変異 マ ウ ス血 液 中 の カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 と メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 の 関 係
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(2) 390. 小. 林. ア カ タ ラ セ ミア マ ウ ス の 血 液 は 蒸 留 水 で10倍 希 釈,ヒ. ポ カ タ ラ セ ミア マ ウ ス の 血 液 は100倍. 希 釈,ノ. ー マ ル マ ウ ス の 血 液 は250倍. 希 釈 して. グ ル タチ オ ンペ ル オキ シ ダー ゼ活 性度 測. 血 液 を2.5%ク. 2.測. 容 量 中 に集 め,遠. 分 離 し た 赤 血 球 を冷 生 食 水 で3回 の 赤 血 球 に冷 蒸 留 水4容. 3回 繰 り返 して 溶 血 し,終 のDrabkin試. 薬2倍. K3Fe(CN)6,. 洗 浄 後,. を 加 え て,凍. 1容. 結氷解 を. 濃度 を考慮 して等 容. 強 度 液(1.6mM. 23.8mM. 沈. KCN,. NaHCO3)を. 1.2. 混 合 し,. 試 料 溶 液 と し た. NADHジ. メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 の 測 定(図1):. Kampen法5)で. 液0.2mlを. 行 っ た.. 溶 解 試 薬10.0mlに. えて2分 2)残. 溶 か し,. ル に入 れ, 630nmで. 吸 光 度 を測 定 す る(E1).. 5%KCN. 40μlを 加. 後 同 じ波 長 で 測 光 す る(E2).. りの 約7mlの. 40μlを 加 え5分 し て(E3),さ. 溶 血 液 に, 後3.0mlを. ら にKCN. 5%K3Fe(CN)6 セ ル に取 り測 光. 40μlを 加 え2分. 反応. 後 再 度 測 光 す る(E4). 注) 3)総. 液: ン 酸 緩 衝 液‑生. 食水. 0.1Mリ. 血 球 を 亜 硝 酸 ナ ト リ ウ ム‑生. 食水. で メ トヘ モ グ ロ ビ ン と し,リ 水 で 充 分 洗 浄 後,処. ン 酸 緩 衝 液‑生. 理 赤 血 球1容. 食. に 対 し蒸 留 水. 19容 を 加 えて 溶 血 し, 3,000回 転 で7分. Fig.1. 定方法. そ の3.0mlを1.0cmセ. ア フ ォ ラー ゼ 活 性 度 測 定 用 溶 血. 血 液 をpH7.3, で 洗 浄 後,赤. の 上 清 を測 定 用. メ トヘ モ グ ロ ビ ン量 お よ び 総 ヘ モ グ ロ ビ ン量. 1)血. エ ン酸 ナ トリ ウム を含 む5%ポ. リ ビ ニ ル ピ ロ リ ド ン の5倍. 1‑4. 離 を 行 い 不 溶 成 分 を 除 去 し,こ 血 液 と し て 用 い た.. は, Van. 定 用 溶 血 液:. mM. 治. 2‑1. 用 い た. 1‑3. 弘. 間遠 沈 分. E2, E3, E4はE1同. ヘ モ グ ロ ビ ン量 は,. 溶 液 を蒸 留 水 で5倍. 様 吸 光 度 を示 す. (E4)の 測 定 を終 え た. 希 釈 し て541nmで. 吸 光. 度 を測 定 し,標 準 液 で 作 っ た 検 量 線 か ら求 め た. 4)計. 算. メ トヘ モ グ ロ ビ ン量 / 総 ヘ モ グ ロ ビ ン量(%)=E1‑E2/E3‑E4×100. Procedureof determiningmethemoglobin and totalhemoglobin concen trationinthe blood.
(3) 変異 マ ウ ス血 液 中 の カ タ ラー ゼ活 性 度 とメ トヘモ グ ロ ビ ン濃 度 の 関係 1). 2‑2 血 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 の測 定(図2): 血 液 カ タ ラー ゼ 活 性 度 は, Feinstein6)の. 過ホ. pH. M. 7.0, 0.05Mリ. GSH. ウ 素 酸 法 に よ り測 定 し た.. 1.0cmセ. 1)試. GSSG・R. 験 管 内 に1.5%過. pH. 6.8リ. 37℃. ホ ウ 素 酸 塩 液3.2mlと. ン 酸 緩 衝 液0.6mlを. の2種. は 蒸 留 水 を0.2ml,そ mlを. 加 え, 20℃. と. の 温 度 で保 温 しな が ら,盲 検 用 に. 加 え て5分. の 他 に は 血 液 試 料0.2. 間 反 応 させ た 後,三. と2N硫 酸 混 合 液4mlを. 塩化酢酸. 加 えて反応 を停 止 す. 2)反. 応 後 の 液 を0.05N過. マ ンガ ン酸 カ リウ ム. 1.125M. 0.01ml,血. 0.01mlを. NADPH. 液 試 料0.1mlお. 酸 化 水 素0.1mlを. 開 始 させ,反 nmに. NaN3. 0.15. 0.1ml, よび2.2. 加 え攪 拌 して 反 応 を. 応 開 始 後2〜4分. 間 の 間 の340. お け る吸 光 度 の 変 動 を測 定 す る.盲. 検. 用 には 血 液 試 料 の 代 りに 蒸 留 水 を 用 いて 行 う. 2)計. 算: と4分 の 吸 光 度E2,. E4か. ら次. 式 に よ り求 め る. グル タチ オ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 度(μmoles. 溶 液 で 滴 定 す る. 3)計. 0.1ml,. 反 応 開 始 後2分. る.. ン酸 緩 衝 液2.58ml,. ル に取 り, 8.4mM. mM過. 391. NADPH/min・gHb). 算:. 血 液 カ タ ラー ゼ 活 性 度(Perborate. Unit/g. Hb). =(E2‑E4)‑盲. 2‑4 NADHジ. / Hb /100. f:過. NADHジ. b:盲 検 用 の 滴 定 量. 方 法8)を,改. x:試 料 の滴 定量. 1)蒸. ヘ モ グ ロ ビ ン定 量 値. 2‑3 グ ル タチ オ ンペ ルオ キ シ ダーゼ 活性 度 の 測 定(図3): Pagliaら. 検 用 で は2.78ml,測. Procedure of determining by Feinstein5)). catalase. ら減 じた 量)を1.0cmセ. pH. 1Mト. 7.55,. EDTA‑2Na溶. activity. 定用では. トヘ モ グ ロ ビ ン に相 当 す る液 量 を,. 2.78mlか. 液 量)を. の. 変 した 三 輪 の 方 法9)で 測 定 し た.. 留 水(盲. リ ス 緩 衝 液0.05ml, 液0.10mlお. 定 用 に3.25mgメ. の 方 法7)で 測 定 した.. Fig. 2. ア フ ォ ラ ー ゼ 活 性 度 はScottら. 3.25mgメ. 換 算 す る係 数. t:希 釈 倍 数 Hb:総. ア フ ォラ ー ゼ 活 性 度 の 測 定(図. 4):. マ ンガ ン酸 力リ ウム溶 液 の 力価. c:酵 素 液 量 を1mlに. 検値. /12.44×Hb(g). =0.05×f×(b‑x)×c×t. 加 え25℃. ル に 取 り, 0.01M. よ び 溶 血 液(測. トヘ モ グ ロ ビ ン に 相 当 す る でDBI. in the blood (Perborate. (2.6‑ジ ク ロ ロ ベ. method.
(4) 392. 小. ン ゼ ノ ン イ ン ド フ ェ ノ ー ル)水 NADH20.02mlを し, 600nmで 2)計. 林. 弘. 治. 溶 液0.05ml,. =(試料 の 吸 光 度 の 差)‑(盲. 吸 光 度 の 減 少 を20分 間 記 録 す る.. 検 用 の吸 光 度 の 差). /20×3.25×3. 加 え混 和 し て 反 応 を 開 始 2‑5. 算:. マ ウ ス赤 血 球 の過 酸 化 水 素 暴 露 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成. 原 著 で は, 3.25mg/3mlの. メ トヘ モ グ ロ ビ ン. 試 験 管 内 で ア カ タ ラ セ ミア マ ウ ス 赤 血 球 の 過. を 含 む ときの 毎 分 当 りの 吸 光 度 を 求 め て い る が,. 酸 化 水 素 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン 生 成 量 を ノ ー. 三 輪 の 方 法 に よ り1g/mlの. マ ル マ ウ ス 赤 血 球 の そ れ と 比 較 し た.併. メ トヘ モ グ ロ ビ ン の. 毎 分 当 りの 吸 光 度 の 減 少 を求 め る 単 位 と し た. NADHジ. ア フ ォ ラ ー ゼ 活 性 度(△OD/min/. MetHbg/ml). ル コ ー ス 添 加 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン 生 成 に対 す る グ ル タ チ オ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 抑 制 作 用 の 推 定 を行 っ た.. Fig. 3. Procedure. of determining. せて グ. GSH-Px. activity. in the blood.
(5) 変異 マ ウ ス血 液 中 の カ タラ ーゼ 活性 度 とメ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 の関 係 1)採. 血後,遠 沈 分 離 を行 い 赤血 球 を生 食 水 で. 2). 3回 洗 浄 した もの を用 い た.. Warburgフ. ラ ス コ に 生 食 水4ml,赤. 懸 濁 液0.5ml,. 20×10mMグ. を 加 え た.(グ 水4.5mlと に30%過. 393. ル コ ー ス0.5ml. ル コ ー ス 無 添 加 の もの は,生. した.)Warburgフ 酸 化 水 素0.25mlを. 加 え,フ. 溶 血 し,メ. ラス コ. で 振 盪 し た.. 30分, 90分, 130分 反 応 後 に 試 料0.6mlを 解 液2.4mlで. 食. ラスコ の側 管. は パ ラ フ イ ル ム で 封 鎖 し, 37℃. し,溶. 血 球. 採取. トヘ モ グ ロ ビ. ン濃 度 を 測 定 した.. 実 験 1.ア. 結. カ タ ラ セ ミア,ヒ. 果. ポ カ タ ラ セ ミ ア,ノ. ー. マ ルマ ウ スの血 液 カ タ ラ ーゼ 活性 度 お よび三 種 マ ウ ス の メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 の マ ウ ス 相 互 間 の 差 異: ア カ タ ラ セ ミア,ヒ. ポ カ タ ラ セ ミ ア,ノ. ーマ. ル の 三 種 類 の 雌 雄 マ ウ ス か ら得 た 血 液 につ い て, カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 と メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 を測 定 した.結. 果 は(表1)に. 示 す.ま. た メ トヘ モ. グ ロ ビ ン濃 度 に つ い て マ ウ ス相 互 間 の 有 意 差 検 定 を 行 い(表2)の. 結 果 を 得 た.. 血 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度:(表1),(表2)よ 雌 ノ ー マ ル>雄 >雌. ノ ー マ ル>雄. ヒ ポ カ タ ラ セ ミ ア>雄. ヒポ カ タラ セ ミア. ア カ タ ラ セ ミ ア>雌. ア カ タ ラ セ ミア の 順 に 高 か っ た.こ. Fig.4. Procedure of determining NADH phorase activityin the blood Table. 1. Catalase hemolysates lasemic. activity of. dia. and normal,. mice(mean±standard. り. の三 種 の マ. ウ ス の血 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 の 性 差 は, Feinstein. methemoglobin. concentration. homo‑hypocatalasemic deviation). in and. acata. the.
(6) 394. 小 Table. m=male, N=normal. 2. 林. Difference in methemoglobin indipendent mouse groups. fm=female, mice, *:. メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度:雌. ポ カ タ ラ セ ミア>雄 に 高 か っ た.そ. ヒ ポ カ タ ラ セ ミ ア>雄 ノ ー マ ル>雌. ヒ. ノ ーマ ルの 順. し て 血 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 と逆. 別. ア カ タ ラ セ ミ ア と雄 ア カ タ ラセ ミ ア 間) カ タ ラ セ ミア,ヒ. ミ ア お よ び ノ ー マ ル 間)に. ポ カ タ ラセ. 有意 な差 が あ る こ と. が 認 め ら れ た. 2.血. る と, 37℃. で5分. 用 対 数 値)と. メ. トヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 の 相 関 関 係 ア カ タ ラ セ ミ ア,ヒ. ±0.03,ノ. ーマ. こ の 事 実 を 用 い て(図5)の. モ グ ロ ビ ン濃 度 比 が 減 少 し て い る の が 認 め ら れ して血 液 カ タ ラー ゼ 活性 度 の常 用 対 数値. : (Met. Hb/T・Hb)×100]の. 係(r=‑0.88)が x+2.45を 0.1%以. メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 比[y 間 には 負 の相 関 関. 存 在 し,一 次 回 帰 式y=‑0.556. 示 した(n=45).そ. してt検. 定 により. 下 の危 険 率 で母 相 関 係 数 が零 の仮 定 は. 否 定 さ れ た.. 示. ち, 20℃. 用 対 数 値(x)と. の測 定 値 に よ る活 性 度 の 常. メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度(y)の. よ い 相 関 が 認 め られ,そ. 3.血. 原 法6)に 従 っ て37℃. の 際 の 一 次 回 帰 式 は, 示 し た.そ. し てt検. 定 に. 下 の 危 険 率 で母 相 関係 数 が零 の仮. 中 メ トヘ モ グ ロ ビ ン レ ベ ル に 影 響 す る血. グ ル タ チ オ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 度:雄. ア. カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス は10.00±0.76NADH・ μmoles/mingHb,雄 0.63で,両. ノー マ ル マ ウス は10.54±. 者 間 に は 有 意 差 は 認 め られ な か っ た.. (表3) NADHジ. ア フ ォ ラ ーゼ 活 性 度:雄. ア カ タ ラセ. ミアマ ウ ス は, 2.19±0.47△OD/min/Met. Hb・. ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス は2.14±029,. 雄 ノー マ ル マ ウ ス は2.37±0.45,雌. で5分. 間測 定 した血 液 カ タラ ーゼ 活性 度 で あ る. ウ ス は2.20±0.17で. が,一. 方Aebiら11)は. め ら れ な か っ た.. ア カ タ ラセ ミアマ ウス の. 間の. 関 係 数r=‑0.87で. 液 カ タラ ーゼ 以 外 の 酵 素 の 活性 度. g/ml,雌. こ の 成 績 は, Feinsteinの. の 値 を 示 した. の カ. 定 は 否 定 さ れ た. 液 カタラ. れぞれ アカ タラ. 成 績 を20℃. 関 関 係 を(図5)に. 両 者 間 に は 直 線 関 係 が 認 め ら れ,血. で の測 定. タ ラ ー ゼ 測 定 法 に 換 算 し た も の を(図6)に. よ り0.1%以. ー ゼ 活 性 度 が 増 加 す る に つ れ て 血 液 中 の メ トヘ. の2. ポ カ タ ラ セ ミア で1.21. ー マ ル で1.09±0.06倍. y=‑0.675x+2.82を. 示 す.. 間測 定す. と37℃. の 結 果20℃. で 測 定 した 値 の,そ. セ ミ ア で2.13±0.15,ヒ. 相 関 関 係 を 調 べ た 結 果,相. ポ カ タ ラ セ ミ ア,ノ. で5分. の 点 よ り過 ホ ウ 素 酸 法 に お. 種 の 温 度 で 測 定 し た.そ. 度 の 常 用 対 数 値 と メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 と の 相. (x: log Pu/gHb)と. mice,. い て 血 液 カ タ ラー ゼ 活 性 度 を20℃. ルの 三種 類 の雌 雄 マ ウス の血 液 カ タラ ーゼ 活性. た.そ. two. 間 測 定 した 値 よ り も 高 い こ と. を 報 告 して い る.こ. し た.即. 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度(常. between. H=homo-hypocatalasemic -: p>0.05. 値 は, 37℃. ま た メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 につ い て は,性. お よ び 種 別 間(ア. concentration. 血 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 を20℃. ア カ タ ラ セ ミ ア>. の 順 序 を示 し た.. 間(雌. 治. A=acatalasemic mice, p<0.05, **: p<0.01,. ら10)の 結 果 と よ く一 致 し て い た.. 雄 ア カ タ ラ セ ミア>雌. 弘. ノ ーマ ルマ. それぞ れ の間 に有 意 差 は認.
(7) 変異 マ ウ ス血液 中 の カ タ ラー ゼ 活性 度 とメ トヘ モ グロ ビ ン濃 度 の 関 係. Fig.. 5. Correlation. between. logarithm. of. catalase. activity. and. methemoglobin. concentration(37•Ž) Normal. mice. (_??_: •œ, •Š: •›),. acatalasemic. Fig.. 6. mice. homo-hypocatalasemic. mice. (_??_: •¡, •Š: • ). (_??_: •£, •Š: •¢). Correlation. between. logarithm. of. catalase. activity. and. methemoglobin. concentration(20•Ž) Normal acatalaemic. mice. (_??_: •œ, •Š: •›), mice. (_??_: •£, •Š: •¢). homo-hypocatalasemic. mice (_??_: •¡, •Š: • ). 395.
(8) 396. 小 Table 3. Table 4. 4.試. 林. 弘. 治. Glutathione peroxidase activity of normal mice and acatalasemic. NADH diaphorase activity and acatalasemic mice. in the hemolysates mice. in the hemolysates. of normal. 験 管 内 に おけ るマ ウ ス赤 血 球 液 の過 酸 化. 水 素 暴 露 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン 生 成: (図7)に. 示 す よ う に,ア. カ タ ラ セ ミア マ ウ ス. の赤 血 球 は グル コー ス無 添 加 の状 況 にお い て ノ ー マ ル マ ウ ス 赤 血 球 に 比 べ て 明 ら か に メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 速 度 の 早 い こ と が 認 め ら れ た .従 っ て 試 験 管 内 に お け る 過 酸 化 水 素 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 は 血 液 カ タ ラ ー ゼ に よ っ て 抑 制 さ れ て い る こ と が 認 め ら れ た. ま た,ア. カ タ ラセ ミアマ ウ ス赤 血 球 お よび ノ. ー マ ル マ ウ ス 赤 血 球 共 に グ ル コ ー ス を添 加 し た も の に は メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 抑 制 が 認 め ら れ た.こ. の こ とは赤 血 球 内 に存 在 す る グル タチ. オ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ の 作 用 に よ る も の と考 え ら れ る.し. か し,グ. ル コ ー ス の 存 在 下,即. ちグ. ル タ チ オ ンペ ル オ キ シ ダー ゼ 作 用 下 に お い て も, ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス の メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 量 は ノ ー マ ル マ ウ ス に 比 べ て 多 か っ た. 総 括 並 び に考 案 正 常 時 メ トヘ モ グ ロ ビ ン レベ ル と メ トヘ モ グ ロ ビ ン血 症: 赤 血 球 は 酸 素 を運 搬 す る 作 用 を も つ 細 胞 で あ. Fig. 7. Effect of hydrogen peroxide on methe moglobin content in normal and acata lasemic red cells incubated with or with out glucose.
(9) 変異 マ ウ ス血 液 中 の カ タ ラー ゼ 活性 度 と メ トヘ モ グ ロ ビン濃 度 の 関係 り,且. つ 酸 化,還. れ て い る.正. 元 の活 発 な細胞 で あ る とい わ. 常 赤 血 球 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン量 は 極. め て 低 い とい われ, Bodansky12)に. よれ ば ガス分. 析 法 で は 全 ヘ モ グ ロ ビ ン量 の1〜2%, spectrophotometryに. れ は赤 血 球 中 に. ル タ チ オ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ が. 過 酸 化 水 素 を 酵 素 的 に分 解 除 去 す る事 実 お よ び メ トヘ モ グ ロ ビ ン還 元 機 構 と し てNADHジ. ア. フ ォ ラ ー ゼ な ど の 酵 素 的 還 元 に 加 え,ア. スコル. ビ ン 酸,還. 元 型 グル タチ オ ンな どの 非 酵素 的 還. 元 の 機 構 が 存 在 す る た め で あ る.一. 方,遺. と が 認 め ら れ た.こ. の こ とは過 酸 化 水 素 に よ っ. て 赤 血 球 中 に メ トヘ モ グ ロ ビ ン が 生 成 し,赤 血. を実 証 す る 事 実 で あ る.. メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 に 対 す る 防 御 機 構 と し て, カ タ ラ ー ゼ,グ. 血 球 よ り も メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 速 度 が 早 い こ. 球 中 の カ タ ラ ー ゼ が こ れ を抑 制 す る と い う こ と. cyanide‑. よ る 測 定 で は0〜2.4. %で あ っ た と 報 告 し て い る.こ. 伝的. (生体 内 実 験)著. 者 は,カ. る ア カ タ ラ セ ミア,同 ア,ノ. ー マ ル の 三 種 類 の 雌 雄 マ ウ ス か ら得 た 血. 液 に つ い て カ タ ラ ー ゼ 活 性 お よ び メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 を測 定 し た.そ. の 結 果,マ. メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 は,雌 雄 ア カ タ ラ セ ミア,雌 ポ カ タ ラ セ ミ ア,雄. ヒ ポ カ タ ラ セ ミア,雄. ① 遺 伝 性 メ トヘ モ グ ロ ビ ン血 症,. 度 と逆 の 順 序 を 示 し た.そ. あ る.遺. 伝 性 メ トヘ モ グ ロ ビ ン血 症 は,メ. トヘ. モ グロ ビ ン還 元 酵 素 の 欠 損 に よ つて 起 こ り, HbM 症 は,ヘ. モ グ ロ ビ ン を構 成 す る タ ンパ ク分 子 の. 構 造 の 変 異 に よ って 起 こ る.例. えばHbMIwateは. α 鎖 の87番 目 の ヒ ス チ ジ ン が チ ロ ジ ン に変 化 し た も の で あ り, HbMBostonは. α鎖 の58番 目 の ヒ. ウス血 中 の. ア カ タ ラ セ ミア,. ノ ー マ ル,雌. 序 に減 少 し た.こ. が. タ ラー ゼ 活 性 の 異 な. 型 接 合体 ヒポ カ タ ラセ ミ. に メ トヘ モ グ ロ ビ ン血 症 を起 こ す 疾 患 と し て, ② HbM症. 397. ヒ. ノー マ ル の順. の 順 序 は 血.液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 して血 液 カ タ ラー ゼ. 活 性 度 の 対 数 値 と メ トヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 問 に 有 意 な 負 の 相 関 関 係 を 有 す る こ と が 認 め ら れ た. こ の こ と は,正 は,血. 常 血 中 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度. 液 カ タ ラ ー ゼ に よ っ て も支 配 さ れ て い る. こ と を示 し て い る. グ ル タ チ オ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ:血. 液 カタラ. ス チ ジ ン が チ ロ ジ ン に 変 化 し た も の で あ る13).. ー ゼ 以 外 の 過 酸 化 水 素 に 対 す る 防 御 機 構 と して. 以 下,各. マ ウ ス 血 液 中 の グ ル タ チ オ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ. 項 に 従 っ て 述 べ る.. ,. メ トヘ モ グ ロ ビ ン 生 成 に 対 す る 防 御 機 構:. 活 性 度 の 測 定 を 行 い,ア. 血 液 カ タ ラー ゼ:(人. ノー マ ル マ ウス 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た.. の 試 験 管 内 実 験)過. 水 素 に対 す る 防 御 機 構 に は,血 考 え ら れ る.折. 田2)は,日. 酸化. 液 カ タ ラー ゼ が. 本 人 の 無 カ タ ラー ゼ. 血 症 血 液 に 過 酸 化 水 素 を作 用 させ た 時 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 割 合 は,正. 常 人 の血 液 に作 用. こ の 成 績 は,血. カ タ ラセ ミ ア マ ウ ス と. 中 メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 の 増 加. は 主 と して血 液 カ タ ラー ゼ に よ つ て抑 制 され て い る こ と を生 体 内 実 験 で 確 認 し た も の で あ る. ま た 試 験 管 内 実 験 で,マ. ウス赤 血 球 液 に グ ル. させ た 場 合 よ り も 大 き か つ た と述 べ て お り,過. コ ー ス 添 加 時 お よ び 無 添 加 時 に,過. 酸 化 水 素 の 分 解 に血 液 カ タ ラ ー ゼ が重 要 な 役 割. 暴 露 し て メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 を時 間 経 過 に よ. を果 し て い る こ と を示 唆 して い る.ま. っ て 調 べ た 成 績 で は,グ. た, Aebi. 酸化水素 を. ル コ ー ス の 存 在 下 で は,. ら14)も ス イ ス 人 の 無 カ タ ラ ー ゼ 血 症 血 液 で,同. ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス,ノ. 様 の 結 果 を 報 告 し て い る.ま. 血 球 と も に グ ル コ ー ス 無 添 加 に 対 し て メ トヘ モ. た,血. ゼ の 重 要 性 につ い て 国 分15)は,日. 液 カ タ ラー. 本 人 の無 カ タ. ー マ ルマ ウ スの 両赤. グ ロ ビ ン生 成 が 抑 制 さ れ た.こ. の 結 果 は,グ. ル. ラ ー ゼ 血 症 血 液 に ヒ ドロ キ シ ル ア ミ ン を作 用 さ. コー ス 添 加 に よ り赤 血 球 内 にNADPHが. せ て ハ イ ン ツ小 体 の 形 成 を認 め,血. グ ル タ チ オ ン還 元 酵 素 が作 用 し て 酸 化 型 グ ル タ. 液 カ タ ラー. 増 加 し,. ゼ の作 用 が抑制 また は不 活性 化 され た場 合 に血. チ オ ン よ り還 元 型 グ ル タ チ オ ン が 生 じ,グ. 球 成 分 の 酸 化 変 性 か ら起 こ る と述 べ て い る.. チ オ ン ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ に よ る過 酸 化 水 素 の 消. (マ ウス の 試 験 管 内 実 験)著. 者 は,マ. ウス赤 血. ル タ. 失 が お こ る た め で あ り16),こ の 結 果 か ら,メ. ト. 球 に 過 酸 化 水 素 を暴 露 し て メ トヘ モ グ ロ ビ ン生. ヘ モ グ ロ ビ ン生 成 に 血 液 カ タ ラ ー ゼ の み で な く. 成 を 時 間 経 過 に よ っ て 調 べ た.そ. グ ル タ チ オ ン ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ も作 用 し て い る. の結 果 ア カ タ. ラセ ミ ア マ ウ ス の 赤 血 球 は ノ ー マ ル マ ウ ス の 赤. 事 実 が 推 定 さ れ る.ま. た グ ル コ ー ス 添 加 例 で,.
(10) 398. 小. 林. 弘. 治. ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス 赤 血 球 の メ トヘ モ グ ロ ビ. 究 で はNADHジ. ン 生 成 量 が,ノ. タ ラ セ ミア マ ウ ス,ノ. い こ と は,グ. ーマ ルマ ウ ス赤 血 球 に比べ て 多 ル タチ オ ンペ ル オキ シ ダー ゼ作 用. 下 に お い て も,血. 液 カ タ ラーゼ の 欠 損 によ るメ. ア フ ォ ラ ー ゼ 活 性 度 は,ア. は 認 め ら れ ず,ア. トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 を完 全 に 抑 制 す る こ と は で. NADHジ. ら れ な か っ た.. vivo. に お け る と同 様 に血 液 カ タ ラ ー ゼ が メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 を抑 制 す る こ とは, も 同 様 と 考 え ら れ る.人. in vitroに お い て. 赤 血 球 の 試験 管 内 実験. に お い てOgataら3)は,無. カ タ ラー ゼ 血 症 患 者. の 赤 血 球 懸 濁 液 を 使 用 し, Azideお. よび グルコー. カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス の メ トヘ. モ グ ロ ビ ン量 が ノ ー マ ル マ ウ ス よ り 多 い 事 実 に. き な い と い う こ と を 示 し て い る.即. ち,in. カ. ーマ ルマ ウ ス 間 に有 意 差. アフ ォラーゼ が関 係 して い る とは考 え. 正 常 時 メ トヘ モ グ ロ ビ ン レベ ル と メ トヘ モ グ ロ ビ ン血 症 の 生 成 の バ ッ ク グ ラ ウ ン ド レベ ル に 関 す る 考 察: 以 上 の 成 績 よ り,血. 液 カ タ ラ ーゼ 以 外 の メ ト. ヘ モ グ ロ ビ ン生成 に対 す る 防御 機構 お よ びメ ト. ス 添 加 有 無 の 場 合 の 過 酸 化 水 素 に よ る メ トヘ モ. ヘ モ グ ロ ビ ン還 元 機 構 が 正 常 レベ ル で あ る場 合. グ ロ ビ ン生 成 に つ い て検 討 し,メ トヘ モ グ ロ ピ ン. に は,生. 生 成 の 抑 制 は 血 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 に 強 く依 存. ビ ン濃 度 は,血. し,さ. ら に グ ル タ チ オ ン ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ も若. 体 内 の 正 常 時 に 存 在 す る メ トヘ モ グ ロ 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 に 強 く依 存. し て 抑 制 さ れ て い る こ と が 認 め ら れ た.従. って. 干 の 抑 制 効 果 の あ る こ と が認 め ら れ た と 報 告 し. ノ ー マ ル マ ウ ス に 比 べ,ア. て い る.. お よ び ヒ ポ カ タ ラ セ ミア マ ウ ス に 工 業 化 学 物 質. SOD:. Suttonら17)の60Cobaltに. よ る照 射 実. 験 で 示 す よ う に 生 成 す る ス ー パ ー オ キ サ イ ドア. カ タ ラセ ミアマ ウ ス. で あ るortho‑Aminophenolあ. る い はNOxを. 作 用 さ せ た 場 合 に メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 の 起 こ. ニ オ ン に よ っ て 赤 血 球 内 で メ トヘ モ グ ロ ビ ン生. りや す い 事 実 は,血. 成 が 起 こ る が,こ. は 低 下 に よ り無 作 用 の 時 す で に メ トヘ モ グ ロ ビ. の 生 成 はSODと. ー ゼ に よ って 分解 除 去 され. ,メ. 血 液 カタラ トヘ モ グ ロ ビ ン. ン濃 度 の1亘常 性 が 乱 さ れ て お り,メ. 性 に つ い て は, Nodaら18)は. ア. 考 え ら れ る.今. カ タ ラ セ ミア マ ウ ス は ノ ー マ ル マ ウ ス に 比 べ 約. NOxに. 10%増. が 行 わ れ,両. 加 して い た と報 告 し て い る.メ. ロ ビ ン生 成 に 関 して はSODが す れ ば,ア. トヘ モ グ. 関 与 して い る と. 今 後 さ ら に 検 討 の 必 要 が あ る と思 わ れ る.. 者 の 関係 が 明 らか に され る もの と. 考 える、. 結. 血 中 メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度. を 抑 制 す る方 向 に 作 用 し て い る と推 定 さ れ る が,. 後 さ ら にortho‑Aminophenol,. よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 に 関 し て研 究. カタラセ ミ ア マ ウ ス の ノー マル マ ウス よ. り高 い 血 中SODは. トヘ モ グ ロ. ビ ン生 成 物 質 の 作 用 し や す い 準 備 状 態 で あ る と. 生 成 は 抑 制 さ れ て い る. な おSOD活. 液 カ タラ ー ゼの 欠 損 あ るい. 論. カ タ ラ ー ゼ 活 性 の 異 な る ア カ タ ラ セ ミア,同 型 接 合 体 ヒ ポ カ タ ラ セ ミア,ノ. ー マ ル の 三種 類. メ トヘ モ グ ロ ビ ン還 元 機 構:. の マ ウ ス か ら得 た 血 液 に つ い て,カ. 赤 血 球 が 酸 化 さ れ る と メ トヘ モ グ ロ ビ ン が 生. 性 度 及 び メ トヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 を測 定 し,メ. 成 さ れ る が,メ. トヘ モ グ ロ ビ ン を 還 元 して 赤 血. 球 を正 常 に 保 つ 系 が 存 在 す る. Scottら19)は. 生. タ チ オ ンペ ル オキ シダ ー ゼ 及 びNADHジ. 成 し た メ トヘ モ グ ロ ビ ン の 還 元 作 用 の 強 さ を 比 較 し,そ. ス の 赤 血 球 に グ ル コ ー ス 添 加,無. ゼ(73%),ア. ア フ ォ ラー. ス コ ル ビ ン 酸(12%),還. ル タチ オ ン(9%),そ と述 べ て い る,ま. 元型 グ. の 他 の 還 元 酵 素(6%) たSchwarts20)は,メ. トヘ モ. で,過. 1.マ. ウ ス 血 液 中 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 は 雌. り示 さ れ る よ う にNADHジ. 接 合 体 ヒ ポ カ タ ラ セ ミア,雄. か しな が ら本研. 添 加 の条件 下. 下 の 結 果 を得 た.. ア カ タ ラ セ ミア,雄. 度 に 依 存 す る と述 べ て い る.し. アフ ォ. た試 験 管 内 で マ ウ. 酸 化 水 素 に よ る メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 量. を測 定 し,以. グ ロ ビ ン量 は 遺 伝 性 メ トヘ モ グ ロ ビ ン血 症 に よ ア フ ォラ ーゼ 活性. ト. ヘ モ グ ロ ビ ン レベ ル に 関 係 す る 酵 素 と して グ ル. ラ ー ゼ 活 性 度 を測 定 し た.ま. の 寄 与 の 程 度 はNADHジ. タ ラー ゼ活. カ タ ラ セ ミア,ノ. ア カ タ ラ セ ミア,雌. 同型. 同型 接 合体 ヒポ. ー マ ル の 順 に減 少 し,こ. の.
(11) 変異 マ ウ ス血 液 中 の カ タ ラー ゼ 活性 度 と メ トヘ モ グロ ビ ン濃 度 の 関係 順 序 は,血 し た.そ 間(雌. 4.試. 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度 と 逆 の 順 を示 して メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 は,性. カ タ ラセ ミ ア,ヒ. セ ミア お よ び ノ ー マ ル 間)に. り も 多 か っ た.ま. 有 意 な差 の あ る. 用 対 数 値)と. C.. 1.. 11.. 1.. 6)活. 活 性 度 の 検 討 を 行 い,グ C.. 5.以. ジ ア フ ォラ ー ゼ(E.. C.. 1.. 9)お 6.. 4.. 3)の. 謝 活性. トヘ モ グ ロ ビ ン血 症,毒. 懇篤 な る御 指 導 と御 校 閲 を. 賜 っ た緒 方 正 名 教 授 に深 甚 な る謝 意 を表 し ます.. 文 烈:メ. 辞. 稿 を終 わ る に臨 み,御. ル マ ウ ス の 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た.. 渡辺. 常 時 に存 在 す る 血 中 メ. に 依 存 し て い る こ と が認 め ら れ た.. よ びNADH. 度 につ い て は ア カ タ ラセ ミアマ ウス と ノー マ. 1.. 上 の 成 績 よ り,正. トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度 は血 液 カ タ ラ ー ゼ 活 性 度. ル タチ オ ン ペ ル オ キ. 1. 11. 1.. ルコ. 添 加 時 に比 べ 速 か っ た.. メ トヘ モ グ ロ ビ ン濃 度. トヘ モ グ ロ ビ ン レ ベ ル に 関 係 す る 酵 素 の. シ ダ ー ゼ(E.. カ タ ラセ ミ ア マ ウ ス. ー ス 無 添 加 時 の メ トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 速 度 は. の 間 に 有 意 な 負 の 相 関 が 認 め ら れ た. 3.メ. た,ア. お よ び ノ ー マ ル マ ウ ス赤 血 球 と も に,グ. 液 カ タ ラ ー ゼ(E.. 性 度(常. 添 加 時 いず れ に おい て. も ア カ タ ラセ ミアマ ウス は ノ ーマ ルマ ウス よ. ポ カ タラ. こ と が 認 め ら れ た. 2.血. トヘ モ グ ロ ビ ン生 成 量 は. グ ル コ ー ス 添 加 時,無. ア カ タ ラ セ ミ ア と雄 ア カ タ ラ セ ミア 間). お よ び 種 別 間(ア. 験 管 内 でマ ウ スの赤 血 球 液 に過 酸 化 水 素. を 暴 露 し た 時 の,メ. 別. 399. 献. 性 学‑そ. の 生 化 学 的 側 面,吉. 村 英 敏 編,講. 談 社,東. 京(1979). pp. 225‑238. 2.. 折 田 洋 造:無. カ タ ラ ー ゼ 血 症 に お け る ヘ モ グ ロ ビ ンの 分 解 につ い て. 3. Ogata M, Takahisa T, Mizugaki J and Takahara. 人 類 遺 伝 学 雑 誌(1962). 7,. 163‑189.. S: Glutathione peroxidase in the red cells of. Japanese acatalasemic blood. J Human Genet (1975) 19, 325-333. 4. Kikuchi G, Shukuya R and Suzuki M: On the mechanism of the activation of molecular oxygen by hemoglobin. J Biochem (1955) 42, 267-284. 5. Van Assendelft OW: Ltd., Assen Netherland. Spectrophotometry. of Haemoglobin. Derivatives.. Royal Vangorcum. (1970).. 6. Feinstein RN: Perborate as substrate. in a new assay of catalase.. J Biol Chem (1949) 180,. 1197-1202. 7. Paglia DE and Valentine WN: Studies on the quantitative. and qualitative characterization. of. erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med (1967) 70, 158-169. 8. Scott EM: The relation of diaphorase of human erythrocytes to inheritance of methemoglobinemia. J Clin Invest (1960) 39, 1176-1179. 9.. 三 輪 史 朗:臨. 床 検 査(1971). 15 (12), pp. 133‑134.. 10. Feinstein RN, Braun JT and Howard JB: Acatalasemic and hypocatalasemic. mouse mutants. II. Mutational variations in blood and solid tissue catalases. Arch Biochem Biophys (1967) 120, 165-169. 11. Aebi H, Suter H and Feinstein RN: Activity and stability of catalase in blood and tissues of normal and acatalasemic mice. Biochem Genet (1968) 2, 12. Bodansky O:. Methemoglobinemia. 245-251.. and methemoglobin producing compounds.. Pharmacol Rev. (1951) 3, 144-196. 13. Winslow RM and Anderson WF: The hemoglobinopathies, Disease,. Stanbury, Wyngaarden. and Fredrickson. the Metabolic Basis of Inherited. eds, McGraw-Hill. Book Co. NY (1978).
(12) 400. 小 pp. 14.. 15.. 16.. 林. 弘. 治. 1487‑1489.. Aebi. H,. two. Swiss. Baggiolini families. M, with. 国分. 統:緒. 究.岡. 山 医 学 会 雑 誌(1959). 三 輪 史 朗:溶. De. Wold. B,. Lanber. acatalasia. E, Suter. II. Enzymol. Biol. Micheli. Clin. A. (1964). and 4,. 種 耳 鼻 咽 喉 科 領 域 疾 患 及 び 無 カ タ ラー ゼ 血 液 症 に お け るHeinz小. 血 性 貧 血,遺. 71,. Fleis. J:. Observation. in. 121‑151. 体 の 臨 床 的 並 び に実 験 的研. 2755‑2768.. 伝 生 化 学II,荻. 田 善 一 編,中. 17. Sutton HC, Roberts PB and Winterbourn with oxyhaemoglobin and methaemoglobin.. 山 書 店,東. 京(1974). pp. 321‑325,. CC: The rate of reaction of superoxide radical ion Biochem J (1976) 155, 503-510.. 18. Noda Y, Narumiya S, Takai K and Hayaishi O: erythrocytes;. E,. Superoxide dismutase activity in acatalasemic. in Biochemical and Medical Aspects of Active Oxygen Hayaishi and Asada eds,. University of Tokyo Press, Japan (1977) pp 293-297. 19. Scott EM, Duncan IW and Ekstrand V: Reduction of methemoglobin. 20. Schwarts JM and Jaffe ER: Hereditary Methemoglobinemia. Fed Proc (1963) 22, 467.. with Deficiency of NADH Dehy. drogenase, the Metabolic Basis of Inherited Disease, Stanbury, Wyngaarden eds, McGraw-Hill Book Co. NY (1978) pp 1452-1463.. and Fredrickson.
(13) 変 異 マ ウス血 液 中 の カ タ ラー ゼ 活性 度 と メ トヘ モ グロ ビ ン濃 度 の 関係. Relationship. between. concentration. catalase. in the. activity. blood. and. Hiroharu. Correlations between catalase blood of acatalasemic, homozygous The formation. of methemoglobin. homozygous negative moglobin. hypocatalasemic,. mice.. University. Medical School, Okayama. Prof. M. Ogata). activity and the hypocatalasemic by hydrogen. addition of glucose in vitro was the blood were decreased in the. normal. homozygous. KOBAYASHI. of Public Health, Okayama (Director:. methemoglobin. of acatalasemic,. hypocatalasemic. Department. and. 401. peroxide. methemoglobin concentration in the and normal mice were investigated. in the red cells. with. or without. the. also studied. Levels of methemoglobin concentrations in order of female acatalasemic, male acatalasemic, female. male homozygous. hypocatalasemic. and. normal. mice.. A good. correlation were observed between the logarithm of catalase activity and methe concentration in the blood of acatalasemic, homozygous hypocatoalasemic and. normal mice. No significant differences diaphorase activity among acatalasemic. in glutathione peroxidase activity and NADH and normal mice were observed. The amount of. methemoglobin formed by hydrogen peroxide from hemoglobin in acatalasemic mouse red cells with or without the addition of glucose was more than that in normal mouse red cells. The amount of methemoglobin tion of glucose was more than results,. the. catalase. activity.. methemoglobin. in normal or acatalasemic mouse red cells without that in red cells with the addition of glucose. From concentration. appears. to be mainly. controlled. the addi the above. by the. blood.
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