新規な機能をもつ核酸結合性小分子の研究

(1)

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

新規な機能をもつ核酸結合性小分子の研究

井原, 敏博

九州大学工学研究科合成化学専攻

https://doi.org/10.11501/3065524

出版情報：Kyushu University, 1992, 博士（工学）, 課程博士バージョン：

権利関係：

(2)

3 - 3

-

2 考察

3 - 3 -

1で示したCs 0値(ü.lMNaCl)から 2の結合定数Kを算出

してみる。いま、エチジウムブロミド、ビスアタリジン2のDNAに対する結合定数をそれぞれKE、 KDとすると、

KE=Eb /Ef'P f (2)

KD=Db/Df'Pf ( 3 )

と表すことができる。ここでEはエチジウムブロミドの、 Dはピスアタリジン2の波度を示し、添え字のb、 fはそれぞれDNAとの結合

加、非結合型を意味するものである。式(2)、 (3 )からPfを消去すると

K D=D b' Ef'KE/Eb'D f (4)

となる78 )。ここでもし、エチジウムブロミドと2のl分子が占有するDNA上での座席数が等しければ、この式(4)から既知のKEを代入してKDを求めることができる。しかしながら、占有座席数が両者で具なる場合には、これらの式を以下に示すように拡張して考えなければならない。

K _{E= Eb/Ef'} _{P f-} E (2 ')

Ko二Db/Df'Pf-D

( 3 ')

但し、 Pf-D=rP f-E

.'.Ko=Db'Ef'KE/rEb 'Df ( 4 ')

実験の条件より^、 Pl 0 l a 1 = 1 . Ü ，u M、 Eb+Ef=1.26μM、実験結果より、

-67-

(3)

エチジウムブロミドの5 0%が追い出された点では

Db+Df=0.29μM

さらに文献から41) KE=2.0 x 1 0 5M-1であることがわかっている。これらの値を全て( 4 ')に代入してKDを算出すると結果は表3 - 1に示すよ

うになった。

表3-1 Cso値より求めた2の結合定数.

r Ko/M-1

一

1.0 1.18x106

2.0 2.41 x 105

3.0 l.0 1 x 105

4.0 5.50x104

同じ条件(O. lMNaCl)で行なったScatchard 解析(吸収スペクトル変化を利用したもの)の結果はKO=l.

72 x 1 0 5M'\ n=3 . 8bpであ

るが、ほほこれに対応する値になった。しかもその占有座席はエチジウムブロミドの2倍---3倍のK他が最もScatchard解析の結果に近

く、

2のビスインターカレーションが示唆された(エチジウム

ブロ

ミドのn値は約2)。このように、エチジウムブロミドの追い出し法から得られた値(K、 n)は、 Scatchard解析で得られた結果と良好な一致を示した。従って、これまで行なってきた吸収スペクトル変化から Scatchard 解析で結合定数を求める手法の信頼性が確かめられた。

NaC l無添加l系(図3 - 8 )ではCso=0.087であったが、これを他の数程の化合物と比較する7

7‘7

^g)。

スペルミジンスペルミン

-6…

1 .00

0.23

(4)

Acr-NH-(CH2)n-NH-Acr* n=6 0.15 n=8 0.11 n=10 0.09

9-アミノアタリジン

0.51

* A c rはアクリジン環

2とAcr- NH-(CH2)n-NH-Acrのn=8、 1 0は、その複素環距離、結合

定数は非常に近い値であるが、ここに示すように、 Cso値もこれを反映して似た値をとることがわかった。

ここでインターカレータの結合定数に与える塩濃度の効果7 3 )につ

いて考察する。高分子電解質理論81) (polye lectrolyte theory)を DN A-配位子交互作用に拡張したRecordらの取扱い口、83)によると、

DNAと配位子の相互作用は次に示す2つのステップを含むと考えられる。

P'Mm<þ二二二::::- P Ks

+

mいM

ム一

(5)

ここで、 Pはリン酸単位のDNA、 Mは溶液中の共存塩、しはDNA 結合配位子、 mはDNA-配位子問に生じるイオン対の数、いはリン

酸に濃縮されている対イオンの数(リン酸l個あたり) 、従って、

全体の其の結合定数Kは

K = Ks・KL (6)

で表される。

Ksと K

Lは塩濃度に独立の値であるので、もちろんKは塩濃度が変化しても不変である。しかしながら、笑際に観測する結合定数K0 bsは塩濃度の影響を受ける。 K0 bsは次のように与えられる。

-69-

(5)

Kobs

ps 1rJ D

ud一+

D

t

fl一一1j

V

M m pa

，，42k nυ

し

つJV

P

一M m P

したがって

K = K

^s

. K

^L

= K

⁰

bs

^X

[M]

^{m ljI}

(7 )

となり、 K⁰bsが塩濃度依存性の他であることがわかる。

式(7)の両辺の対数をとって

10

g K 0 bs =

¹⁰

g K - mいlog[M] ( 8 )

いま、 [M]=[M]O ([し]O�[M]O) 、 K=一定と考えてよいから式(8 )

より

v b m

b

一

川ムシ σむ

一M

凡 rh~

一8 s 一q

(9)

但し、この式は、配位子が結合したことによるDNAのコンホメーションの変化は考慮していない。実際、インターカレーションの場合

はDNAの塩基対間を押し広げて結合するので、その結合により電荷間距離が変化する。従って、 DNAへのインターカレータの結合前後で、リン酸l個あたりに結合している対イオンの数ψも変化するはずである。この効果を考慮に入れていないので、ここで導出した式 ( 8 )はカチオン'性のインターカレータとDNAの文ナカチオン問のカチオン交換の効果のみを表現したものである。インターカレーションに伴うDNAのコンホメーション変化の表現には、インターカレータ結合前後で別々のいを用いる必要がある。迎合?の典型的なインターカレーションによりいは0.88から0.82に変化する7³)程度であると考えられるので、コンホメーション変化の効果はカチオン交換の効

ー70-

(6)

果に比べると非常に小さいと考えてもよい。従ってここでは単純化のために式(9)を用いる。

いま、 O.lMNaCl共存下でのCso (=0.29) と非共存下でのCs 0 (=0.089) は大きく異なっている。このことは、式( 9 ) の-mい (logKobs-log[M]。プロットの傾き)が、エチジウムブロミドと2と

で異なっていることを示している。いは配位子の関与しない値であるから両者について同ーである。即ち、 Cs 0値の大小関係からエチジウムブロミドのmよりも2のmの方が大きいということができる。

エチジウムブロミドのmは1 .0と考えてよいから、 2は DNAへの結合に際して、 lつより多くのイオン対をリン酸との聞に形成していることになる。従って、 2はそのピオローゲン部分をDNAに平行に配向させてピリジニウムの正電荷をいずれもDNAのリン酸部位に静電的に結合させていることが推定できる。

ここで示したように、エチジウムブロミド追い出し法は、 1 )操作が非常に簡単で、測定に多くの時間を要しない。 2 )エチジウムブロミドを基準としたあくまで相対的な結合力の評価法であるので再現性に優れ、他のデータとの比較がしやすい。 3 )測定には目的化合物数ミリグラム、DNA数マイクログラムしか必要としない。4 ) インターカレータだけでなく、グルーブへ吸着する化合物(グルーブパインダ一)、また、紫外・可視領域に測定可能な吸収をもたない化合物など適用範囲が広い。

この節の結呆により、新しく合成した電気化学活性なビスアタリジン2は従来の絞っかのインターカレータなどと比較すると28 )ほほ

妥当な結合定数をもつことがわかり、さらに、その結合定数の算出法 (吸収スペクトjレを利用したScatchard解布T )についても信頼性

を示すことができた。

-71-

(7)

3-4 ONA-ビスアクリジン(2 )複合体のゲル電気泳動

幾つかのDNA結合性配位子は、ゲル電気泳動において結合しているDNA断片の移動度を遅らせることが知られている84、85)0 DNAは

負電荷を有する高分子電解質、そして一般にそれに結合する配位子は正に帯電しているので、ゲル電気泳動ではそれぞれは逆の方向に引かれることになる。複合体として泳動するためには、配位子はある程度以上の結合定数をもっ必要があるのであるが、 2をDNAの電

気化学的ラベル化剤として考えると、 DNA-2複合体が泳動中に解離してしまうようでは使い物にならない。そこで、 2のDNAとの結合力を評価するlつの手法として複合体のゲル電気泳動挙動を観察して、可逆的ラベル化剤としての可能性について考察した。

3 -4

^-

⁷ 結果と考察

pUC9-terRプラスミドDNAを用いて、下に示す程々の割合で2との複合体を形成させ(250C、 30分)、アガロースゲル電気泳動を行なった(図3 - 9 )。この写真をデンシトメータでスキャンした結果を図3- 1 0に示す。 DNAへの2の添加に伴ってDNAバンドの遅れとバ

ンドが消失していく様子がみられた。このゲルを約1時間ほど 2MNaCl水溶液に浸し、その後再びエチジウムブロミドに浸して染

色した結果を図3 - 1 1に示す。

ー72-

(8)

実験条件

レーン

DNA/μM-p 2/μM

43 。

2 43 0.43

3 43 4.3

4 43 43

5 À -Hind IIIマーカー

2 3 4 5

図3-9 _DNA・2複合体のゲル電気泳動挙動.

1%アガロースゲルで1OV /c mで泳動後エチジウムブロミドで染色

「コづ/

(9)

ハU41』E-

ヘ

0.01 0.1

[2]

_/

[DNA-p]

。

抑伴也純司祭

1.0 。 1.0 0 1.0

相対移動度

。

。 1.0

図3・9の写真をデン DNA-2複合体の泳部J挙動.

シトメータでスキャンしたもの.

図3・10

4 5 3

2

図3-9の

A-2複合体の泳動挙動

図3・11 D

ゲルを2MNaClaq処理して再びエチジウムブ

-

⁷⁴

-

ロミドで染色した

(10)

主にポリアニオンであるDNA の電荷を、正電荷を泳動の遅れは、

有する2が結合して中和したためであろう。

共存する2によってエチジ iつには、

ドの消失については I、;ノ

ドのDNAへの結合が抑えられた結果であるという可能性ウムブロミ

同ドによるDNAの染色は、

エチジウムブロミが考えられる。即ち、

染色の際共存ンという現象を利用しており、

じインターカレーショ

ドと競争的にはたらいていると考えるこする2はエチジウムブロミ

とができる。

ドで染色するという意図で2

M

N aCl水溶液で処理する操作を行なったが、ゲ

wm掃除志村苫骨

その後;エチジウムブロミ

間環状DNA

2をDNAから解離させ、

Î .05

Î .00

0.95

0.90

0.85

0.80 また、

O. Î 0 0.08

0.06 0.04

0.02

2 /塩基

図3・9の

A-2複合体のゲル電気泳動

Aバンドの形態万uの移動度.

図3

-

¹² D D

戸、J 寸/

(11)

ルの染色の度合は変わらなかった。これはゲル上のDNA が既に完全にエチジウムと反応していたことを意味する。このことから、

2の

濃度がある濃度以上になると複合体の電荷が完全に中和され、複合体は水に対して殆ど不溶化してしまうのかも知れない。従って、バンド消失のもうlつの可能性として、ごく低濃度のDNA複合体のみがゲル中を泳動していたとも考えられる。

図3^- ¹2には図3-9の結果をDNAの形態別にまとめたものを示す。

スーパーコイル型プラスミドDNAの方が、 2の添加に対し敏感に応

答することがわかる。これはインターカレーションによる電干苛の中和以外にDNAの形態変化(スーパーコイルの巻き戻し)が泳動に影響している結果と考えられる。

N aCl水溶液処理でバンドをみることができなかったのでエチジウムブロミド染色よりも高感度な銀染色86、87)によってDNAバンドを観察した。下に示した割合でプラスミドDNAに2 を添加し、泳動後、

銀染色を行なった。この実験条件を下に示す。

実験条件

レーン

DNA/μM-p* 2/μM

26，

35

^。

2 26，

35

0.026

3

^26.

35

0.26

4 26，

35

2.6

う 26，

35 5.3

6 26.

3S

²⁶

7 26.

35 S3

8 À -Hi_nd IIIマーカー

*エチジウムブロミド染色(図3・13 (a) ^{)では25μM-p，}

銀染色(図3・13 (b) )では35μM-pのDNAを用いた

ー76-

(12)

結果を図3-13(a)、

( b

)に示す。それぞれDNA 濃度26μM-p、

35μM-pで複合体を形成させ(250C、 30分間) 、泳動させたものであるが、いずれも電荷が中和された時点でDNAバンドが消失している。即ち、エチジウムブロミド染色で観察できなかったバンドは、

結局銀染色でも観察することはできなかったことになる。スペルミンなどのポリアミンを、 DNA溶液にある程度以上加えると不溶の沈澱を生ずることが知られている88)。

(a) 1 2 3 4 5 6 7 8

4EE' 、、ー，J'hu ，，ea、、

2 3 4 5 6 7 8

図3-13 DNA-2複合体のゲル電気泳動挙動. _レーン1�7はそれぞれ0， 0.026， 0.26， 2.6， 5.3， 26， 53μM の2を含む. (a)は26μM-pのDNAとの複合体でエチジウムブロミド染色， (b)は35μM-pのDNAとの愛合体で銀染色を行なっている. いずれも1%アガロースケー_jレ， 10V/cm

-77 -

(13)

従って、ここで用いたピスアクリジン2もDNAに対して、ある程度以上添加すると電荷を中和して複合体を不溶化してしまったという可能性が大きい。

ピスアタリジン2はアガロースゲル電気泳動において、

DNAとは

逆方向にヲ|かれるにもかかわらず、安定な複合体を形成して泳動中にほとんど解離することなく (電荷の中和点以降では複合体が観察できなかったという事実から)複合体として泳動することがわかった。次の節ではこの性質を利用して2の結合様式の検討を行なっている。

3

-

5

ビスアクリジン(2 )の結合様式

DNAへのインターカレーションは、平板状小分子がその疎水的な相互作用によって、 DNAの塩基対問を押し広げ、その問に挿入する現象である。したがって、 DNAに対してインターカレーションが起こるとDNA鎖が巻き戻しを受けると同時にかたくイ"，びて剛直な状態になり、そのためにその溶液の粘度が上昇する。

ここで DNAとして環状のスーパーコイル型DN A を用いると、インターカレータの添加に伴って、 DNAが初めから有していた負のスーパーコイルが緩和されていく。こうしてDNAの高次形態が流体力

学的に抵抗の大きな開環状に近づくにつれて溶液の粘度が上昇する。

さらにインターカレータの波度を上げてその緩和点を越えると

ー7…

(14)

DNAには今度は逆に正のスーパーコイルが誘起され溶液の粘度は減少する。

多くの種類のDNA結合性配位子の中でも、インターカレータのみがこのような非常に特徴的な流体力学的挙動を与え、例えばDNAのグルーブバインダーなどは添加によってプラスミドDNA溶液の粘度をほとんど変化させることはない。従って、粘度補j定を行なうことによって、その配位子のDNAに対する結合様式(インターカレータかグルーブノてインダーか)を知ることができる。さらに、インターカレーションの場合、用いた DNAのスーパーコイル密度、インターカレータの結合定数がわかっていれば、緩和点の波度からインターカレーションによる DNAの巻き戻し角まで求めることができる。

3

-

5

-

7

粘度滴定

予備的な実験として、初めに超音波照射イ子牛胸腺DNA(分子量キ 30000)を用いてピスアクリジン2の消定を行なった。結果を図3- 14に示す。

2の添加に伴ってDNA

溶液の粘度が上昇し、やがてDNA が結合飽和の状態になって粘度上昇が止まっていることがわかる。

しかしながら、仔牛胸j民DNAを用いた他の論文89 - 9 _I)と比較すると粘度の変化量がかなり小さかった。

そこで、スーパーコイル梢迭をもっ間環状プラスミドDNAを用い

て同様にして粘度前j定を行なった。結呆を図 3- 1 5に示す。負のスーパーコイルの巻き戻しと、正のスーパーコイルの誘起に由来する粘度変化がはっきりと現れており、ビスアタリジン2はインターカレ

ー79-

(15)

ーンヨンによってDNAに結合している L ^竺p

こコ

，--，ー・

、、、

「ー�

1.014

1 .011・-

1.007

1.004

1.000

0.00 0.04 0.08 0.12

[2]

/ DNA‘P

とが証明できた。

0.16 0.20

図3・14 仔牛j剛山DNA-2の粘度補定. 0.2mM DNA-p， lmM Tris- HCI (pH8.0) ，1 mM NaCI， 20.0:!: 0.1 oC

Cコ r-P一

、、、

r�

図3-15 1 .10 1.08 1.06 1.04 1.02 1.00

0.98 0

フラスミ

0.02 0.04 0.06

[2]

/ DNA-p ぜD A-2の粘度消定. O.4mM

0.08

DNA-p， lmM Tris-HCI (pH8.0) ，lmM NaCl， 10μM EDTA， 20.0:!:0.1 oC

-80-

(16)

3

-

5

-

2

ゲル電気泳動を用いた滴定

スーパーコイル型プラスミドDNAを種々の濃度のインターカレータ(ある程度以上の結合定数が必要)共存下でゲル電気泳動を行な

うと図3^- ¹5と同じ現象を観察することができる92)。ビスアタリジン2とキナクリンを種々の濃度で添加したプラスミドDNAのアガロースゲル電気泳動の結果を図3^- ¹6に示す。 2の存在下、明らかにccc

型DNAの形態変化の様子を観察することができた。

図3-16 ゲル電気泳動を月lv、たプラスミドDNA-2の滴定.

ωμM DNA-p， 3.75mM Tris-HCI (pH8.0)， 0.375mM EDTA，

レーン2�14はそれぞれ0， 0.31， 0.63， 0.94， 1.25， 1.88， 2.50，

3.l3， 3.75， 4.33， 5.00， 5.63， 6.25のインターカレータ(上段は2，下段はキナクリン)を含む. レーン1，15は).-Hind ^III

マーカー，混合物の平衡到達後1%アガロースゲルで電気泳動(10V/cm)，エチジウムブロミドで染色，・のレーンがスーパーコイルの緩和点

-8 1 -

(17)

即ち、

2の添加に伴うインターカレーションによりcc cのバンドは負

のスーパーコイルの緩和を受けて流体力学的抵抗が大きくなり移動度が小さくなる。やがてスーパーコイルが完全に緩和されると、見掛け上oc と同じ形態、になり移動度も一致する。さらに2

が添加され

ると、逆に正のスーパーコイルにより再び抵抗が減り移動度も大きくなる。

しかしながら非常に興味深いことに、同程度の結合定数を有するキナクリン共存系(図3-16下段)ではこのような現象は観察されなかった。 2は正電荷、 DNAは負電荷をもつため、ゲル電気泳動では両者は互いに正反対の方向に移動しようとするはずである。両者が複合体として共に泳動するためには、ある程度以上の結合力が必要なわけであるが、一般にその結合定数は104-- 105M-!以上でなければならないと言われている84)o しかし図3- 1 6の結果をみるとキナクリンは完全に解離しており、この条件だけでは十分ではないことがわかる。この場合、ゲル内を移動するわけであるから、常に平衡がずれることになるので平衡定数よりもむしろ速度定数を考慮しなければならないのかもしれないO しかしながら、これはゲル内での出来事であり、均一溶液中の結合定数や速度定数で議論することは難しい。したがって、この場合の2とキナクリンの差を簡単には説明できない。

いずれにしても、図3 - 1

6のとおり、

ピスアクリジン2

添加系にお

いて粘度滴定で観察したのと全く同じ現象をみることができた。粘度計を用いた消定では1回の測定で数百マイクログラムのDNAが必要であるが、このゲjレ電気泳動を利用した手法では数百ナノグラムで充分であるので

、

この手法を用いて2のDNA結合の際の巻き戻し

角併を求めることにした。

-82-

(18)

。∞0.oho

ωω0.

。ω0.ohm0.。門的0.00ω0

.o

h寸C.O-寸寸0.0

0寸

0.00円0.0OF0.0 。-Rlp

、、E・'''LU /'z、、

(a)

oho-0 0ω0.。

ωω0.0

門的0.0

0ω00

ド寸O.C

.寸寸0.0

「寸0.0

山門0.。

∞の0.0

0の0

.。

ωF0

0 .0

f，，、、、、、lノ，q |宍lp

ー宍!?O∞0.白oho-0 0ω0.o uω0.0 門的000ω0.o h寸0

.0

寸寸0.OF寸0.。∞門0.00の0

.。

ωF0.C O IR-P

(c)

3.75mM Tris-HCl ゲル電気泳動を月]いたプラスミドDNA-2の滴定.

図3-17

(pH8.0) ， 0.375mM EDTA. (a)， (b)， (c)， (d)はそれぞれ16，32，48，80μM DNA-p 各写真上部の数値はr=[ 2]/[DN A-p]の値を，・は緩和点を示すマーカ

を合む

ーにはÆ -HindIII断片を，J:I1v、た.各試料平衡達成後0.7%アガロースゲルで電気泳動(10v/cm) .泳動後エチジウムブロミドで染色

-8

(19)

幾つかのDNA濃度(NT)で、図3 - 1 6と同様の実験を行なった。結果を図3-17(a)、 (b )、 (c)、 (d)に示す。

いま、一般に配位子とDNAの平衡状態を考えると下の式が成り立つ。

CT =Cb+Cf

^{〆，，‘、} ^噌''A ^ハU ^{、、，，，，}

ここでC Tは全配位子濃度、 Cbは配位子のうちDNAに結合したものの濃度、 Cfは非結合種の波度である。そこでDNAの座席占有率ν は

次のように定義されるので

ン =Cb/NT ^{〆，，、、} ¹ⁱ ¹ⁱ ^{、、，，ノ}

式( 1 1 )を( 1 0)に代入すると次のようになる。

CTニν NT+Cf

( 12)

いま、 DNAのスーパ- コイルを完全に緩和する(粘度消定での極大点、ゲル電気泳動でのc ccバンドがoc に一致した点)ときの座席占有率を ν?とすると

CT'=ン'NT'+Cr'

( 1 3 )

ここで

CT'、 C

f'、 NT'はそれぞれ緩和点での全配位子波度、非結合型配位子波度、全DNA i度度である。

図3_- 1 6、 1 7の結呆を式( 1 3 )に迎用すると、 NT'- CT'プロットの傾

ー，、4-

(20)

きから容易にン『を求めることができる。このNT'- CT'プロットを図

3 _ 1 8に示す。

4.0

ユ

、、、

仁〉← 2.0

1 .0

0.0

ノ

。 20 40 60 80 100

N�' / uM

図3・18 2のNγ-cγプロット. 図3-16， 17の各写真での緩和点(・)の条件をプロットした * は図3-

16のデータであり，設定条件の幅が大きいため大きな誤差を合むので線型最小二釆法の計算からは除外した.最小二釆法より

Cr'=0.042NT'+ (7 .8x 108) -ν'=0.042

ー，、コー

(21)

図3-1 8の結果から2は、用いたpUC9-terRプラスミドDN Aに対し、

ン'=0.042の結合でそのスーパーコイルを完全に緩和することがわ

かった。しかし、 2のインターカレーションの際の巻き戻し角併を求めるためには、用いたDNAの有していた固有のスーパーコイル密 j支を矢口らねばならない。

そこでこれを求めるために、 pUC9-terRプラスミドDNAのエチジウムブロミドによる粘皮泊定を行なった。結果を図3-19に示す。

1 .06

1.04

1 .02

07

、、、、

rr-

1 .00 '--

0.98

0.96

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

[EtBr]

_/

[DNA-p]

図3-19 エチジウムブロミドを用いたpUC9-tcrRプラスミドDNAの粘反消j定. O.4mM DNA-p， 9mM TrÎs-HCI (pH8.0) ，0.9mM EDTA， 90mM NaCI， 2.8Srv{ CsCI， 20.0 :::t:O.lOC

ーハ6-

(22)

図3_-1 9で得られた極大点はエチジウムブロミド2.75xlO・5Mの点であった。 DNA 濃度は4xlO・4M^_pで行なっており、さらに文献93)からエチジウムブロミドのDNAに対する結合パラメータK、 nはそれぞれ2.45xl04M.1， 0.241とわかっているのでこれらの値を次式に代入する。

CT'=ν'NT'+Cr'

( 14) ν'=KCr'(n-ν')

代入してできた連立方程式を解くとン'=0.045

となるo DNAのスーパーコイル密度、 σ。は次のように定義される。

σ。=

^- 1

0併ν'/1 80 ( 1 5 )

ここで併はインターカレータ(ここではエチジウムブロミド)が DNAに結合する際にDNAに与える巻き戻し角度である。エチジウムブロミドの巻き戻し角度は従来12。と言われてきたが94 )、最近になって260 という説が有力になり9⁵)、最近の報文ではほとんど 260 という他を採用している。従って、ここでも式(1 5 )に手=26。

と、先に紀j J支治定から得たン'=0.045を代入すると、用いたプラス

、ドDNAのスーパーコイル箔:度σ。は

σ。=-0.065

であることがわかった。このイ直は、下に示す他のプラスミドDNAの

-87-

(23)

σ。値92)とほぼ同程度の値であることがわかった。

S Y40 ColE

1

pSC101

σ。=-0.050 σ。=-0.078 σ。=-0.085

そこで図3- 1 8 から求めた値ν'=0.042とσ。=ー0.065を式( 1 5 )に代入すると、 2の巻き戻し角度は

件=28

となった。同じ複素環をもっモノインターカレータであるキナクリンの巻き戻し角は17。 89\ アルキル鎖をリンカーとするピスアクリジンの巻き戻し角が260 28)である。これらのことを考えると、 2 は則待した通りDNAに対して、 2つのアクリジン環をいずれもインターカレートさせたビスインターカレーションにより結合している

ことが示唆された。

3

-

5

-

3 考察

イ子牛j胸腺DNAを用いた粘反消定では、インターカレーションに特徴的な粘度の上昇が飢察された

。

しかしながら他の報告89 - 91) と比べるとその変化量はあまりに小さいO ここで用いたDNAは分子量 30000であり、これらの報告で用いられているDNA(分子量5x105) よりもかなり短いために大きな粘度上昇がみられなかったものと考

-88-

(24)

えられる。今後は超音波照射H寺の出力、 DNA溶液の濃度などを考慮して分子量を調整する96・97 )必�がある。

スーパーコイル型DNAを用いた粘皮滴定でも、この相互作用がインターカレーションであることを示す特徴的な結果(極大点を有する粘度変化山線)が得られた。

しかしながら、ここには注意深く考慮しなければならない点が幾っかある。それは、この実験で用いたDNAがスーパーコイルを有している閉環状のccc型と開環状の oc型の混合物であったという事か

ら生じる次の2点である。

1 )共存しているoc型DNAが粘度変化に影響を与えないか。

2 )インターカレータは、 ccc型とoc型について結合定数が異なるのではないか。

1 )については、 Vinogradら93 )によってほとんど影響されない

ことが示されている。彼らの実験結果を図3^-²0に示す。図をみて明らかなように、 ccc型DNAの粘度変化量に比較してoc型DNAの粘度変化は僅かなものであり、試料溶液中にoc型DNAが混合していても粘度の極大点をシフトさせるほどのものではないということがわかる。しかしながら、 oc 型 DNAは、流体力学的に抵抗の大きな形態を

しているため浴液全体の粘度(はじめから有している粘度)が上がり、インターカレータを添加したときの相対的な粘-度の変化量が小さくなり、測定の精度が多少下がることが予測される。

2 )の点については、

インターカレータは碓かにccc 型と oc型について異なる結合定数を有することが知られている。 Davidsonは、

彼の論文9⁸)の中でこの辺白について詳細に述べているがこれを�約

-89-

(25)

--‘、

、、__.，ιrl IU _，.- C

。

一一一。^{一一一一一--0}

1 1 ^r ，f井」

60 I∞ 14D 180 J∞

Yolume ethiùium bromiùe 3ùùeù (lll.)

図3-20 ccc型DNAとoc型DNA (PM2DNA)のエチ

ジウムブロミドによる粘度滴定. 9mM Tris-HCl，

0.9mM EDTA， 90mM NaCl， 2.85M CsCl， 200C， 0は

閉環状(ccc型) ，口は開環状(oc 型)のPM2溶液での結果.文献93より転写.

-90-

(26)

すると以下のようになる。

負のスーパーコイルを有するプラスミドDNA (環状DNA)は、

その分子全体のdBりや、結合のひずみのためにもともと正の自由エネルギーをもつことを余儀なくされている。一方、インターカレーターは、そのDN Aへの結合に際してDNAの2重らせんを巻き戻し、

結果としてDNA分子全体のスーパーコイル数を変化(増加)させることが知られている。

このためにインターカレータがcccDNAに結合すると、結合の際に負のスーパーコイルが緩和され、ひずみが解消されるために、

DNAは、もっていた正の自由エネルギーを放出することができる。

したがって、 ccc 型/0 c型の混合溶液にインターカレータを添加してゆくとき、 ccc型DNA の負のスーパーコイルの緩和が起こる問(インターカレーションにより負のスーパーコイルが完全に緩和される前、即ちD/P比の小さいとき)は、インターカレータは c cc型DNA の方により強く結合するだろう (ccc 型DNAへの結合は、単純なインターカレーションに伴う自由エネルギ一変化、 6Gと、ひずみの解消により得られたムG' の和で考えることができるのでoc型DNAへ

の結合より6G'の分だけ安定)

また、インターカレータの結合によって逆の正のスーパーコイルが誘起される過程(負のスーパーコイルが使い果たされた後、即ち D/P比の大きいとき) では、これとは逆の理由でccc型DNAには結

合しにくくなる(逆にムG'の分だけoc型への結合よりも不安定)。

インターカレータのccc型DNA、 oc型DNAへの結合定数をそれぞれ、 K ccc、 Kocとすると、これらの値の問には次に示す関係があることを前述した迎論から導くことができる。

-91-

(27)

Kccc/Koc=exp(-g'(σ)ム τ/RT)

( 1 6)

ここでg'(σ)はDNAの1 0塩基対のもつ自由エネルギ一、 σはスーパーコイル密度、ムではインターカレータの結合によるスーパーコイルの巻き数の変化、 Rは気体定数、そしてTは絶対温度である。

式( 1 6 )からわかるように、 DNAにスーパーコイルが全くないとき

は'(σ)⁼0のとき) はKccc=Kocとなる。即ち、粘度滴定においてその粘度の極大点では、インターカレータは、 ccc型DNAとoc型DNA に対して同じ結合定数で結合するために、 oc型DNAの混入のためにその極大点がどちらかにシフトすることはないと考えてもよい。但し、やはり1 )の場合と同様に測定曲線の極大点のブローデイングを起こす原因になるかも知れない。

このようにoc型DNAの混入のために生ずる2つの疑問、 1 )、2) は粘度滴定の結果を本質的に左右しないと考えてもよいO したがって、今回用いたようなかなりのoc型DNAの混ざったDNA試料を用いてもインターカレータの巻き戻し角併を求めるのにはなんら支障

はないと考えてよいだろう。

本節では、ゲル電気泳動を用いて巻き戻し角を求めたが、この手法は過去にも数例報告されている。しかしながら、それらはいずれもゲル中にある波度でインターカレータを共存させて行なっている。

即ち3 ^- 5 -2で述べた式(1 3 )のC f'一定条件を作っているわけである。

この方法でインターカレータの境界いからーへ移動する)がDNAバンドと交錯する前に泳動を止めれば、泳WJJ中のインターカレータの DNAからの解脱は考慮しなくてもよい。

これに対して本系は、はじめからゲル中にインターカレーターをれておくことはせず、

lìiに試料中に所定の濃度、 CT'でインター

-92-

(28)

カレータを添加し、 DNAとの複合体を調製しておくだけという非常に簡単な操作である。インターカレータは通常カチオン性、 DNAはポリアニオンであるので、電気泳動では両者は逆方向に泳動しようとするはずであるが、ここで用いているピスアクリジン2は明かに DNAとの複合体としてDNAと共に泳動した。

Nielsenらも2と同様なポリアタリジン誘導体で同じような現象が観察されたことを報告している84 )。エチジウムブロミド92)や図3-

1 5で示したキナクリンでは、泳動中に解離してしまう。したがって、

DN Aと共に解離することなしに泳動するには、 DNAとかなり強い親和性をもたねばならないと考えられる。 NielsenらはDNAと共泳動するためには少なくとも105M.1以上の結合定数が必要であると述

べている。さらにその解離速度も重要になってくるが、いずれにしても、この手法を適用できるインターカレータの条件として均一系の平後!r定数や速度定数をそのまま使用することはできない。何故ならば泳動媒体のゲルは不均一系であり、しかもその中でDN A-インターカレータ複合体は非常に濃縮された状態で存在している。したがって複合体の共泳動を説明するには何か他の要因を考慮しなければならないと考えられるが、現在のところ詳細は不明である。

ここで求めた巻き戻し列は、泳WJJ中に2が解離しなかったものと仮定して求めたものである。しかしながら、その証明は行なっていない(Nielsenらは3H標識したインターカレータにより解脱してい

ないことを証明している)ために、得られた千佑は、あるいは正石在なイ直ではないかも知れない。泳動中に、もしインターカレータの解剖r�が起こっていたとすると、 DNAはゲルヰlを泳到しながら再びスーパーコイルを巻くことになる。したがって、インターカレータが解

離した分だけ見かけのスーパーコイルの緩和点は、

DjP比の大きい

-93-

(29)

方にシフトすることになるであろう。

つまり、ここから求まる巻き戻し角千値は真の値よりも小さめに見積もることになる。したがって、この系でもしインターカレータの解離が起こっていたとしても巻き戻し角は千詮28。となり、

2が

ピスインターカレーションによりDNAに結合しているという結論は変わらない。

3

-

6

ビスアクリジン(2 )の結合配列選択性

3

- 5より、ピスアタリジン2はビスインターカレータとしてDNA に結合していることがわかった。そこで、 2はDNA のどういう配列に女子んでインターカレーションしているかを石在かめるため、 2 - 5

と同ネ柔に、 DNaseIフットプリンティングを行なった。

3

-

6

-

7

結果

図3-2

1に2のフットフリンティングの結果を示す。 DNA

はpUC 19 のEcoRI-PvuIIフラグメント(232bp)のS'末端を32Pでラベルイヒしたものを朋いた。

同じDNAフラグメントをMaxam-Gilbert反応後、平行して泳動させた。図3^-2 1 では、約140bのシークエンスを読み取ることがで

-94-

(30)

きた。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

-95-

図3・2 1 2のDNaseIフットプリンテイング 6 . 6pMDN A-p，

3mM Tris-HCl (pH7.5) ， 3mM NaCl，レーン 1�8はそれぞれ，0，

0.25，0.33， 0.50， 0.66， 0.83， 1.00，0 の2を添加している.レーン9，10 はそれぞれMaxam-Gilbe口のNG，

crr反応.8%ポリアクリルアミドゲルで2000Vで泳動後，X線フィルムに感光.

(31)

このレーンとの比較より、

2には(少なくともここで用いたフラグ

メントのシークエンス巾では)明らかな特異的結合は観察されなかったが、若干ながらGCよりもAT部位に好んで結合していることが

わかった。

3

^-

6

^-

2 考察

2はAT選択性をもつことが明らかになった

。これに対して2^-

5 -

lでは、 1は5'-CG-3'、グーGG-3'、グーGC- 3'に選択的に結合することを述べた。全く同じアクリジン環をもっこれら2つのビスアタリジンがそれぞれGC選択性、

AT

選択性という異なる選択性をもつのはなぜ、であろうか。

1と2の梢造の違いはいうまでもなくその機能性

連結鎖の分子構造である。

ここで用いている6-クロロー2-メトキシー9-アミノアクリジンなどのような比較的極性の高い環構造(アタリジン環中の窒素のpKaは

約10なので中性領域ではプロトン化している)をもっインターカレータは、 GCリッチな部位に、逆に極性の低いものはATリッチな部位に結合しやすいことがMωle r7)やWilsonら99)によって示されている。

1の選択性(GC選択性)に関しては、もともとアタリジン環の有

していた選択性が残ったか、あるいは2つのアタリジン環を単純に述結したことでさらに GC選択性が強くなったものと考えられるo HIJち、その述結��íであるペンタエチレングリコール鎖はその配列選択性に関してはほとんど影響力をもたなかったと考えられる。

一方、

2の選択性(AT選択性

)に関しては

、

連結鎖であ

るピオロ

-96-

(32)

ーゲン構造によって大きく影響を受けていることがうかがえる。 3

- 3 - 1で示したように、

2は実験条件のpHではジカチオンイ本として

存在している。

その構造上、 1とは全く異なって、インターカレー

ト部位のアクリジン環上には、もはや正電荷はなく、連結鎖であるピピリジニウム上に2つの正電荷が存在しているのである。即ち、

インターカレータ部分の極性は1よりも低く(無電荷)なっており、

代わりに連結鎖部位の極性がかなり高いのでその選択性は全く変化しても不思議なことではない。

一般に、 DNAのマイナーグルーブに結合するいわゆるグルーブパインダーは、静電的な相互作用や、水素結合などで王にDNAパックボーンのリン酸部位に結合する。結合基間の距離の差や、そのコンホメーションの最迎化のために、結合に際しては、 DNAパックボーンへの歪みが余儀なくされる。塩基対聞に形成される水素結合の数の違いからくるものと考えられるが、 ATリッチな部位はGCリッチ

な部位よりもその構造が柔らかいということが知られている。このためにグルーブバインダーは歪みをより受け入れやすいAT部位に

選択性を持つことになる100) 。

ここでフットプリンテイングを行なったピスアタリジン2は、インターカレータとして相互作用していることを3 - 5で示したが、

興味深いことにその選択性は連結鎖であるピオローゲンに支配されている。つまり、

2はピスインターカレータでありながら

、連結鎖に強制的に正電荷を導入したことでグルーブパインダーとしての性

質を強く持-ち、 AT選択性をもつに至ったと考えるのが妥当である。

-97-

(33)

3 - 7 ONA-ビスアクリジン(2 )複合体のゲル漉過

生体試料の分離・分析・精製において、現在では非常に簡便な手法としてゲルろ過を用いることが多くなってきている101、102)。

一方、電気化学的プローブ2を用いたDNAのクロマトグラフによ

る分離・分析において、電気化学的にDNAを検出するためには、 2 がカラム移動中にDNAから解脱せず、 DNAとの複合体として溶出しなければならない。

本節では高速液体クロマトグラフイー(HP LC)による、 DNA-2 複合体のゲルろ過の溶出挙動を観察した。

3 - 7 - 7 結果と考察

仔牛胸腺DNA (分子量キ30000)に種々の濃度比で

2を添加し、

複合体を形成させた後に、この試料をHPLC (TSKgel Oligo-PW

に注入した。代表的なクロマトグラムを図3-22に示す。

DNA単独の溶出時間と同じ時間にDNA-

2の複合体が溶出した。

また、添加した2はほぼ全て定量的にDNAとの複合体として溶出し、

カラム移動中にはほとんど解離しないことがわかった。従って、このピスアクリジン2はクロマトグラフ的手法を用いた

DNAの検出に

おいて可逆的なDNAのラベル化剤として利用できる可能性があるこ

とが示された。

また

、

このとき2の濃度を、 DNAの負電荷を中和できる濃度以上こ上げると複合体が全く溶出しなくなることがわかった。このこと

-9 8-

(34)

は3・4 - 1のゲル電気泳動において観察された現象と一致する。従って、既に述べた通り、 D

NA-2複合体は電荷が中和すると水に不溶

になると考えられる。

0.12 A260(DNA-2)

0.04 A430(DNA -2) 0.08

Mm叫}mg

。 1 2

保持時間/分

3

吋13・22 DNA， DNA-2複合体のゲルろ過のクロマトグラム

1.15xl0AM DNA-p (仔牛胸Jlf�DNA ) ， 10μM 2，カラム:TSKgcl Oligo-P\V，流速:1.Oml/min，溶的支:1 mM Tris-HCl

(pH8.0) ，0.1 M NaCI

-99-

(35)

3

-

8

ONA-ビスアクリジン(2)複合体の電気化学的挙動

3 - 3 -- 3

- 7 �íJの紡糸から2のDNAとの相互作用に関する程々の

'li'Í紘一結合定数、結合4111J14性、結合様式ーを得ることができた。しかし、本信で目的とするDNAのむ気化学的検出の可能性を検討するためには、 o NA-

2複合体の氾気化学的性質を女nらねばならない。

さらにそのむ気化学的挙動から、 DNA-2の相互作用についてより多くの情報も得ることができるはずである。本節では、この具体的方法

としてサイクリックボルタンメトリーを用いて複合体の電気化学的性質を観察した。

3

-

8

-

7

結果

2単独、 DNA-

2複合体のボルタモグラムを図3- 23に示す。

ピオロ

ーゲンの酸化還元に基づく2つのピークが観られた。ピスアクリジン2はDNA結合状態でも同様に酸化還元活性であり、電気化学的プローブとしての可能性を示している。

3

-

8

-

2

考察

D

_N

Aの

添 ^加 ^に ^伴 ^って^ピーク電流 ^他^の減少^と ^ピーク電 ^位^の ^{シフ} ^トが観察 ^さ ^れ ^た。ピーク電流^値^の減少^は、電気化学活性な _ピスアタリ

-100-

(36)

2 2-DNA

E I V

^vs.

Ag/AgCI

図3-23 2， DNA-2複合体のサイクリックルタモグラム. O.lmM 2， lmM DNA-p， O.OSM KCI， 10mM C田S (pH9.0) ， 10%DMSO，

作用極:グラッシーカーボン，対極:白金板，掃引速度:120mY九cc

句EBムハU噌EEA

(37)

ジン2がポ1)マーであるDNAに結合したためにその活量が減少したためであると考えられる。ピークitt1立は、 DN A非共存下、 E pc=ー 4 35m V、 Epa=-340mVで El/2=-388mV(V2+jV+・系)であった。ま

た、ピークセバレーションも95mVと、比較的良好な可逆的酸化還元を行なっていることがわかった。これに1mMのDNAを添加すると7正イ立はJ:�の方向にシフトし、 Epc=- 600m V、 E pa=-395m V、

E 1 /2 = -4 9 8 m Vであった(6 Ep=205mV)。即ち、 DNAの添加に伴いむ{立は-1 10mVシフトしたことになる。

図3-2 3の条件(lmM-p DNA、 O.lmM 2)では、ピスアクリジン 2はその結合定数から、全てDNA結合型として存在していると考えることができる。このo NA-2の結合平衡を考えるとき、いま式(^{1 7 )}

示すミIZ �J式が成立していると仮定する。

Lox + DNA + e

Eくf Lred ₊ DNA

EOf，

H

^Krcd ⁽¹⁷⁾

Kb

Lox-DNA _{+ e} Lred-DNA

EO b

ここでLは酸化還元活性なDNA結合性配位子(ここではビスアクリジン2)、 OX'\ redの添え字はそれぞれ酸化型、還元型を意味する。

即ち、 Kr、 Kbはそれぞれ解離型、結合型の2の酸化還元平叙ir定数、

Ko.-.:、 K

rcdはそれぞれ酸化型、 j芝元型の

2のDNA

との結合定数を示す。

この熱力学的サイクルからネルンストの式より

EOj-EOft=0.0591

o

g(K

^r^{c d/K}^{o x}⁾

( 1 8 )

ー102-

(38)

が成り立つ。この式( 1 8 )に図3- 23で得た酸化還元電位のシフト値、

-110mVを代入すると

Krcd/Kox=Kb/Kf=0.014 ( 19)

と計算できる。この式から2のDNAに対する結合定数は酸化程の方が還元程の約70倍(1/0.014)の大きさをもつことがわかる。言い替えると、 2は還元されてその正電荷がlつ減るとDNAとの結合定数が70分のlになることを示している。また、式(1 9 )の後半からは別の言い方もできる。 Ø[Jち、 2はDNAに結合して静電的に安定化すると還元され難くなるのである。いずれにしても、この2のDNAと

の相互作用には、静電的な寄:与が非常に大きいことがわかる。

金属錯イ本のDNAとの結合に関して同様の考察をB^ardらが行なっている69、70)。彼らの結果では、 Co(phen)33+/2+は疎水的因子(インターカレーション)が ( E Ob'_ EOf '>O ) 、 Co ( bpy) 33+ /2 +や

Fe(bpy)33+1れでは静電的因子が(EOb'-EOf'<O)結合を支配しているというものである。この結合の性質に関する差異は、配位子であるフェナンスロリンとピビリジンの速いによるものである。

即ち、フェナンスロリンは平面性の複素環であり、 DNAにインターカレーションすることが可能であるので、 C⁰( P h e n ) 33+ 12 +はDNA のグルーブに涼く入り込んで結合しているため比較的疎水性の高い環境中に存在することになる。それに対して、ピピリジンは非平面性であるためDNAにインターカレーションはできず、 CO(bpy)33+/2+

はDNAの外部の親水的な環坑中に存在するわけである。

本章で取り扱っているピスアクリジン2は、 3 - 5においてインターカレーションしていることを示したが、この場合、先の

-103-

(39)

Co(phen)3)・/2・とはJ込なってインターカレート部位と酸化還元活性行1) 1si:はUI� ^l1，ir.的にかなり間r:れているo [111ち、アクリジン音日イ立はDNA内部の自るた対!日jの政水的な託1)位に抑入して安定化した状態、でも、正電不可をもっピオローゲン百1)位は極性の高いDNA外部に安定して存在できると考えられる。したがって、

2はピオローゲン部位で静電的結

合をし、さらにアクリジン部で疎水結合(インターカレーション) をしていると考えられるが、それらの相互作用が別々の場所で比較

的独立してはたらき得るために、その結合定数は強い相互作用一静定的相互作用ーに支配されていると考えられる。

また、この結果は3 - 7で述べた2のAT選択性と一致する。即ち、

この節で述べているように、 2の結合は静電的相互作用に支配されているためにグルーブパインダーとしての性格を強く持ち、結果的にAT 選択的結合となっているわけである。

このように、 DNA結合性配位子に電気化学活性基を導入することによって、 DNAの高感度検出のための可逆的ラベル化斉Ijを実現できるだけでなく、その複合体の酸化還元反応、からDNA-配位子相互作用の新たな↑育報を得るための新しい方法論としての可能性を示すことができた。

ー104-

(40)

3- 9

ビスアクリジン(2)を用いたONAの光化学的切断

本章の初めで述べたように、ピスアクリジン2の連結鎖であるピオローゲンは強力な電子受容体としては代表的な分子であり、しかもそのl電子還元休はDNA を切断し得る活性酸素程を発生させることが知られている。さらに2はインターカレータとしてだけでなく、

増感剤としてもはたらき得るアクリジン環をも分子内に有している。

従って、可視光照射に続く分子内の光誘起電子移動反応、により効率的にビオローゲンのl電子送元体を生成させることができれば、

2

はDNAの光化学的切断試薬としての可能性をもっと考えられる。

この節では、ピスアクリジン2 の光切断試薬としての活性を種々の手法を用いて検討した。

3

-

9 - 7

プラスミドONAの光切断

初めに、切断活性に及ぼすピスアタリジン2の濃度依存性の検討を行なった。

pBR322プラスミドDNA (cc c型)に程々の濃度で2を共存させ、超高圧水銀灯を用いてこれに可祝光( À詮390nm)を照射して切断の様子を飢察した。ゲルむ気泳動後のゲルの写真を図3 - 24に、さら

にこの結以:をデンシトメータで定量化し、その切断数を、ポアソン分布に従ってプラスミドDNAl分子あたりの数に換算した結果1^{03 )} を図3-25に示す。

2の濃度の増加に伴って明かにDNAの切断が進行

しており、

2がDNA切断活性を

有していることを示している。

-105-

(41)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

図3・24 プラスミドDNA切断における2の濃度依存性.

46μM DNA-phosphate，リン酸緩衝液 (pH6.9) ，レーン lはコントロール，レーン2から11はそれぞれ0，1，5， 10，

20，30，40，50，60，0μMの2を含む.レーン1を除いて全て可視光照身す20分.

1.5 1.3

1.0

道ま者 ^0.8

B

0.5 0.3

0.0

。 4 8 12 16 ₂₀

[2 ] /μM

図3-25 プラスミドD NA切断における2の濃度依存性.図3-24の結果をデンシトメータで定量化し，プラスミドDNA 1分子あたりの切断数に換算したもの.

-106-

(42)

次に、切断活性の光照射時間依存性を観るために、図3-24のレーン5の条件で反応溶液を調製し、これに0-..60分間光を照射した。また対照化合物として下に示した化合物(ピスアクリジン2の構成成分)についても同様の検討を行なった。結果を図3-26に示す。

D

HN./'""、、/へBr

CHっ0_ --.. よ A

M 、イF 、もザ' 叫ト〆、、

\ ノクム、.，づ人、 JタJ...

、." N守 � 、 C I

3

山。ぺ3NL

^cH3

(a) 1 2 3 4 5 6 7

2 3

4

₅ ₆ ₇

」通E宮古一

^{匝孟::::ãï:I} ^五面白

圃圃圃圃圃・ー�ー『圃園田ーーー一一一一.

ーも‘

孟二二一一 iI 当

I ヨ

2 3 4 5 6 7

図3-26 DNA切断の光照射時間依存性. 62μM DNA-phosphate，リン酸緩衝液(pH6.9) . (a)の上段，及び(b)， (c)はそれぞれl∞μMの2，3，4を含む. (a)の下段はコントロール(光照射は他と同様に行なっている) .レーンlから6はそれぞれ0，5，10，20，40，60分の照射を行なったもの.レーン7はÀ -HindIIIマーカー.

ー107-

(43)

2が共存するときのみ、わずか5分間の照射でDNAの切断反応、が効率良く進行していることがわかる。この反応、は興味深いことにトリス緩衝液(lOmM Tris-HCl、 lmM EDTA)を用いた際には全く進行しなかった。さらに、 3も非常に効率は悪いが、わずかにDNA を切断することはできた。しかし 4には全くその能力はなかった。

これらの実験結果から大きく分けて次の3つの反応機構の可能性を考えることができる。

1 )光励起されたアクリジン部位からの分子内電子移動によりピオローゲン部位がl電子還元体となる。これが溶液中に溶存

する酸素を還元してDNA に損傷を与えることが知られているスーパ-オキシドイオン、 02ーなどの活性酸素粒を生成する。

2 )アクリジンはメチレンブルーやローズベンガルと同様にl重項酸素、 102 Cムg)を発生させるのによく使われる増感剤である104)O 1 02は、通常の基底状態の302よりも酸化力が強く、

例えばリボース環やグアニン塩基などを酸化することができると考えられる。

3) 4つの塩基のうちで最も酸化電位の低いグアニン(G)などが励起されたアクリジン部位、あるいは電子移動後のアクリジンカチオンラジカルにな子を奪われる105、106)。この反応によりDNAは非'ぷ'に切断されやすい脱プリン部位を生じる。

この反応を行なう際に期待していたのはもちろん1 )の機椛である。しかし、 1 ) の反応、を促進する(犠牲試薬としてはたらいてピ

ー108-

(44)

オローゲンからアクリジンへの逆氾子移動を抑える)はずのTr_is、

EDTA共存系では逆に反j必が抑制される結果となったために2 )や 3 )の機仰の可能性を考えたわけである。しかしながら、 1)の機イほから生成すると考えられる最も反応、性の高い活性酸素種、 OH.などは、あらゆる有機化合物と拡散律速で反応、することが知られている107)。 T_r_isやEDTA は、 DNAに比べて反応溶液中に大過剰に存在するためにOH.のクエンチャーとしてはたらいたと考えればここで

1 )の機桃を否定することはできないO

3-9-2

反応機構の検討

1 ) の機構でDNAの切断反応、が進行するためには、可視光照射により2の分子内で電子移動(励起アタリジン→ピオローゲン) が起こることが必要条件である。そこで2への定常光励起によりその可能性の検討を行なった。

2に対-して大過剰のEDT

_A (犠牲試薬) を含む溶液を調裂し、これをアルゴン置換により脱酸素した後密封

して可視光(え孟390n m )を照射した。得られた吸収スペクトル変化を図3-27に示す。

照射に伴って、数分で溶液の色が青色に変化する様子が観察された。吸収スペクトル上では光照射に伴って600nm と400nmの吸収の増大が観測された。このl反収はピオローゲンのl 電子還元休に特徴的なものであり、これによりアタリジン部位からピオローゲン部位への光誘起1電子移動が実際に起こっていることがわかった。しかし、さらに照射を続けると今度は420nm付近のアクリジン環に由来

ー109-

(45)

0.06

8

0.02 0.04 並区米

�

。 400 500 600 700 800

波長/nm

図3・27 可視光照射に伴う2の吸収スペクトル変化. _4μM2， 40mM

EDTA (pH8.3) _， ^アル^ゴン_ガ^{スバ}_{プリ} ン_グ後密封_し_，超高圧水銀灯_を用いて可視光( À孟390nl11

)を!照射.

ハU司BEE--喝aEEE-

(46)

するピークが消失した(データは示していない)。このことからアクリジンの酸化還元は不可逆的で、光照射により一度酸化されるとその環構造が崩れると考えられるので、 1)の機構において2は触媒的にターンオーバーを繰り返して効率的に02 -.を何度も発生させることは難しいと考えられる。

同様の実験を仔牛j拘!保DNA (超音波照射後、フェノール抽出によ

り精製したもの)共存下でも行なったが、ピオローゲンの1電子還元体の蓄積は認められなかった。犠牲試薬であるEDTAは負の電荷を有しているためにアニオンポリマーであるDNAに結合している2 に近づくことができず、分子内の逆電子移動の速度が勝ったものと

考えられる。

次にpoly(dA-dT) 、 poly(dG-dC)の添加に伴う3及び2の蛍光強度変化をそれぞれ図3-28(a)、(b ) に示す。 3の場合、 poly(dA-dT)の添加により蛍光強度は単純に増加し、逆にpoly(dG-d C)を添加すると減少した。

これまでにもpolyd Gやpoly(dG-dC)などがDNA結合性の色素の蛍光を消光することは広く知られているが1 0 g、1 09)、これはGのドナー性が4つの塩基のうちで最も5jiい1 05 ) (最も酸化電位が低い)ためであり、先に述べた3 )の機構でもっぱらGが切断されるのもこのためである。

従って、ここでも poly(dG-dC)添加系のみで蛍光の消光が観察されたのは、光似)ßされたプロビルアミノアタリジン3がGによる還元的電子移動消光を受けたものと考えられる。一方、 po1 y(dA-d T)添加!で蛍光が増大したのは、結合によりアクリジンの無報射的な熱失活のパスが抑制されたためであろう。

句EE'At，BA 'EEEA

(47)

•

poly(dA-dT)

•

J .

poly(dG-dC)

コ

。。

門℃F ロロ L 〕

50.0 (a)

40.0

30.0

wm出畑中米相

20.0

10.0

臼ロロ口

80 100 60

[DNA-p]

/

[2]

20 40 0.0

0

〆'SE\ 'hu 、、i，r

8.0

•

poly(dA-dT)

• •

・ … .

• •

-• •

・ :: : ・

• • • •

ロロ

伊コ

世相小米朝 7.0

コ口

6.0

poly(dG-dC)

ロ口

、ιニァ{

。

口コ口

100 150 50

5.0 0

[DNA-p]

_/

[2]

吋13-28 poly(dG-dC)及び， poly(dA-dT)添加に伴う3 (a) ， 2 (b)の蛍光強度変化 1 00mMNaCI， 10mMリン酸緩衝液.

À cx=420nm， ). cm=485nm. 1μM 2.3

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新規な機能をもつ核酸結合性小分子の研究

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