博 士 （ 医 学 ） 藤 永 考
学位論文題名
Extracellular Nef protein regulates productive HIV‑1 infection from latency
（ 遊離 型HIV‑1 Nef蛋白質 による細 胞内潜伏HIV‑1の活性化 ）
学位論文内容の要旨
ヒ ト免疫不 全ウイル ス1型(HIV‑1)は、 後天性免 疫不全症候 群(AIDS)の原因ウイルスで あ る 。HIV‑1感 染か らAIDS発症 へ と 向か う 病態進 行は、 HIV‑1の主な宿 主細胞で ある CD4陽 ´陸細胞 の減少と 密接な関 わりを持 つことが明 らかにさ れている 。HIV‑1感染個体 は 、 一 過性 の 急性 感 染 期を 経 た 後、 約10年 にも及 ぶ長い無 症候(AC)期に 入る。AC期に お け るHIV‑1感 染細胞の割 合は比較 的高い値 を示す一 方、血中 より分離 されるウイ ルス カ 価 はAIDS期の そ れと 比 較 して 低 い値 を 示 す。 こ の こと か らAC期 にお け るHIV‑1の感 染 様式はウ イルス抗 原レベル の低い、 いわゆる潜 伏感染状 態である ことが予想される。
HIV‑1潜伏 感 染 細胞では、 ウイルス 抗原は主 に転写レ ベルで抑 制されて おり、サイ トカ イ ンや他の ウイルス 感染など の刺激に より活性化 されるこ とが様々 な実験により証明さ れている。
HIV‑1は 、構造遺 伝子(gagpol、env） 、調節遺伝子(taムrev）、およびアクセサリー遺 伝子(vif. 'vpr丶vpu丶nef）によって構成されている。ウイルス複製のためには、ウイルス 粒 子を構成 する構造遺伝子とウイルス遺伝子発現を制御する調節遺伝子が必須であるが、
ア ク セ サリ ー 遺伝 子 は 必ず し も 必要 で はな い。 一方、vprとnefの機能と して、サル 免 疫 不 全 ウイ ル ス(SIV)を用 いた実験 よりAIDS発症 に必要で あること が示され ている。こ の よ う な背 景 から 、 こ れら ア ク セサ リ ー遺 伝子 、特にvprお よびnefのAIDS発 症に及ぼ す 機 能 解明 が 急がれ ている。 現在まで に明らか にされた 機能とし て、Vprが細胞 周期の G2ア レ ス ト を 誘 導 す る こ と 、NefのN末 端 がHIV‑1の レ セ プ タ ー で あ るCD4分 子 の down‑regulationを誘導す ること、お よびNefのN末 端と中央 部のPXXPドメ インと呼 ばれ る 領域が末 梢血にお けるウイ ルス複製 を正に制御 している ことなど が挙げられる。さら に 、 細 胞外 か らの 遊 離 型vpr蛋 白 質に よ る刺 激によ って、細 胞内潜伏HIV‑1が活性化さ れ る こ とが 明 らか に さ れた 。 一 方我 々 は、 現在 までに、Nef蛋白質がHIV‑1感染細胞表 面 に発現さ れること 、およびNef蛋白質が 非感染細胞 表面に結 合するこ とにより、HIV‑1 の 細 胞 聞伝 播 を促進 すること を報告し てきた。 そこで今 回我々は 、Nef蛋白質を 細胞外 か らHIV‑1潜 伏 感染細胞に 加えるこ とにより 、潜伏ウ イルスの 活性化が 起こるかど うか についての検討を行った。
潜 伏 感 染モ デ ル細 胞 と して 、 世 界的 に 広く 用い られてい るACH2細胞とUl細胞（それ ぞ
れCEM細胞 とU937細胞 にHIV‑1 LAI株 が持 続 感 染した クローン 細胞）、 およぴ今回 新た に 分 離し たMOLT‑20‑2細 胞(MOLT‑4細 胞にHIV‑1 NL43株 が持続感 染したク ローン細 胞）
を 用 いた 。 これ ら の細胞 は、未刺 激状態で は全体の5%以下の細胞 がHIV‑1抗原を 発現し て い るに す ぎな い が 、細 胞 を フオ ル ボー ル エ ステ ル(PMA)、 カル シ ウ ムイ オ ノフォア (A23187)ま た は腫 瘍 壊死 因 子Q(TNF‑a)で 刺 激 するこ とにより 、ほとん ど全ての細 胞に HIV‑1抗原 を発現す る。そこ で、これ らの細胞上 清中に大 腸菌で発 現させたHIV‑1 Nef蛋 白 質(GSTとの 融 合蛋 白 質 とし て 発現 さ せ たも の をプロテ アーゼ処理 してGST部分 とNef 部分 に切断し た後、精 製したも の）を最終 濃度50 ptg/mlで加え、4日後におけるHIV‑1抗 原発 現を抗Gag p24モ ノクロー ナル抗体(V107)を用いた間接抗体染色(IF)法により観察し た 。 上記 の3種 の潜 伏 感 染細 胞 のう ち 、U1お よ びMOLT‑20‑2細 胞 に おい てHIV‑1抗 原発 現 細 胞数 の 上昇 （ 共にほ ぼ100%の細胞 がHIV‑1抗原を 発現）が 観察された 。このよ うな 活 性 はGSTと の融 合 蛋白質の 状態(GST‑Nef)では 低く、コ ントロー ルとして用 いたGST蛋 白 質 では 見 られ な かった 。MOLT‑20‑2細胞に おけるウ イルス抗 原陽性細胞 数の上昇 は加 えるNef蛋白濃度 に依存し ており、NefのC末端部分を認識する抗体によって阻害された。
次に 、Nef蛋白質 内の活性 部位を検 索するため に、Nefのア ミノ酸配 列に従って14種類の ベ プ チド を 合成 し 、MOLT‑20‑2細 胞に 添 加し た 。その 結果、Nefの132 ‑147アミノ酸に 対 応 す る ベ プ チ ド を 加 え た と き に お い て 、HIV‑1抗 原 発 現 の 上 昇 が 観 察 さ れ た 。 以上 のようなNef蛋白質に よるHIV‑1活性 化が感染者 において も起こり うるかどうかを 検 討 する た めに 、2名のHIV‑1感 染者（い ずれもAC期 で、うち1名が血友病 由来）か ら末 梢 血 単核 球(PBMC)を分 離し、そ の培養上 清中にNef蛋 白質を添 加した。そ の結果、 いず れの 検体にお いても、 加えたNef蛋 白質の濃度 に依存し てHIV‑1の活性 化（培養上清中の HIV‑1ウイルス量の増加）が観察された。
以上 の 結 果よ り 細胞 外 か らHIV‑1 Nef蛋 白 質 を加 え るこ と に より 、 細 胞に 何らか の HIV‑1活 性 化 シグ ナル が誘起さ れること が示唆さ れた。こ のような活 性は、細 胞種依存 的 で あっ た が、HIV‑1感 染 者 由来PBMCに おい て も観察 されたこ とから、HIV‑1感 染者体 内で も起こっ ている可 能性が示 唆された。 今回明ら かになっ た、潜伏 ウイルスの活性化 に 関 わるNef蛋白 質 の機能は 、本研究 により初 めて明ら かになった ものであ り、野生 型 SIV接 種サ ル がnef欠損 型SIV接種サ ルに比ぺ て高いウ イルス負 荷を維持し 、AIDS発症ヘ 進行するとkゝうKestlerらの実験結果(Kestler，H．W.，III etal．Cell，65，651‑662，1991)を 理解する上で重要であると考えられる。
学位論文審査の要旨
学位論文題名
Extracellular Nef protein regulates productive HIV‑1 infection from latency
（ 遊 離型HIV‑1 Nef蛋白 質による 細胞内潜 伏HIV‑1の活性化 ）
ヒト免 疫不全ウ イルス1型(HIV‐1）は、 後天性免疫 不全症候 群(AIDS)の原因ウイルスで あ る 。HIV‐1感 染 か らAIDS発 症 へ と 向 か う 病 態進 行 は 、HIV‑1の主 な 宿主 細 胞 であ る CD4陽性 細 胞 の滅 少 と密 接 な 関わ り を持 つ こ とが 明 らか に さ れて い る。HIV―1感 染個体 は 、一 過 性 の急 性 感染 期 を 経た 後 、約10年にも及 ぶ長い無 症候(AC)期に 入る。AC期 にお け るHIV‑1感染 細胞の割 合は比較的 高い値を 示す―方 、血中よ り分離さ れるウイ ルスカ価 はAIDS期と 比 較し て 低 い値 を 示 す。 このこ とからAC期 におけるHIV‐1の感染 様式はウ イ ル ス抗 原 の発現レ ベルが低い 、いわゆ る潜伏感 染状態で あること が予想さ れる。HIV‑1潜 伏感染 細胞では 、ウイル ス抗原は 主に転写レ ベルで抑 制されて おり、サイトカインや他の ウイル ス感染な どの刺激 により活 性化されることが様々な実験から証明されている。HIV− 1が コ ― ド す る9っの 遺 伝 子(gag、pol、enレ 、tat、reレ 、 レfたvpr丶vpu、nef） のう ち 、vprとnefの機 能 とし て 、 サル 免 疫不 全 ウ イル ス(SIV)を 用い た 実験よりAIDS発症に 必要で あること が示され ている。 このような 背景から 、これら アクセサリ一遺伝子、特に vprおよ びnefの、AIDS発 症に 及 ぼ す詳細 な機能解 明が急が れている 。現在ま でに報告 さ れ た機 能 のうちウ イルス活性 化に関係 するもの として、 細胞外か らの遊離 型Vpr蛋白質に よ る刺 激 に よっ て 、細 胞 内 潜伏HIV‐1が活 性化され ることが 明らかに されてい る。一方 我々は 、現在ま でに、Nef蛋 白質がHIVー1感染細胞表 面に発現 されること、およびNef蛋白 質が非 感染細胞 表面に結 合するこ とにより、HIV‐1の細胞 間伝播を 促進することを報告し て きた 。 そこで今 回申請者は 、Nef蛋白質 を細胞外 からHIV‐1潜 伏感染細 胞に加え ること により 、潜伏ウ イルスの 活性化が 起こるかど うかにつ いての検 討を行った。潜伏感染モデ ル 細胞 と し て、 世 界的 に 広 く用 い られ ているACH2細 胞とU1細胞 、および 今回新た に分離 し たMOLT‐20‐2細胞(MOLT‐4細 胞にHIV‐1NL43株が 潜伏感染 したクロ ーン細胞 ）を用い た。こ れらの細 胞は、未 刺激状態 では全体の5％以下の 細胞がHIV‑1抗原を発現しているに す ぎな い が 、細 胞 をフ ォ ル ボー ル エス テル（PMA)、 カルシウ ムイオノ フォア(A23187)ま た は腫 瘍 壊死因子a (TNF‑a)で刺激する ことによ り、ほと んど全て の細胞にHIV‐1抗原の 発 現を 誘 導できる 。そこで、 これらの 細胞上清 中に大腸 菌で発現 させたHIV‑1 Nef蛋 白質
