ れ Sigma-Aldrich
（ St. Louis, MO） 及 び PerkinElmer（ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 そ の 他 の 試 薬 及 び 溶 媒 は 市 販 の 特 級 品 ま た は HPLC 用 を 用 い た 。
Fig. 9 Chemical structures of luseogliflozin (A), phlorizin (B), and miglitol (C).
N OH OH O H OH OH O OH O H OH O H O O H OH O OH
(A) Luseogliflozin (B) Phlorizin (C) Miglitol
生 体 試 料
ブ ラ ン ク 血 漿
検 量 線 や QC 試 料 の 調 製 に 使 用 し た ラ ッ ト 血 漿 は Charles River Laboratories Japan （ Kanagawa, Japan） よ り 購 入 し た 。
SGLT1 に 対 す る 阻 害 作 用
American Type Culture Collection（ ATCC, Rockville, MD） か ら 入 手 し た チ ャ イ ニ ー ズ ハ ム ス タ ー 卵 巣 由 来 CHO-K1 細 胞 に 、 ヒ ト SGLT1（ hSGLT1; Genbank Accession number, NM_000343） プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー （ pcDNA3.1/Hygro(+)） を 安 定 導 入 し た 。ヒ ト SGLT1 発 現 細 胞 を 、10%ウ シ 胎 児 血 清 、250 μg/mL Hygromycin を 含 む F-10 培 地 で 2 日 間 培 養 し た 。ア フ リ カ ミ ド リ ザ ル 腎 臓 由 来 COS-7 細 胞 は ATCC よ り 入 手 し 、 遺 伝 子 導 入 の 前 日 ま で 10%ウ シ 胎 児 血 清 を 含 む Dulbecco's Modified Eagle's Medium 培 地 に て 96 ウ ェ ル プ レ ー ト 内 で 培 養 し た 。 COS-7 細 胞 に ラ ッ ト SGLT1（ rSGLT1）プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を 一 過 性 導 入 し 、1 日 培 養 し た 。
hSGLT1 ま た は rSGLT1 発 現 細 胞 を 、前 処 理 用 緩 衝 液（ 140 mM Choline chloride, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5 mM Tris, pH 7.2–7.4 ） に
37℃ 下 で 20 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 、 α-MG（ [1 4C]-α-MG、 α-MG 混 液 ） 及 び 複 数 の 濃 度 の 試 験 物 質 ま た は 溶 媒（ DMSO）を 含 む 反 応 用 の 緩 衝 液（ 140 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5 mM Tris, pH 7.2–7.4 ） に
37℃ 下 で 20 ま た は 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。本 操 作 は ト リ プ リ ケ ー ト に て 実 施 し た 。Sodium/glucose cotransporter の 基 質 で あ る α-MG 濃 度 は 、hSGLT1 評 価 に お い て 1 mM、rSGLT1 の 評 価 に お い て 500 μΜ に 設 定 し た 。細 胞 内 取 り 込 み 試 験 を 開 始 し た 後 、 10 mM の α-MG を 含 む 前 処 理 用 緩 衝 液 に て 2 回 細 胞 を 洗 浄 す る こ と に よ り 反 応 終 了 と し た 。 さ ら に 細 胞 を 0.25 M の NaOH で 溶 解 し た 。 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ た 放 射 標 識 体 は 液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー に よ り 測 定 し た 。 ま た 、 ナ ト リ ウ ム 非 依 存 的 な 細 胞 内 取 り 込 み 量 は 、α-MG 及 び 溶 媒 （ DMSO） を 含 む ナ ト リ ウ ム 不 含 反 応 用 緩 衝 液 （ 140 mM Choline Chloride, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5 mM Tris, pH 7.2–7.4 ） を 用 い て 評 価 し た 。 ナ
GastroPlus
TMを 用 い た 腸 管 に お け る IC
50値 の 10 倍 超 え る濃 度の
持 続 時 間 （ Time Spent Above a Value 10-fold higher than the IC
50Value： TAIC） の 算 出
腸 管 濃 度 の シ ミ ュ レ ー シ ョ ン に は 、GastroPlusT M
（ Simulation Plus Inc., Lancaster, CA） Ver.8、 ACAT モ デ ル 6 1 ) を 使 用 し た 。 ACAT モ デ ル は 、 Yu6 2）ら が 開 発 し た
Compartmental Absorption and Transit（ CAT） モ デ ル を 、 Advanced Compartmental Absorption and Transit（ ACAT）モ デ ル と し て 発 展 さ せ た シ ミ ュ レ ー シ ョ ン ソ フ ト ウ ェ ア で 、 経 口 投 与 製 剤 の 腸 管 内 の 挙 動 、 薬 物 の 血 中 移 行 を 解 析 ・ 予 測 で き る 。
Luseogliflozin と positive control と し て 使 用 し た phlorizin の 腸 管 に お け る TAIC は 、 以 下 の フ ロ ー に 従 っ て 算 出 し た 。
1) Effective permeability（ Pe ff） 値 の 算 出
吸 収 速 度 定 数 (Ka) は 、GastroPlusT M の PKPlusT Mモ ジ ュ ー ル を 使 用 し 、ラ
ッ ト に luseogliflozin を 経 口 投 与 後 の 血 漿 中 濃 度 ‐ 時 間 デ ー タ を 2-コ ン パ ー ト メ ン ト モ デ ル で 解 析 す る こ と に よ っ て 算 出 し た 。ラ ッ ト に お け る phlorizin の Ka 値 に つ い て も 同 様 に し て 算 出 し た 。 Pe ff値 は 下 記 の 式 (1) 6 3 ) に し た が っ て 算 出 し た 。 （ 1） V; 管 腔 体 積 , S; 表 面 積 , r; 管 腔 直 径 （ ラ ッ ト ： 0.18 cm 6 4））
2) Fraction absorbed value（ Fa） と PK パ ラ メ ー タ の 算 出
3) 肝 臓 と 小 腸 の 初 回 通 過 効 果 （ first-pass effects: FPE） の 算 出
肝 臓 に お け る 初 回 通 過 効 果 （ FPE Liver(%)） と 小 腸 に お け る 初 回 通 過 効 果 （ FPE Intestinal(%)） は 下 記 の よ う に 見 積 も っ た 。
FPE Liver(%): (1-Fh)×100 FPE Intestinal(%): (1-Fg)×100
Fh; hepatic availability, Fg; intestinal availability
腎 ク リ ア ラ ン ス の 寄 与 は 無 視 で き る と 仮 定 し 、 肝 ク リ ア ラ ン ス を 全 身 ク リ ア ラ ン ス と 同 等 と 設 定 し た 。 ラ ッ ト に お け る luseogliflozin と phlorizin の Fh と Fg 値 は 以 下 の 式 （ 2） 及 び （ 3） に よ り 算 出 し た 。 Fh = 1 - (CL / Rb) / Qh （ 2） Fg = F / (Fa × Fh) （ 3） 肝 血 流 量 （ Qh）； 4.2 L/h/kg 6 6 )
Fa; fraction absorbed value, Rb; blood/plasma ratio
3
8
Table 17 Input parameters for GastroPlusTMthat were used to simulate the luminal concentrations
Property Luseogliflozin in rats Phlorizin in rats Luseogliflozin in humans
Input data Reference/Remarks Input data Reference/Remarks Input data Reference/Remarks
Physicochemical parameters
Molecular Formula C23H30O6S - C21H24O10 - C23H30O6S
-Molecular Weight (g/mol) 434.55 - 436.42 - 434.55
-Reference logP (@pH) 2.2 (-1) In-house data 0.25 (-1) Estimated by
ADMET PredictorTM 2.2 (-1) In-house data
Dosage Form IR: Solution - IR: Suspension - IR: Tablet
-Initial Dose (mg) 0.03 - 12 - 5 -Dose Volume (mL) 2 - 2 - 250 -Solubility (mg/mL @pH=6.57) 0.0771 In-house data 9.27 (mg/mL@pH=4.49) Estimated by
ADMET PredictorTM 0.0771 In-house data
Diff. Coeff. (cm2/s x 105) 0.60 Estimated by
ADMET PredictorTM 0.64
Estimated by
ADMET PredictorTM 0.60
Estimated by ADMET PredictorTM
Mean Particle Radius (μm) 3.03 In-house data 25.0 Default value 1.22 In-house data
Peff (cm/s x 104) 6.23 Estimated from Ka 0.558 Estimated from Ka 27.5 Estimated from Ka
Gut Physiology
Physiology Rat-fasted
The stomach transit time was changed to 0.1 h.
Rat-fasted The stomach transit time
was changed to 0.1 h. Human-fasted -ASF Model Opt logD Model
SA/V6.1
-Opt logD Model
SA/V6.1
-Opt logD Model
SA/V6.1
-Pharmacokinetic parameters
Body Weight (kg) 0.30 - 0.30 - 60
-FPE Intestinal 45.7 Estimated 98.8 Estimated 0
-FPE Liver 73.3 Estimated 65.4 Estimated 0
-Blood/plasma
Concentration Ratio 0.536 In-house data 0.930
Estimated by
ADMET PredictorTM 0.599 In-house data
Use Exp Plasma Fup (%) 5.40 In-house data 6.71 Estimated by
ADMET PredictorTM 4.00 In-house data
Renal Clearance (L/h/kg) 0 - 0 - 0
-model 2-compartment - 2-compartment - 2-compartment
Table 18 Dose regimens and formulations in the pharmacokinetic and interaction studies in rats
Study Compound Route N Dose Conc. Vehicle Formulation (mg/kg) (mg/mL)
Pharmacokinetics
Luseogliflozin iv 3 0.1 0.1 10% HP-β-CD solution
Phlorizin iv 3 4 4 PEG400/
Saline (4:6,v/v) solution Luseogliflozin po 6 0.1 0.015a 0.5% CMC-Na solution Phlorizin po 6 40 6 0.5% CMC-Na suspension
Interaction
Miglitol alone po 6 1.5 0.225a 0.5% CMC-Na solution Combination Miglitol po 6 1.5 0.225 a 0.5% CMC-Na solution Luseogliflozin 0.1 0.015a Combination Miglitol po 6 1.5 0.225 a 0.5% CMC-Na suspension Phlorizin 40 6
N, number of animals; 10% HP-β-CD, 10% hydroxy propyl β cyclodextrin; PEG400, polyethlene glycol 400; CMC-Na, carboxy methyl cellulose sodium.
a
The concentration values were set based on those clinical dose regimens.
TAIC/T
maxの算出
小 腸 に お け る luseogliflozin 及 び phlorizin の TAIC が miglitol の Tma xに 占 め る
割 合（ ％ ）は 以 下 の 式（ 4）に よ り 算 出 し た 。本 研 究 で は 、こ の TAIC/Tm a x （ ％ ）
を DDI を 引 き 起 こ す ポ テ ン シ ャ ル の 指 標 と し た 。
（ 4）
装置及び測定条件
溶 解 し た 後 、正 確 に 10 mL と し て 100 µg/mL の 標 準 原 液 を 調 製 し た 。こ の 標 準 原 液 を 適 宜 メ タ ノ ー ル で 希 釈 し て 、 一 連 の phlorizin 標 準 溶 液 （ 0.2 ng/mL ～ 500 ng/ mL）を 調 製 し た 。IS 標 準 溶 液 は 10 mg を 正 確 に 量 り 、メ タ ノ ー ル に 溶 解 し た 後 、 正 確 に 100 mL と し て 100 µg/mL の IS 原 液 を 調 製 後 、 こ の IS 原 液 を さ ら に メ タ ノ ー ル で 希 釈 し 、 100 ng/mL の IS 溶 液 を 調 製 し た 。 こ れ ら の 標 準 溶 液 は い ず れ も 4℃ で 保 存 し た 。
添加血漿の調製
検 量 線 の 作 成 及 び バ リ デ ー シ ョ ン 試 験 用 の QC 試 料 は 、各 濃 度 の luseogliflozin ま た は phlorizin 標 準 溶 液 25 µ L を 各 々 ラ ッ ト ブ ラ ン ク 血 漿 50 µ L に 添 加 、 撹 拌 す る こ と に よ り 得 た （ 0.1～ 250 ng/mL）。検量線
検 量 線 は 、luseogliflozin ま た は phlorizin の 濃 度 が 0.1、0.3、1、5、10、50、100、 250 ng/ mL と な る よ う に 調 製 し た 8 種 の 添 加 血 漿 を 分 析 し 、添 加 血 漿 を x、IS（ 100 ng/ mL） に 対 す る luseogliflozin ま た は phlorizin の ピ ー ク 面 積 比 を y と し て 直 線 回 帰 す る こ と に よ り 得 た 。 重 み フ ァ ク タ ー は 1/x を 採 用 し た 。前処理法
ラ ッ ト 血 漿 中 miglitol の 前 処 理 は 前 節 に 準 じ た 。 Luseogliflozin 及 び phlorizin に つ い て は 以 下 の 方 法 で 前 処 理 を 行 っ た 。 50 µL の ラ ッ ト 血 漿 に IS 溶 液 （ 100 ng/ mL） 25 µL と 10 mmol/L の 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 溶 液 500 µL を 添 加 し 混 和 し た 。 活 性 化 及 び 平 衡 化 し た OASIS HLB cartridges（ 30 mg/1 cc; Waters, Milford, MA） に サ ン プ ル を ロ ー ド し 、 洗 浄 後 、 1 mL の メ タ ノ ー ル /酢 酸 （ 100:0.1, v/v） を 添 加 し 、遠 心（ preset values: 200×g, 4C, 1 min）し た 。溶 出 液 を 蒸 発 乾 固 し た 後 、100
µL の ア セ ト ニ ト リ ル /10 mmol/L 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 溶 液（ 20:80, v/ v）で 再 溶 解 し
2-2-2 結果及び考察
腸 管 に お け る DDI ポ テ ン シ ャ ル の 精 度 の 高 い 予 測 法 の 構 築 に は 、 薬 物 の 吸 収 に か か る 時 間 に 対 す る 併 用 薬 の 阻 害 時 間 の 割 合 、す な わ ち TAIC/Tm a xが 重 要 で あ る と 考 え た 。Tm a xは 容 易 に モ ニ タ ー 可 能 な パ ラ メ ー タ で あ り 、薬 物 の 吸 収 に か か る 時 間 の 指 標 と し て 設 定 し た 。 ま た 、 TAIC は 併 用 薬 に よ っ て 薬 物 の 吸 収 が ほ ぼ 完 全 に 阻 害 さ れ る 時 間 と し て 設 定 し た 。DDI ポ テ ン シ ャ ル の 予 測 は 、 以 下 の 4 つ の 主 な step に よ り 行 っ た 。 [step1] GastoPlusT M を 用 い た コ ン ピ ュ ー タ シ ミ ュ レ ー シ ョ ン に 必 要 な 併 用 薬 及 び positive control の 物 理 化 学 的 及 び 薬 物 動 態 学 的（ PK）パ ラ メ ー タ の 収 集 、[step2] シ ミ ュ レ ー ト し た 血 漿 中 濃 度 ‐ 時 間 プ ロ フ ァ イ ル が 実 測 値 と 良 好 に 符 合 す る か 検 証 す る こ と に よ る 入 力 パ ラ メ ー タ（ 物 理 化 学 及 び PK パ ラ メ ー タ ）の 妥 当 性 確 認 、 [step3] 腸 管 に お け る 薬 物 濃 度 ‐ 時 間 プ ロ フ ァ イ ル の シ ミ ュ レ ー シ ョ ン 結 果 か ら 、TP の IC5 0値 の 10 倍 を 超 え る 濃 度 の 持 続 時 間（ TAIC）の 算 出 、[step4] 腸 管 の TP を 介 し て 吸 収 さ れ る 薬 物 の Tm a xに 対 す る TAIC の 割 合 を も と に DDI ポ テ ン シ ャ ル を 評 価 し た 。 さ ら に 、 こ の 評 価 法 の 妥 当 性 は 、 in vivo で の DDI 試 験 の 結 果 と 符 合 す る か 確 認 す る こ と に よ っ て 検 証 し た 。 本 研 究 に お い て 重 要 と 思 わ れ た 3 つ の ポ イ ン ト を 以 下 に 示 す 。第 一 に 、腸 管 に お け る DDI ポ テ ン シ ャ ル を 予 測 す る に あ た り 、 著 者 ら は ス タ テ ィ ッ ク モ デ ル よ り 、よ り 精 度 の 高 い 予 測 が 可 能 と 考 え ら れ る ダ イ ナ ミ ッ ク モ デ ル を 使 用 し た 。ス タ テ ィ ッ ク モ デ ル は 、阻 害 剤 の 最 高 濃 度 が 一 定 に 持 続 す る と 仮 定 す る た め に 、偽 陽 性 の 問 題 が 報 告 8 ) さ れ て い る 。 第 二 に 、 SGLT1 は 刷 子 縁 膜 上 に 発 現 し て い る 3 9 )た め 、腸 管 の 管 腔 内 の luseogliflozin の 濃 度 と SGLT1 の 結 合 サ イ ト の 濃 度 は 同 等 と 考 え ら れ た 。 第 三 に 、 精 度 の 高 い ヒ ト で の DDI ポ テ ン シ ャ ル 予 測 に つ な げ る た め 、ラ ッ ト に お け る luseogliflozin の 投 与 濃 度 は 、ヒ ト へ の 投 与 濃 度（ 5 mg/250 mL） を も と に 設 定 し た 。
2-2-2-1 SGLT1 に対する阻害剤とその阻害効果
hSGLT1 を 過 剰 に 発 現 さ せ た 細 胞 を 用 い 、 ナ ト リ ウ ム 依 存 的 糖 取 り 込 み 反 応 に 対 す る luseogliflozin の 50％ 阻 害 濃 度 （ IC5 0値 ） の 算 出 を 行 っ た と こ ろ 、 IC5 0 値 は 2900 nM で あ っ た 。 ま た 、 rSGLT1 を 一 過 性 発 現 さ せ た 細 胞 を 用 い 、 同 じ く luseogliflozin と phlor izin の IC5 0値 の 算 出 を 行 っ た と こ ろ 、 IC5 0値 は 各 々 895 nM2-2-2-2 ラットにおける luseogliflozin 及び phlorizin の経口投与後の腸管内
TAIC の算出
Fig. 10 Plasma concentration time profiles for luseogliflozin and phlorizin in rats. (A-1 and B-1) Two-compart ment model -fi tted profiles in rats after the single intravenous administration of (A-1) luseoglif lozin (0.1 mg/ kg) and (B-1) phlorizin (4 mg/ kg). The closed circles represent the mean obser ved data + S.D. (n = 3). The solid lines were fitted using a nonlinear least-squares regression analysis. The PK parameters (CL, Vc, k1 2, k2 1) in rats for simulating luminal concentrations were
obtained by this fi tting to the obser ved data. (A-2 and B-2) Si mulated concentration-ti me profiles in rats after the single oral administration of luseogliflozin (0.1 mg/ kg) ( A-2) and phlorizin (40 mg/ kg) (B-2). The closed circles represent the mean obser ved data + S.D. (n = 6). The solid lines represent the model -si mulated profiles, which were obtained using the ACAT model in GastroPlus.
な お 、 パ ラ メ ー タ の 設 定 当 初 、 [step1]に て GastroPlusT Mに 搭 載 さ れ た ADMET
PredictorT Mを 使 用 し て Pe f f値 を 設 定 し た 場 合 に お い て は 、 [step2]で シ ミ ュ レ ー ト
し た 濃 度 ‐ 時 間 プ ロ フ ァ イ ル は 実 測 値 と 符 合 し な か っ た 。 Luseogliflozin と phlorizin の Tm a xの 実 測 値 は 共 に 0.25 h で あ る の に も 関 わ ら ず 、 シ ミ ュ レ ー ト 値
は そ れ ぞ れ 0.64 h 及 び 1.27 h で あ っ た 。 さ ら に 、 phlorizin の Cm a x値 も 実 測 値 か
ら 乖 離 し た 。そ こ で 、luseogliflozin の Tma xと phlorizin の Tma x及 び Cm a xへ の 各 パ
ラ メ ー タ の 影 響 を 解 析 す る た め 、 GastoPlusT M の parameter sensitivity analysis 機
能 を 使 用 し た と こ ろ 、Pe f f 値 の み が そ れ ら に 影 響 を 与 え う る パ ラ メ ー タ と し て 解
析 さ れ た （ Fig. 11）。
Fig. 11 Potential influence of Pe f f value on the Tma x and Cm a x values. The Tma x of
luseogliflozin and the Tm a x and Cm a x of phl orizin were si mulated using different
values for Pe f f with other parameters fixed at the same values, as shown in Table 17.
こ の 結 果 を 受 け て 、Pe f f値 に つ い て ADMET Predictor T M で の 予 測 以 外 の 算 出 方 法 を 検 討 す る こ と と し た 。 そ こ で 、 Amidon ら に よ り 提 唱 3 9 ) さ れ た Ka か ら Pe f f を 算 出 す る 式 （ 1） を 用 い て 、 各 々 の Ka の 実 験 値 か ら Pe f f値 を 見 積 も り 、 再 度 、 血 漿 中 薬 物 濃 度 ‐ 時 間 プ ロ フ ァ イ ル を シ ミ ュ レ ー ト し た 。 そ の 結 果 、 luseogliflozin と phlorizin の Tma xは そ れ ぞ れ 0.37 h 及 び 0.51 h ま で 改 善 し 、 こ の
条 件 に お い て は 、 各 々 の Cm a x 及 び AUC0 - t の percent prediction of error
Fig. 12 Si mulated lumi nal concentration-time profiles in rat duodenum (red line) and time spent above a value 10-fold hi gher than t he IC5 0 value (TAIC) after the single oral
administration of (A) luseogliflozin (0.1 mg/kg) and (B) phlori zin (40 mg/ kg). The dashed lines represent a value 10-fold hi gher than the IC5 0 value for rSGLT1. The
TAIC of luseogliflozin in rats (9 min) was shorter than the Tma x of mi glitol in rats (28
mi n). On the other hand, the TAIC of phlorizi n in rats (75 min) was longer.
な お 、 上 述 の 静 脈 内 及 び 経 口 投 与 後 の 結 果 か ら 、 luseogliflozin と phlorizin の バ イ オ ア ベ イ ラ ビ リ テ ィ （ F） は そ れ ぞ れ 14.5% 及 び 0.4%で あ る こ と も 判 明 し た 。 ま た 、 今 回 の よ う に in silico で の 予 測 パ ラ メ ー タ を 使 用 し て 予 測 し た Tm a x や Cm a xが 実 測 値 と 符 合 し な い 場 合 は 、著 者 ら が Amidon ら の 報 告 を も と に 行 っ た よ う に 、 Ka 値 の 実 験 値 か ら Pe f f値 を 算 出 す る 方 法 は 有 用 で あ る と 考 え ら れ た 。
2-2-2-3 ラット腸管吸収における薬物‐薬物間相互作用ポテンシャルの予
測
第 1 節 で 検 討 の 結 果 、 ラ ッ ト に miglitol を 経 口 投 与 後 の Tm a xは 28 min で あ った （ Table 16）。 Tm a xを miglitol の 吸 収 に 関 わ る 時 間 、 TAIC を 小 腸 内 で SGLT1 を
十 分 に 阻 害 す る 時 間 と み な し 、 そ の 割 合 （ TAIC/Tm a x (%)） を mi glitol の 吸 収 を
阻 害 し う る DDI ポ テ ン シ ャ ル の 指 標 と し た 。 そ の 結 果 、 ラ ッ ト に お け る
luseogliflozin の TAIC/Tma x (%)の 結 果 は 、32%で あ り 、DDI の ポ テ ン シ ャ ル は 低 い
と 考 え ら れ た 。 一 方 で 、 positive control と し て 用 い た phlorizin の TAIC/Tm a x (%)
は 100%よ り 高 く （ 268%）、 DDI ポ テ ン シ ャ ル は 高 い と 考 え ら れ た （ Table 19）。 9 min << 28 min (Tmaxof miglitol in rats)
TAIC: 9 min
TAIC: 75 min
75 min >> 28 min (Tmaxof miglitol in rats)
Table 19 Related parameters for the prediction of drug-drug interaction potential
Luseogliflozin in rats Phlorizin in rats Luseogliflozin in humans
10-fold of SGLT1 IC50(µg/mL) 3.89 2.75 12.6
Dose 0.1 mg/kg 40 mg/kg 5 mg/man
Tmaxof miglitol (min) 28 28 83
TAIC (min) 9 75 14
TAIC/Tmax (%) 32 268 17
TAIC, time spent above a value 10-fold higher than the IC50value; also shown in Figure 12 and Figure 15.
2-2-2-4 予測結果の妥当性の検証
ラットにおける薬物‐薬物間相互作用試験
ラ ッ ト に miglitol（ 1.5 mg/kg）を luseogliflozin（ 0.1 mg/kg）ま た は phlorizin（ 40 mg/ kg）と 併 用 経 口 投 与 後 の 血 漿 中 薬 物 濃 度 ‐ 時 間 プ ロ フ ァ イ ル を Fig. 13 に 示 す ｡ Luseogliflozin と 併 用 投 与 後 15 min ま で の mi glitol の 血 漿 中 濃 度 は 、mi glitol 単 剤 投 与 時 に 比 べ 若 干 低 い 傾 向 は あ っ た も の の 、 Cm a x と AUC0 - t に は 差 が な く 、
luseogliflozin は mi gl itol の 吸 収 を 著 し く 阻 害 す る よ う な こ と は な か っ た （ Fi g. 13(A)）。 Mi glitol 単 剤 投 与 時 に 対 す る luseogliflozin と の 併 用 時 の PK パ ラ メ ー タ （ Cm a x, AUC0 - t） の 90% 信 頼 区 間 は 0.8–1.25 内 で あ り 、 luseogliflozin は miglitol
と 併 用 し た 場 合 、miglitol の 体 内 動 態 に 大 き な 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た（ Table 20）。 一 方 で 、phlorizin と 併 用 し た 場 合 、投 与 後 1 h ま で の 血 漿 中 miglitol 濃 度 は 単 剤 投 与 時 に 比 べ 低 く 推 移 し た （ Fig. 13 (B)）。 Miglitol 単 剤 投 与 時 に 対 す る phlorizin と の 併 用 時 の Cm a xの 90% 信 頼 区 間 は 0.23–0.72 で あ り 、0.8–1.25 か ら 逸 脱 し た 。
Fig. 13 Plasma levels of mi glitol in rats following the oral administration of mi glitol alone (1.5 mg/ kg, red line) or in combi nation with concomit ant agents. ( A) Combination with luseogliflozin (0.1 mg/ kg, blue line). (B) Combination with phlorizin (40 mg/ kg, green line). The closed circles and triangles represent the observed mean data ± S.D. (n = 6).
Table 20 Summary of statistical analysis of miglitol pharmacokinetics parameters in rats
Combination Parameter
Ratio of geometric mean
Point estimate
90% CI
(combination/miglitol alone)
Lower Upper
Miglitol and luseogliflozin Cmax 0.97 0.85 1.09
AUC0-t 1.12 1.04 1.20
Miglitol and phlorizin Cmax 0.41
*
0.23* 0.72*
AUC0-t 0.63* 0.38* 1.02
90% CI, 90% confidence interval.
*The 90% CIs of the ratio (combination / miglitol alone) was outside the range of 0.8–1.25.
2-2-3 小括
本 節 で は 、 ラ ッ ト 腸 管 に お け る SGLT1 阻 害 剤 の TAIC を シ ミ ュ レ ー ト し 、 そ の TAIC が miglitol の Tma xに 占 め る 割 合 を 指 標 に DDI ポ テ ン シ ャ ル を 予 測 す る ス
ト ラ テ ジ ー を 考 案 し た 。 本 法 に よ り 予 測 し た 結 果 と 実 際 の ラ ッ ト DDI 試 験 の 結 果 が 符 合 し た こ と に よ り 、 著 者 ら が 考 案 し た 予 測 法 の 妥 当 性 が 確 認 さ れ た 。 P la s m a c o n c e n tr a ti o n o f m ig li to l (n g /m L ) P la s m a c o n c e n tr a ti o n o f m ig li to l (n g /m L ) Time (h) Time (h)
A
B
0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 Miglitol aloneCombination with phlorizin
0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 Miglitol alone
第 3 節 ヒト腸管吸収における薬物‐薬物間相互作用ポテンシャルの評価
ラ ッ ト に お け る miglitol の Tma xと luseogliflozin も し く は phlorizin の TAIC を
用 い た DDI の 予 測 が in vivo で の DDI 試 験 の 結 果 と 符 合 し 、本 予 測 方 法 の 妥 当 性 を 確 認 で き た こ と か ら 、 ヒ ト に お い て も 同 様 の 方 法 を 用 い て 予 測 を 試 み た 。
2-3-1 実験方法
標準物質及び試薬
Miglitol の 10.0 mg を 正 確 に 量 り 、メ タ ノ ー ル に 溶 解 し た 後 、正 確 に 10 mL と し て 1 mg/mL の 標 準 原 液 を 調 製 し た 。 こ の 標 準 原 液 を 適 宜 水 で 希 釈 し て 、 一 連 の mi glitol 標 準 溶 液 （ 25 ng/ mL～ 15000 ng/ mL ） を 調 製 し た 。 IS 標 準 溶 液 は 10.0 mg を 正 確 に 量 り 、メ タ ノ ー ル に 溶 解 し た 後 、正 確 に 100 mL と し て 100 µg/mL の IS 原 液 を 調 製 後 、 こ の IS 原 液 を さ ら に 水 で 希 釈 し 、 500 ng/mL の IS 溶 液 を 調 製 し た 。 こ れ ら の 標 準 溶 液 は い ず れ も 4℃ で 保 存 し た 。 試 薬 は 前 節 に 準 じ た 。生体試料
ブ ラ ン ク 血 漿 検 量 線 や QC 試 料 の 調 製 に 使 用 し た ヒ ト ブ ラ ン ク 血 漿 は コ ー ジ ン バ イ オ 株 式 会 社 よ り 購 入 し た 。GastroPlus
TMを用いた腸管における TAIC の算出
算 出 方 法 は 前 節 に 準 じ た 。 ヒ ト 固 有 の 対 応 及 び 入 力 に つ い て は 下 記 に 示 す 。 1） Effecti ve per meability（ Pe f f） 値 の 算 出（ CL/F、 Vc/F、 k1 2、 k2 1） は 、 経 口 投 与 後 の 血 漿 中 濃 度 ‐ 時 間 デ ー タ に フ ィ ッ
テ ィ ン グ す る こ と に よ り 収 集 し た 。
3） 肝 臓 と 小 腸 の 初 回 通 過 効 果 （ first -pass effects: FPE） の 算 出
ヒ ト に お い て は PK パ ラ メ ー タ （ CL/F、 Vc/F） に F 関 連 パ ラ メ ー タ が 含 ま れ る た め 、 FPE 値 は ゼ ロ を 入 力 し た 。 4) 小 腸 に お け る TAIC の 算 出 Table 17 に 示 し た 、算 出 し た パ ラ メ ー タ の 妥 当 性 は 、シ ミ ュ レ ー ト し た 血 漿 中 薬 物 濃 度 ‐ 時 間 プ ロ フ ァ イ ル と 実 測 値 の “goodness-of-fit”（ 良 く 合 致 す る こ と ） を 確 認 す る こ と に よ り 検 証 し た 。 そ の 後 、 DDI の ポ テ ン シ ャ ル を 予 測 す る た め 、小 腸 に お け る 濃 度 推 移 の シ ミ ュ レ ー シ ョ ン を 実 行 し た 。ヒ ト に お い て は 、 SGLT1 は 主 に 小 腸 に 発 現 し て い る こ と 6 7 ) 以 外 の 報 告 は な い こ と か ら 、十 二 指 腸 、 空 腸 、 回 腸 に お け る 薬 物 濃 度 を シ ミ ュ レ ー ト し た 。
ヒトにおける PK 及び相互作用試験
本 治 験 は 「 ヘ ル シ ン キ 宣 言 」 に 基 づ く 倫 理 的 原 則 、「 薬 事 法 第 14 条 第 3 項 お よ び 第 80 条 の 2」 に 規 定 す る 基 準 お よ び 平 成 9 年 3 月 27 日 付 厚 生 省 令 第 28 号 「 医 薬 品 の 臨 床 試 験 の 実 施 の 基 準（ GCP）に 関 す る 省 令 」を 遵 守 し て 実 施 さ れ た 。 治 験 責 任 医 師 は 、本 治 験 実 施 計 画 書 お よ び 症 例 報 告 書 の 内 容 な ら び に そ の 遵 守 に つ い て 治 験 依 頼 者 と 合 意 し た 上 で 、 本 治 験 を 実 施 し た 。 ま た 、 治 験 実 施 計 画 は 、 大 正 製 薬 株 式 会 社 の 臨 床 試 験 審 査 委 員 会 （ IRB） 及 び 医 療 法 人 平 心 会 OCROM ク リ ニ ッ ク の IRB の 承 認 を 事 前 に 得 た 。 本 治 験 に お い て 、 miglitol（ 50 mg 錠 ） も し く は luseogliflozin（ 5 mg 錠 ） を 日 本 人 健 康 成 人 男 性 12 例 に 投 与 し 、 そ の 結 果 よ り 各 々 の PK パ ラ メ ー タ を 収 集 し た 。 相 互 作 用 試 験 は 、 miglitol と luseogliflozin の 単 回 併 用 投 与 後 の PK を 把 握 す る た め に 実 施 し た 。 採 血 は pre 及 び 投 与 後 0.25、 0.5、 1、 1.5、 2、 3、 4、 6、 8、 12、24 h に 行 い 、血 漿 分 離 し た 後 、LC-MS/ MS に よ る 分 析 ま で -80°C で 保 管 し た 。TAIC/T
maxの算出
算 出 法 は 前 節 に 準 じ た 。ヒト血漿中 miglitol 濃度
2-3-2 結果及び考察
本 予 測 方 法 の 妥 当 性 が ラ ッ ト の 実 験 に て 検 証 さ れ た こ と か ら 、同 様 に し て ヒ ト に お け る 予 測 を 試 み た （ Fig. 14）。2-3-2-1 Luseogliflozin をヒトに経口投与後の腸管内 TAIC の算出
予 測 に 使 用 し た パ ラ メ ー タ は Table 17 に 示 し た 。 ヒ ト に お け る Pe f f 値 は 27.5 cm/s x 104で あ り 、 PK パ ラ メ ー タ （ CL/F、 Vc/F、 k1 2、 k2 1） は 経 口 投 与 後 の 実 測 値 を 、AIC に よ り 最 も 良 好 に フ ィ ッ ト し た 2-コ ン パ ー ト メ ン ト モ デ ル に 当 て は め 、 算 出 し た（ Fig. 14 (A)）。GastroPlusT Mを 用 い て ヒ ト に お け る 血 漿 中 薬 物 濃 度 ‐ 時間 プ ロ フ ァ イ ル を 予 測 し た と こ ろ 、Cm a x 及 び AUC0 - t の percent prediction of error
（ simulated/observed） が ±20%以 内 で あ っ た こ と か ら 、 シ ミ ュ レ ー ト し た 値 と 実 測 値 は よ く 符 合 し て い る こ と が 確 認 さ れ た （ Fig. 14 (B)）。
Fig. 14 Plasma concentration time profiles for luseogliflozin i n humans. The closed circles represent the mean obser ved data + S.D. (n = 12).
(A) Two-compart ment model -fitted profiles in humans after the single intravenous administration of luseogliflozin (5 mg/ man) . The solid line was fitted using a nonlinear least -squares regression anal ysis. The PK parameters (CL/ F, Vc/F, k1 2, k2 1)
こ れ に よ り 、入 力 パ ラ メ ー タ の 妥 当 性 が 確 認 さ れ 、ヒ ト に お け る luseogliflozin の PK プ ロ フ ァ イ ル は ACAT モ デ ル で 良 好 に 表 現 で き て い る と 考 え ら れ た 。そ こ で 、 本 条 件 下 で の 腸 管 に お け る luseogliflozin の 薬 物 濃 度 ‐ 時 間 プ ロ フ ァ イ ル を も と に TAIC を 見 積 も っ た と こ ろ 、 14 min で あ っ た （ Fig. 15）。
Fig. 15 Si mulated lumi nal concentration-ti me profiles in human duodenum (red line), upper j ej unum ( green line), and ti me spent above a value 10-fold higher than the IC5 0 value (TAIC) after the single oral administration of luseogliflozin (5
mg/ man). The dashed l ine represents a value 10-fold higher than the IC5 0 value for
SGLT1. The TAIC of l useogliflozin in humans (14 min) was shorter than the Tm a x of
mi glitol in humans (83 min).
2-3-2-2 ヒト腸管吸収における薬物‐薬物間相互作用ポテンシャルの予測
ヒ ト に miglitol を 経 口 投 与 後 の Tm a xは 83 min、TAIC は 14 min で あ り 、そ の 割
合（ TAIC/Tm a x (%)）は 、17%で あ っ た 。こ の 値 は 阻 害 が 起 こ ら な か っ た ラ ッ ト の
32%よ り さ ら に 低 い こ と か ら （ Table 19）、 ヒ ト に お い て luseogliflozin は mi glitol の 吸 収 を 阻 害 し な い と 考 え ら れ た 。 Time (h) L u m in a l c o n c e n tr a ti o n o f lu s e o g lif lo z in (μ g /m L ) 10-fold of IC50value 12.6 μg/mL
14 min << 83 min (Tmaxof miglitol in humans)
2-3-2-3 予測結果の妥当性の確認
ヒトにおける薬物‐薬物間相互作用試験
ヒ ト に miglitol（ 50 mg 錠 ） と luseogliflozin（ 5 mg 錠 ） を 各 々 1 錠 ず つ 併 用 経 口 投 与 後 の 血 漿 中 薬 物 濃 度 推 移 を Fig. 16 に 示 す ｡ Miglitol 単 剤 経 口 投 与 後 の 平 均 血 漿 中 miglitol 濃 度 は 、 luseogliflozin と の 併 用 経 口 投 与 後 と 良 好 に 一 致 し 、 luseogliflozin は mi glitol の PK パ ラ メ ー タ に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た 。Fig. 16 Plasma level s of mi glitol in humans following the oral administration of mi glitol alone (50 mg/ man, red line) or i n combination with l useogliflozin (5 mg/ man, blue line). The closed circles and triangles represent the observed mean data ± S.D. (n = 12).
一 方 、ipragliflozin は luseogliflozin と 同 様 に 新 規 の SGLT2 選 択 的 阻 害 薬 で あ る が 、miglitol 単 剤 投 与 時 に 対 す る ipragliflozin と の 併 用 時 の PK パ ラ メ ー タ（ Cm a x、
AUCi n f） の 90% 信 頼 区 間 は 、 各 々 0.761（ 90% CI: 0.672–0.861） 及 び 0.796（ 90%
CI: 0.719–0.881）で あ り 、ipragliflozin は mi glitol の 吸 収 を 低 下 さ せ た と 報 告 さ れ て い る （ www.info.pmda.go.jp/downfiles/ph/PDF/800126_3969018F1022_1_01.pdf ）。 こ の 報 告 を も と に ipragliflozin と miglitol の DDI ポ テ ン シ ャ ル に つ い て 、著 者 ら の 考 案 し た DDI の 予 測 法 を 使 用 し て 、公 開 さ れ た hSGLT1 に 対 す る IC5 0値（ 1876
nM）6 9）及 び ヒ ト の PK デ ー タ 7 0 ) を 用 い て レ ト ロ ス ペ ク テ ィ ブ に 解 析 し た と こ ろ 、 TAIC/Tm a x は 116％ で あ り 、 ipragliflozin は miglitol の 吸 収 を 阻 害 し う る と い う 結
果 が 得 ら れ た 。 以 上 よ り 、 著 者 ら が 考 案 し た SGLT1 を 介 し た miglitol の 吸 収 過 程 に 対 す る 併 用 薬 の DDI ポ テ ン シ ャ ル の 予 測 法 に よ っ て 、 阻 害 し な い 場 合 の み な ら ず 、 阻 害 す る 場 合 も 正 確 に 予 測 が 可 能 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 P la s m a c o n c e n tr a ti o n o f m ig lit o l (n g /m L ) Time (h) 0 300 600 900 1200 1500 0 4 8 12 Miglitol alone
の 算 出 、④ miglitol の Tma xに 対 す る TAIC の 割 合 を も と に DDI ポ テ ン シ ャ ル を 評 価 す る 、 と い う も の で あ る 。 ま ず 、第 １ 節 で は 第 １ 章 で 考 案 し た 知 見 を も と に 、ラ ッ ト 血 漿 中 の 極 め て 微 量 な miglitol の 定 量 法 を 開 発 し た 。さ ら に 、そ の 定 量 法 を 用 い て DDI ポ テ ン シ ャ ル 予 測 法 構 築 に 必 要 な miglitol の ラ ッ ト PK プ ロ フ ァ イ ル を 収 集 し た 。 第 ２ 節 で は 、 第 １ 節 で 明 ら か に し た ラ ッ ト に お け る miglitol の PK プ ロ フ ァ イ ル を ベ ー ス に 、DDI ポ テ ン シ ャ ル の 予 測 法 を 考 案 し 、そ の 妥 当 性 を 検 証 し た 。す な わ ち 、ま ず GastroPlusT M を 用 い て ラ ッ ト 腸 管 に お け る SGLT1 阻 害 剤（ 併 用 薬 ） の TAIC を シ ミ ュ レ ー ト し 、そ の TAIC が miglitol（ TP を 介 し て 吸 収 さ れ る 薬 物 ） の Tm a xに 占 め る 割 合 を 指 標 に DDI ポ テ ン シ ャ ル を 予 測 す る ス ト ラ テ ジ ー を 考 案
し た 。 さ ら に そ の 予 測 結 果 の 妥 当 性 を 、 実 際 の ラ ッ ト in vivo 併 用 試 験 の 結 果 と 照 合 す る こ と に よ り 検 証 し た 。
掲載論文
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