ラット腸管吸収における薬物‐薬物間相互作用ポテンシャル予測法の開発

本 節 で は 、 第 １ 節 で 収 集 し た miglitol の ラ ッ ト PK プ ロ フ ァ イ ル を も と に 、 miglitolの 吸 収 が luseogliflozinの 併 用 に よ っ て 阻 害 さ れ る か ど う か の 検 討 を モ デ ル ケ ー ス と し て 、 ダ イ ナ ミ ッ ク モ デ ル （ACAT､GastroPlus^{T M}） を 用 い た 評 価 法 を 構 築 し 、 そ の 妥 当 性 を 検 証 し た 。

2-2-1 実験方法 標 準 物 質 及 び 試 薬

Luseogliflozin ((1S)-1,

5-anhydro-1-[5-(4-ethoxybenzyl)-2-methoxy-4-methylphenyl]-1-thio-D-glucitol)、

2H5-luseogliflozin は 大 正 製 薬（ 株 ）で 合 成 し た も の を 用 い た 。Phlorizinは Toronto Research Chemicals Inc.（North York, Ontario, Canada） か ら 購 入 し た （Fig. 9）。

Miglitol 及 び ²H4-miglitol は 前 章 と 同 様 の も の を 使 用 し た 。

Methyl-α-D-glucopyranoside (α-MG) 及 び [^{1 4}C] α-MG は そ れ ぞ れ Sigma-Aldrich

（St. Louis, MO） 及 び PerkinElmer（Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 そ の 他 の 試 薬 及 び 溶 媒 は 市 販 の 特 級 品 ま た は HPLC用 を 用 い た 。

Fig. 9 Chemical structures of luseogliflozin (A), phlorizin (B), and miglitol (C).

N OH

OH O

H OH

OH

O

OH O

H OH

O

H O

O

H OH

O

OH

(A) Luseogliflozin (B) Phlorizin (C) Miglitol

Me OEt S

MeO

OH O

H OH

O H

生 体 試 料

ブ ラ ン ク 血 漿

検 量 線 や QC 試 料 の 調 製 に 使 用 し た ラ ッ ト 血 漿 は Charles River Laboratories Japan （Kanagawa, Japan） よ り 購 入 し た 。

SGLT1 に 対 す る 阻 害 作 用

American Type Culture Collection（ATCC, Rockville, MD） か ら 入 手 し た チ ャ イ ニ ー ズ ハ ム ス タ ー 卵 巣 由 来 CHO-K1 細 胞 に 、 ヒ ト SGLT1（hSGLT1; Genbank Accession number, NM_000343） プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー （pcDNA3.1/Hygro(+)） を 安 定 導 入 し た 。ヒ ト SGLT1 発 現 細 胞 を 、10%ウ シ 胎 児 血 清 、250 μg/mL Hygromycin を 含 む F-10 培 地 で 2 日 間 培 養 し た 。ア フ リ カ ミ ド リ ザ ル 腎 臓 由 来 COS-7 細 胞 は ATCC よ り 入 手 し 、 遺 伝 子 導 入 の 前 日 ま で 10%ウ シ 胎 児 血 清 を 含 む Dulbecco's Modified Eagle's Medium 培 地 に て 96 ウ ェ ル プ レ ー ト 内 で 培 養 し た 。COS-7 細 胞 に ラ ッ ト SGLT1（rSGLT1）プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を 一 過 性 導 入 し 、1 日 培 養 し た 。

hSGLT1 ま た は rSGLT1 発 現 細 胞 を 、前 処 理 用 緩 衝 液（140 mM Choline chloride, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5 mM Tris, pH 7.2–7.4） に 37℃ 下 で 20分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 、α-MG（[^{1 4}C]-α-MG、α-MG 混 液 ） 及 び 複 数 の 濃 度 の 試 験 物 質 ま た は 溶 媒（DMSO）を 含 む 反 応 用 の 緩 衝 液（140 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5 mM Tris, pH 7.2–7.4） に 37℃ 下 で 20ま た は 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。本 操 作 は ト リ プ リ ケ ー ト に て 実 施 し た 。Sodium/glucose cotransporter の 基 質 で あ る α-MG濃 度 は 、hSGLT1評 価 に お い て 1 mM、rSGLT1 の 評 価 に お い て 500 μΜに 設 定 し た 。細 胞 内 取 り 込 み 試 験 を 開 始 し た 後 、10 mM の α-MGを 含 む 前 処 理 用 緩 衝 液 に て 2 回 細 胞 を 洗 浄 す る こ と に よ り 反 応 終 了 と し た 。 さ ら に 細 胞 を 0.25 M の NaOH で 溶 解 し た 。 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ た 放 射 標 識 体 は 液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー に よ り 測 定 し た 。 ま た 、 ナ ト リ ウ ム 非 依 存 的 な 細 胞 内 取 り 込 み 量 は 、α-MG 及 び 溶 媒 （DMSO） を 含 む ナ ト リ ウ ム 不 含 反 応 用 緩 衝 液 （140 mM Choline Chloride, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5 mM Tris, pH 7.2–7.4） を 用 い て 評 価 し た 。 ナ ト リ ウ ム 依 存 的 な α-MG の 細 胞 内 取 り 込 み は 反 応 用 緩 衝 液 に て 評 価 し た 際 の 細 胞 内 放 射 能 量 か ら ナ ト リ ウ ム 不 含 反 応 用 緩 衝 液 で の 放 射 能 量 を 差 し 引 く こ と で 算 出 し た 。IC5 0 値 は SAS 8.2（SAS Institute Inc.） を 用 い て 算 出 し た 。

GastroPlus

^TM

を 用 い た 腸 管 に お け る IC

50

値 の 10 倍 超 え る 濃 度 の 持 続 時 間 （ Time Spent Above a Value 10-fold higher than the IC

50

Value ： TAIC ） の 算 出

腸 管 濃 度 の シ ミ ュ レ ー シ ョ ン に は 、GastroPlus^{T M}（Simulation Plus Inc., Lancaster, CA）Ver.8、ACAT モ デ ル ^{6 1 )} を 使 用 し た 。ACAT モ デ ル は 、Yu^{6 2）}ら が 開 発 し た Compartmental Absorption and Transit（CAT） モ デ ル を 、Advanced Compartmental Absorption and Transit（ACAT）モ デ ル と し て 発 展 さ せ た シ ミ ュ レ ー シ ョ ン ソ フ ト ウ ェ ア で 、 経 口 投 与 製 剤 の 腸 管 内 の 挙 動 、 薬 物 の 血 中 移 行 を 解 析 ・ 予 測 で き る 。

Luseogliflozinとpositive control と し て 使 用 し た phlorizinの 腸 管 に お け る TAIC は 、 以 下 の フ ロ ー に 従 っ て 算 出 し た 。

1) Effective permeability（Pe ff） 値 の 算 出

吸 収 速 度 定 数 (Ka) は 、GastroPlus^{T M} の PKPlus^{T M}モ ジ ュ ー ル を 使 用 し 、ラ ッ ト に luseogliflozinを 経 口 投 与 後 の 血 漿 中 濃 度 ‐ 時 間 デ ー タ を 2-コ ン パ ー ト メ ン ト モ デ ル で 解 析 す る こ と に よ っ て 算 出 し た 。ラ ッ ト に お け る phlorizinの Ka 値 に つ い て も 同 様 に し て 算 出 し た 。Pe ff値 は 下 記 の 式(1) ^{6 3 )} に し た が っ て 算 出 し た 。

（1）

V; 管 腔 体 積, S; 表 面 積, r; 管 腔 直 径 （ ラ ッ ト ： 0.18 cm ^{6 4）}）

2) Fraction absorbed value（Fa） と PK パ ラ メ ー タ の 算 出

Fa 値 は 、化 合 物 の 構 造 式 及 び 関 連 パ ラ メ ー タ（ 投 与 形 態 、投 与 量 、溶 解 性 、 拡 散 係 数 、 粒 子 径 透 過 性 ） を GastroPlus^{T M}に 入 力 す る こ と に よ り 予 測 し た 。 投 与 形 態 は 錠 剤 で は な く 、 溶 液 も し く は 懸 濁 液 の た め 、 胃 の ト ラ ン ジ ッ ト 時 間 は 推 奨 値 の 0.1 h を 入 力 し た 。Luseogliflozin と phlorizin の ラ ッ ト に お け る PK パ ラ メ ー タ （CL、V_c、k1 2、k2 1） は PKPlus^{T M} を 用 い て 静 脈 内 投 与 後 の 血 漿 中 濃 度 ‐ 時 間 デ ー タ に フ ィ ッ テ ィ ン グ す る こ と に よ り 取 得 し た 。 ヒ ト に お け る luseogliflozin の PK パ ラ メ ー タ（CL/F、Vc/F、k1 2、k2 1）は 、経 口 投 与 後 の 血 漿 中 濃 度 ‐ 時 間 デ ー タ に フ ィ ッ テ ィ ン グ す る こ と に よ り 取 得 し た 。な お 、 フ ィ ッ テ ィ ン グ に お い て は 、 赤 池 ら に よ っ て 提 唱 さ れ た Akaike information criterion（AIC）^{6 5 )} を 指 標 に 、 最 も 適 切 な コ ン パ ー ト メ ン ト モ デ ル を 選 択 し た 。

2 Ka r S Ka V

P_eff    

3) 肝 臓 と 小 腸 の 初 回 通 過 効 果 （first-pass effects: FPE） の 算 出

肝 臓 に お け る 初 回 通 過 効 果 （FPE Liver(%)） と 小 腸 に お け る 初 回 通 過 効 果

（FPE Intestinal(%)） は 下 記 の よ う に 見 積 も っ た 。 FPE Liver(%): (1-Fh)×100

FPE Intestinal(%): (1-Fg)×100

Fh; hepatic availability, Fg; intestinal availability

腎 ク リ ア ラ ン ス の 寄 与 は 無 視 で き る と 仮 定 し 、 肝 ク リ ア ラ ン ス を 全 身 ク リ ア ラ ン ス と 同 等 と 設 定 し た 。 ラ ッ ト に お け る luseogliflozin と phlorizin の Fh と Fg値 は 以 下 の 式 （2） 及 び （3） に よ り 算 出 し た 。

Fh = 1 - (CL / Rb) / Qh （2）

Fg = F / (Fa × Fh) （3）

肝 血 流 量 （Qh）；4.2 L/h/kg ^{6 6 )}

Fa; fraction absorbed value, Rb; blood/plasma ratio

な お 、 ヒ ト に お い て は PK パ ラ メ ー タ （CL/F、Vc/F） に F 関 連 パ ラ メ ー タ が 含 ま れ る た め 、FPE 値 は ゼ ロ を 入 力 し た 。

4) 小 腸 に お け る TAIC の 算 出

Table 17 に 示 し た 、 算 出 し た パ ラ メ ー タ の 妥 当 性 は 、 シ ミ ュ レ ー ト し た 血 漿 中 薬 物 濃 度 ‐ 時 間 プ ロ フ ァ イ ル と 実 測 値 の“goodness-of-fit”（ 良 く 合 致 す る こ と ） を 確 認 す る こ と に よ り 検 証 し た 。 そ の 後 、DDIの ポ テ ン シ ャ ル を 予 測 す る た め 、 小 腸 に お け る 濃 度 推 移 の シ ミ ュ レ ー シ ョ ン を 実 行 し た 。 ラ ッ ト に お い て SGLT1は 主 に 小 腸 に 発 現 し て い る こ と ^{6 7 )}、さ ら に miglitol は 十 二 指 腸 で ほ ぼ 完 全 に 吸 収 さ れ る ^{3 7）}こ と か ら 、十 二 指 腸 に お け る 薬 物 濃 度 を シ ミ ュ レ ー ト し 、TAICを 算 出 し た 。ヒ ト に お い て は 、SGLT1は 主 に 小 腸 に 発 現 し て い る こ と ^{3 9 )} 以 外 の 報 告 は な い こ と か ら 、十 二 指 腸 、空 腸 、回 腸 に お け る 薬 物 濃 度 を シ ミ ュ レ ー ト し た 。

ラットにおける PK 及び DDI 試験

す べ て の 動 物 飼 育 及 び 実 験 は 大 正 製 薬 株 式 会 社 の 動 物 実 験 に 関 す る 規 程 及 び Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments（ 日 本 学 術 会 議 ） に 従 っ て 行 っ た 。

の SGLT1を 完 全 に 阻 害 す る こ と が 見 込 め る 過 剰 濃 度 に 設 定 し た 。静 脈 内 投 与 は 、 RC2 Rodent Anesthesia System（VetEquip, Inc., Pleasanton, CA） を 使 用 し 、3％ イ ソ フ ル ラ ン 麻 酔 、 酸 素 流 速 0.5–1 L/min の 条 件 下 で 頸 静 脈 よ り 実 施 し た 。 経 口 投 与 は 胃 ゾ ン デ を 用 い て 実 施 し た 。 採 血 は 投 与 後 0.83、0.25、0.5、1、2、4、8、 24 h に 尾 静 脈 よ り 行 い 、血 漿 分 離 し た 後 、LC-MS/MS に よ る 分 析 ま で-80°C で 保 管 し た 。

38

Table 17 Input parameters for GastroPlus^TMthat were used to simulate the luminal concentrations

Property Luseogliflozin in rats Phlorizin in rats Luseogliflozin in humans

Input data Reference/Remarks Input data Reference/Remarks Input data Reference/Remarks

Physicochemical parameters

Molecular Formula C23H30O6S - C21H24O10 - C23H30O6S

-Molecular Weight (g/mol) 434.55 - 436.42 - 434.55

-Reference logP (@pH) 2.2 (-1) In-house data 0.25 (-1) Estimated by

ADMET Predictor^TM 2.2 (-1) In-house data

Dosage Form IR: Solution - IR: Suspension - IR: Tablet

-Initial Dose (mg) 0.03 - 12 - 5

-Dose Volume (mL) 2 - 2 - 250

-Solubility

(mg/mL @pH=6.57) 0.0771 In-house data 9.27

(mg/mL@pH=4.49)

Estimated by

ADMET Predictor^TM 0.0771 In-house data

Diff. Coeff. (cm²/s x 10⁵) 0.60 Estimated by

ADMET Predictor^TM 0.64 Estimated by

ADMET Predictor^TM 0.60 Estimated by

ADMET Predictor^TM

Mean Particle Radius (μm) 3.03 In-house data 25.0 Default value 1.22 In-house data

Peff (cm/s x 10⁴) 6.23 Estimated from Ka 0.558 Estimated from Ka 27.5 Estimated from Ka

Gut Physiology

Physiology Rat-fasted

The stomach transit time was changed to 0.1 h.

Rat-fasted The stomach transit time

was changed to 0.1 h. Human-fasted

-ASF Model Opt logD Model

SA/V6.1 - Opt logD Model

SA/V6.1 - Opt logD Model

SA/V6.1

-Pharmacokinetic parameters

Body Weight (kg) 0.30 - 0.30 - 60

-FPE Intestinal 45.7 Estimated 98.8 Estimated 0

-FPE Liver 73.3 Estimated 65.4 Estimated 0

-Blood/plasma

Concentration Ratio 0.536 In-house data 0.930 Estimated by

ADMET Predictor^TM 0.599 In-house data

Use Exp Plasma Fup (%) 5.40 In-house data 6.71 Estimated by

ADMET Predictor^TM 4.00 In-house data

Renal Clearance (L/h/kg) 0 - 0 - 0

-model 2-compartment - 2-compartment - 2-compartment

-CL (L/h) 0.495

Fitted from

0.766

Fitted from

CL/F (L/h) 2.83

Fitted from

V(L/kg) 1.21 0.877 Vc/F (L/kg)

Table 18 Dose regimens and formulations in the pharmacokinetic and interaction studies in rats

Study Compound Route N Dose Conc.

Vehicle Formulation (mg/kg) (mg/mL)

Pharmacokinetics

Luseogliflozin iv 3 0.1 0.1 10% HP-β-CD solution

Phlorizin iv 3 4 4 PEG400/

Saline (4:6,v/v) solution Luseogliflozin po 6 0.1 0.015^a 0.5% CMC-Na solution

Phlorizin po 6 40 6 0.5% CMC-Na suspension

Interaction

Miglitol alone po 6 1.5 0.225^a 0.5% CMC-Na solution Combination Miglitol

po 6 1.5 0.225^a

0.5% CMC-Na solution

Luseogliflozin 0.1 0.015^a

Combination Miglitol

po 6 1.5 0.225^a

0.5% CMC-Na suspension

Phlorizin 40 6

N, number of animals; 10% HP-β-CD, 10% hydroxy propyl β cyclodextrin; PEG400, polyethlene glycol 400;

CMC-Na, carboxy methyl cellulose sodium.

aThe concentration values were set based on those clinical dose regimens.

TAIC/T

_max

の算出

小 腸 に お け る luseogliflozin 及 び phlorizin の TAIC が mi glitol の Tma xに 占 め る 割 合（ ％ ）は 以 下 の 式（4）に よ り 算 出 し た 。本 研 究 で は 、こ の TAIC/Tm a x （ ％ ） を DDI を 引 き 起 こ す ポ テ ン シ ャ ル の 指 標 と し た 。

（4）

装置及び測定条件

ラ ッ ト 血 漿 中 mi glitol 濃 度 の 測 定 に つ い て は 、装 置 及 び 測 定 条 件 と も に 前 節 に 準 じ た 。Luseogliflozi n 及 び phlorizin 濃 度 の 測 定 は mi glitol の 定 量 で 用 い た 装 置 を 使 用 し 、 測 定 条 件 に つ い て は 以 下 の と お り に 設 定 し た 。 分 析 カ ラ ム は Inertsil ODS-3 column（2.1 mm I.D.  50 mm, 5-µm particle size; GL Science, Tokyo, Japan）

を 用 い 、移 動 相 は 1 mmol/L 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム と ア セ ト ニ ト リ ル を グ ラ ジ ュ エ ン ト モ ー ド で 使 用 し た 。 検 出 モ ー ド は 負 イ オ ン モ ー ド で 、l useogliflozin は m/z 433 → m/z 104 を 、phlorizin は m/z 435 → m/z 273 を モ ニ タ ー し た 。

標準溶液の調製

Miglitol に つ い て は 前 節 に 準 じ た 。Luseogliflozin は 10 mg を 正 確 に 量 り 、メ タ ノ ー ル に 溶 解 し た 後 、 正 確 に 100 mL と し て 100 µg/ mL の 標 準 原 液 を 調 製 し た 。 こ の 標 準 原 液 を 適 宜 メ タ ノ ー ル で 希 釈 し て 、 一 連 の luseoglifl ozin 標 準 溶 液 （0.2

～500 ng/ mL） を 調 製 し た 。 は を 正 確 に 量 り 、 メ タ ノ ー ル に (%)

T 100 T TAIC / TAIC

max

max  

溶 解 し た 後 、正 確 に 10 mL と し て 100 µg/ mL の 標 準 原 液 を 調 製 し た 。こ の 標 準 原 液 を 適 宜 メ タ ノ ー ル で 希 釈 し て 、 一 連 の phlorizin 標 準 溶 液 （0.2 ng/ mL～500 ng/ mL）を 調 製 し た 。IS 標 準 溶 液 は 10 mg を 正 確 に 量 り 、メ タ ノ ー ル に 溶 解 し た 後 、 正 確 に 100 mL と し て 100 µg/ mL の IS 原 液 を 調 製 後 、 こ の IS 原 液 を さ ら に メ タ ノ ー ル で 希 釈 し 、100 ng/ mL の IS 溶 液 を 調 製 し た 。 こ れ ら の 標 準 溶 液 は い ず れ も 4℃ で 保 存 し た 。

添加血漿の調製

検 量 線 の 作 成 及 び バ リ デ ー シ ョ ン 試 験 用 の QC 試 料 は 、各 濃 度 の luseogliflozin ま た は phlorizin 標 準 溶 液 25 µL を 各 々 ラ ッ ト ブ ラ ン ク 血 漿 50 µL に 添 加 、 撹 拌 す る こ と に よ り 得 た （0.1～250 ng/ mL）。

検量線

検 量 線 は 、luseogliflozin ま た は phlorizin の 濃 度 が 0.1、0.3、1、5、10、50、100、

250 ng/ mL と な る よ う に 調 製 し た 8 種 の 添 加 血 漿 を 分 析 し 、添 加 血 漿 を x、IS（100 ng/ mL） に 対 す る luseogliflozin ま た は phlorizin の ピ ー ク 面 積 比 を y と し て 直 線 回 帰 す る こ と に よ り 得 た 。 重 み フ ァ ク タ ー は 1/x を 採 用 し た 。

前処理法

ラ ッ ト 血 漿 中 mi glitol の 前 処 理 は 前 節 に 準 じ た 。Luseogliflozi n 及 び phlori zin に つ い て は 以 下 の 方 法 で 前 処 理 を 行 っ た 。50 µL の ラ ッ ト 血 漿 に IS 溶 液 （100 ng/ mL）25 µL と 10 mmol/L の 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 溶 液 500 µL を 添 加 し 混 和 し た 。 活 性 化 及 び 平 衡 化 し た OASIS HLB cartridges（30 mg/1 cc; Waters, Milford, MA）

に サ ン プ ル を ロ ー ド し 、 洗 浄 後 、1 mL の メ タ ノ ー ル/酢 酸 （100:0.1, v/ v） を 添 加 し 、遠 心（preset values: 200×g, 4C, 1 mi n）し た 。溶 出 液 を 蒸 発 乾 固 し た 後 、100 µL の ア セ ト ニ ト リ ル/10 mmol/L 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 溶 液（20:80, v/ v）で 再 溶 解 し た 。 フ ィ ル タ ー ろ 過 し た ろ 液 15 µL を LC-MS/MS へ 注 入 し た 。

ドキュメント内 腸管吸収におけるトランスポーターを介した薬物-薬物間相互作用の予測に関する研究 (ページ 39-54)