卵巣上皮細胞馴化培養液によるマウス ES 細胞の 生殖細胞分化誘導への影響
福 永 直 人1、武 内 大 輝1、竹 原 俊 幸1、寺 村 岳 士2、 伊 藤 俊 介1、小 澤 まどか2、掛 川 亮1、小野寺 勇 太1、 岸 上 哲 士1、松 本 和 也1、佐 伯 和 弘1、入 谷 明1、
佐 川 典 正2、細 井 美 彦1
要 旨
マウス胚性幹細胞（mouse embryonic stem cell;mES 細胞）は、各系譜の細胞へと分化可能な分化多能 性を有している（1）。この特徴を用いて、様々な分化誘導実験が行なわれてきた。生殖細胞の分化誘導も また、発生メカニズムの解明に繋がるとして研究の対象となってきた。しかし、受精能を獲得した精子様 の細胞は得られたが、同様な卵母細胞様の細胞は得られていない。
そこで本実験では、卵巣表面に存在する卵巣上皮細胞（ovarian surface epithelium cells;OSECs）が mES 細胞から生殖細胞への分化に関与するかどうか、分子生物学的手法及び免疫化学的手法を用いて未分化 マーカー遺伝子である Oct4 遺伝子、生殖細胞関連遺伝子である Mouse vasa homolog（Mvh）、Stella、
Fragilis 遺伝子について解析した。その結果、胚様体（Embryoid Body;EB）を OSECs の馴化培養液で接着 培養を行った場合、通常の接着培養と比べ、Oct4 遺伝子の発現が維持された。今回の実験系より得られた 結果から、OSECs の分泌する液性因子が、mES 細胞から生殖細胞への分化を助長する傾向にあることが示 された。
緒 論
マウス胚盤胞期胚中の内部細胞塊より樹立される mES 細胞は、各系譜の細胞へと分化可能な分化多能性 を有している。mES 細胞を浮遊培養させることで得られる EB 中には各胚葉の細胞が存在し、マウス始原 生殖細胞（Mouse Primordial Germ Cell；mPGC）様の細胞の存在も確認されている（2-4）。mPGC は 13.5 day post coitan（dpc）付近まで雌雄の区別がなく、その後周囲の環境により雌雄の性が決定される
（5-7）。近年、mES 細胞から雌雄の生殖細胞分化誘導には EB を介する分化誘導法が多く用いられている
（2-4,8-11）。しかし、誘導された精子様細胞では受精能が確認されたが、卵子様細胞では受精能が確認さ れていない。よって、EB を介した分化誘導法で受精能を獲得した精子様細胞とは対照的に、卵子様細胞が 受精能を獲得できていないことから、卵子形成または機能の成熟に関与する環境や因子が不足していると 考えられる。そのため、卵子形成に関与するin vivoの環境を理解することが、受精能を有する卵子の獲得 において重要になると考えられる。
今回我々は卵子の分化誘導に効果を示す環境として卵巣表面に存在する OSECs に注目した。OSECs は卵 巣の表面を覆う、立方体様で扁平な単層の細胞であり、体腔上皮細胞由来の細胞群である（12）。排卵の 促進や、排卵後の細胞外マトリクスの再構成性など特徴的な機能を有しており、これらの細胞群は、周辺 の間葉系細胞に影響し、卵子の形成を誘導すると報告されている（13）。
初期の生殖細胞分化形成は、Fragilisを発現する PGC の細胞群中にStellaを発現する細胞が確認される。
1. 近畿大学大学院生物理工学研究科 〒649-6493 和歌山県紀の川市西三谷 930 2. 三重大学大学院医科学研究科 〒514-8507 三重県津市江戸橋 2 丁目 174 番地
これらの細胞群は、生殖隆起に移動する過程でMvhを発現する。この間、Oct4の発現は継続され、雌の生 殖細胞に性決定された PGC は、卵胞形成期までこれらの遺伝子の発現を継続する。そこで本実験では OSECs の馴化培養液で EB を接培養させ、生殖細胞関連遺伝子の発現パターンを解析し、mES から生殖細 胞への分化誘導に及ぼす影響を検討した。
材料と方法
OSECs の単離
PMSG 7.5IU、hCG 7.5IU を投与し、過排卵処理を施した ICR 系統のマウスの卵巣を摘出する。PBS（-）
で洗浄した後、表面をメスで剥離し 0.05% トリプシンに浸して表層のみ解離。これらの細胞を回収し、細 胞培養液で培養を行った。細胞培養液は DMEM 444ml に FBS 50ml、10% NaHCO3 6ml、L-Glutamine 0.292g を混合し、フィルター滅菌を行なった。
OSECs の馴化培養液の調整
細胞培養液で培養している OSECs の培養上清を回収し、フィルター滅菌を行なった。使用時に等量の細 胞培養液で希釈し、これを馴化培養液とした。
OSECs の馴化培養液を使用した EB の接着培養
mES 細胞をコンフルエントな状態になるまで培養を行い、トリプシン -EDTA を加えて個々まで解離し 回収した。その後、10%FBS-DMEM を加えペトリディッシュに播種し、2 日間浮遊培養を行うことで EB を形成させた。得られた EB をゼラチンコート処理された細胞培養ディッシュで接着させ、先ほど調整し た OSECs の馴化培養液及び、細胞培養液で接着培養を行った。これら 2 つの実験区をそれぞれ、5 日間、
10 日、15 日、30 日間培養を行った。
単離した OSECs の検定及び実験区の解析 RT-PCR
単離した OSECs、2 つの実験区で接着培養を行った細胞をサンプリングし、定法を用いて RT-PCR を行った。
Primer 配列： Oct4 forward ; tggagactttgcagcctgag reverse ; catactcttctcgttgggaata Mvh forward ; aggtgaaagcagtgatagtc reverse ; tctcgtcctgctaatacaatg Egfr forward ; cgtgacccagggactgt
reverse ; tggttccccctccaggat Stella forward ; cagccgtacctgtggagaac
reverse ; agccctggggcctcacagctt Fragilis forward ; tgctccgcaccatgaaccac
reverse ; gtgaagcacttcaggacccg G3pdh forward ; accacagtccatgccatcac reverse ; tccaccaccctgttgctgta
ヘマトキシリン・エオジン染色
単離した OSECs を 10% 中性ホルマリンで固定し、定法を用いてヘマトキシリン・エオジン染色を行った。
免疫組織化学染色
単離した OSECs、2 つの実験区で接着培養を行った細胞を 10% 中性ホルマリンで固定したものを使用し
た。免疫組織化学染色は定法を用いて行った。抗体には抗 EGFR 抗体、抗 MVH 抗体 、抗 OCT4 抗体を使 用した。また核の染色に DAPI を使用した。
結 果
PT-PCR、免疫組織化学染色を用いて単離した OSECs を解析したところ、上皮細胞マーカーである EGFR 及び生殖細胞関連遺伝子である Mvh 遺伝子の発現が確認された。また、Oct4 遺伝子の発現は認められな かった（図 1）。
先の実験で検定された OSECs の馴化培養液を用いて EB を接着培養した結果、細胞培養液での接着培養 区と比べると、Oct4 遺伝子の発現が維持される傾向にあった。しかし、免疫組織化学染色から、OCT4 及 び MVH タンパク質の局在する細胞は両実験区において同様に観察された（図 2、3）。
図 1．RT-PCR、免疫組織化学染色を用いた OSECs の検定
図 2．RT-PCR を用いた OSECs の馴化培養液による影響の解析
考 察
OSECs は特異的な指標がないため、明確な特徴付けが困難な細胞群である（14）。今回得られた細胞は 上皮細胞の特徴であるEgfrを発現しており、免疫組織化学染色においても EGFR が確認された。よって単 離された細胞は OSECs であると考えられる。また、単離された OSECs にはOct4の発現は確認されなかっ たため、生殖細胞の混入がないと考えられる。
これらの単離した OSECs の馴化培養液を使用した接着培養では、細胞培養液を使用した接着培養と同様 に Fragilis、Stella 遺伝子の発現が確認された。免疫組織化学染色においても両実験区共に OCT4 と MVH のタンパク質発現が確認されたが、Oct4 遺伝子の発現は細胞培養液を使用した接着培養において 30 日間 培養することで消失している。したがって、OSECs の馴化培養液に含まれる液性因子には、生殖細胞の遺 伝子発現パターンを維持可能な環境を形成する作用が示された。これはin vivoにおいて OSECs が、白膜 により卵巣内部と遮断されていることから、液性因子を通して卵巣内部の生殖細胞と関わりをもつためと 考えられる。
近年の卵子の分化誘導において、顆粒膜細胞との共培養により、卵子様の細胞がえられたとの報告がな された（2）。この実験では、顆粒膜細胞の馴化培地も用いて誘導を行ったが卵子様の細胞は得られず、顆 粒膜細胞との直接的な接触が卵子の分化誘導を促進する作用を示した。これはin vivoにおいて、顆粒膜細 胞が卵子とギャップジャンクションを介して作用するため、直接的な接触が必要であったと考えられる。
しかし、卵子の分化誘導は促進されたが、受精能を有する成熟した卵子様の細胞は得られなかった。PGC の減数分裂から卵子成熟の過程において、様々な体細胞との直接的な接触が必要との報告もあり
（5,6,16,17,）、卵子の分化誘導において、細胞間での直接的な接触は重要な作用を有するものと考えられ るが、それだけでは受精能を有する成熟した卵子を得るための必要な因子が不足していることが示唆され た。
今回の実験では、OSECs から分泌された液性因子が生殖細胞分化に関与することが観察された。また、
以前に減数分裂前の mPGC を腎臓に移植し卵胞を形成させた後、in vitroで培養することで、受精能を持つ 卵子を獲得したとの報告がある（15）。以上のことから、生殖細胞分化において間接的に作用する因子も、
図 3．免疫組織化学染色を用いた OSECs の馴化培養液による影響の解析 Bar：50μｍ
細胞間の直接的な接触による作用と同様に、重要な働きを持つことが推測され、このような因子の共合が 卵子の分化誘導において必要になると考えられる。今後、OSECs から分泌される液性因子が、mES 細胞か ら受精能を有する卵子の獲得において重要な因子となることが期待される。
参 考 文 献
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英 文 要 旨
Influence of Ovarian Surface Epithelium in Differentiation into Germ Cells from Mouse Embryonic Stem Cells
Naoto Fukunaga1, Hiroki Takeuchi1, Toshiyuki Takehara1, Takeshi Teramura2, Shunsuke Ito1, Madoka Ozawa1, Ryo Kakegawa1, Yu-ta Onodera1, Satoshi Kishigami1, Kazuya Matumoto1, Kazuhiro Saeki1, Akira Iritani1,
Masanori Sagawa2, Yoshihiko Hosoi1
Abstract
Mouse embryonic stem cells（mESCs）have ability to differentiate into three germ layers. In using this characteristic, many studies were carrid out on cell differentiation. Differentiation into germ cells has also been studied for the investigation of development system. Recent studies have demonstrated embryonic stem cells can differentiate into germ cells and differentiated sperm-like cells could be fertilized by using ICSI. However, differentiated oocyte-like cells were infertile.
In this study, we analyzed the influence of ovarian surface epithelium cells（OSECs）on mEScs in differentiation into germ cells using germ cell related gene expressions such as Oct4, Mouse vasa homolog
（Mvh）, Stella, Fragillis. When cultured in OSECs-conditioned medium, Oct4 gene expressions were maintained in EB. OSECs affect in ovulatory phase to induce ovulation and to form oocyte in vivo.
Therefore the results suggest that OSECs-conditioned medium have effect in differentiation into germ cells.
1. Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kinki University, Wakayama 649-6493, Japan 2. Graduate School of Medicine, Mie University, Tsu, Mie 514-8507, Japan
