岡 山 医 誌 (1994) 106, 573∼585
ヒ ト赤血 球 系細 胞 の 細胞 内 フ ェ リチ ンに関 す る研究
-成
熟段 階 にお け る トラ ンス フ ェ リン受 容 体 及 び 可染 性 鉄 との関 係 に つ い
て-岡 山大 学 医学 部 第 二 内科 学教 室(指 導:木 村 郁 郎 教授)
花
房
純
弘
(平 成6年2月22日 受 稿)Key words: ferritin, erythroid cell, transferrin receptor, non-hemin iron
緒 言 鉄 は ヘ モ グ ロ ビ ン を初 め とす る 多 くの 機 能 蛋 白や 酵 素 に 含 ま れ て お り,生 体 内 の 酸 素 運 搬 の み な ら ず 酸 化 還 元 反 応 に 関 与 す る こ とに よ り, エ ネ ル ギ ー 産 生 や 細 胞 増 殖 とい っ た 生 命 維 持 に 欠 く こ と の 出 来 な い 重 要 な 役 割 を果 して い る1). ま た 骨 髄 内 に お い て 赤 血 球 系 細 胞 は 平 均5∼6 日 で 前 赤 芽 球 か ら 未 熟 赤 血 球 へ と成 熟 して い く が2) 3),こ の 短 期 間 の う ち に 活 発 な 鉄 の 摂 取 とヘ モ グ ロ ビ ン(以 下Hb)合 成 を 行 う.こ の 際 鉄 の 供 給 はdiferric transferrinが 赤 芽 球 細 胞 膜 表 面 のtransferrin receptor(以 下TfR)に 結 合 す る こ とに 始 ま り4),そ の 一 部 は へ ム 合 成 に 利 用 さ れ,一 部 はferritin(以 下Ft)に 取 り込 ま れ て 毒 性 の 強 い 遊 離 鉄 が 無 毒 化 さ れ る と 同 時 に 利 用 可 能 な 状 態 で貯 蔵 され る もの と考 え られて い る5) 6). Ftは,分 子 量 約480kDaで 含 水 酸 化 第 二 鉄(Fe3+ O・OH)を 囲 む 巨 大 蛋 白 で あ り7) 8), 24個 のH, L subunitか ら成 り立 っ て い る9) 10).各 組 織 内Ft 構 造 はH, L鎖 の 構 成 比 率 が 異 な っ て お り,両 者 は 鉄 の 取 り込 み や 放 出 を 含 め て そ の 機 能 を 異 に して い る こ とか ら,各 組 織 内Ftの 多 様 性 が 生 じ る11).最 近 の 分 子 生 物 学 的 研 究 か ら ヒ トH, L鎖 の 遺 伝 子 は そ れ ぞ れ 第11染 色 体q13,第19 染 色 体q13.3-q13.4上 に 存 在 す る こ とが 判 明 し て い る12) 13) 14) 15). Ft合 成 は 細 胞 内 の 鉄 レベ ル に 依 存 して,主 に Ft-mRNA上 のiron responsive element(以 下 IRE)を 介 し た翻 訳 の 調 節 に よ り制 御 さ れ る と考 え ら れ て い る16) 17) 18).し か も 同 様 の 構 造 はTfR のmRNA内 に も 存 在 して お り,や は り鉄 量 に よ り そ の 発 現 が 調 節 さ れ る と 想 定 さ れ て い る19) 20) 21).し か し こ れ ら の 研 究 は 主 にcell line を 用 い て 行 な わ れ た もの で あ り22) 23),実 際 の 生 体 内 で の 機 序 の 解 明 は 未 だ ほ と ん ど為 さ れ て い な い の が 現 状 で あ る.従 っ てin vivoの 細 胞 に つ い て そ の 分 化,成 熟 と と も にFtを 初 め と す る 鉄 代 謝 関 連 の 因 子 が ど の よ う に 変 化 す る か を解 析 す る こ と の 意 義 は 大 き い と 思 わ れ る. か つ て 教 室 の 木 村 は ヒ ト赤 芽 球 内 の 可 染 性 鉄 顆 粒 に 注 目 し,こ れ が 細 胞 内 非 へ ミ ン 鉄 の 一 表 現 型 で あ る と 同 時 に そ の 発 現 の 程 度 が 骨 髄 で の 赤 血 球 造 血 状 態 を 反 映 す る こ と を 明 ら か に し た24).さ らに 教 室 の 木 村(文)は ヒ ト赤 芽 球 のTfR 発 現 に つ い て 細 胞 の 成 熟 度, Hb及 び 可 染 性 鉄 顆 粒 が どの 様 に 関 与 して い る か を検 討 し た 結 果, Hb濃 度 が 最 も深 くTfR発 現 に 関 わ っ て い る こ と を報 告 し た25).こ の 様 に へ ミン 鉄,非 へ ミ ン鉄 を 問 わ ず ヒ トの 赤 血 球 系 細 胞 に ま つ わ る鉄 代 謝 の 動 態 に つ い て の 幾 多 の 問 題 は,徐 々 に で は あ る が 解 明 さ れ つ つ あ る.し か し,可 染 性 鉄 顆 粒 の 本 質 と機 能 の 問 題 を 含 め て,こ とに 非 へ ミ ン 鉄 の 代 謝 は 未 解 決 の 部 分 が 多 い.そ こ で 著 者 は 今 回 ヒ ト骨 髄 の 塗 抹 標 本 を 用 い た 赤 血 球 系 細 胞 の 細 胞 内Ftの 半 定 量 法 を考 案 し,さ ら に 同 一 細 胞 に つ い て そ の 成 熟 に 伴 うFt, TfR及 び 可 染 性 鉄 顆 粒 の 推 移 を 同 時 に 検 討 し た. 対 象 と 方 法 1.対 象 対 象 に は 健 康 成 人8例(26∼42歳,平 均30.6 573
歳,男7例,女1例)と 岡 山 大 学 医 学 部 第 二 内 科 に 通 院 あ る い は 入 院 中 の 重 症 度 の 異 な る鉄 欠 乏 性 貧 血2例(43歳 男, 38歳 女),鉄 過 剰 症2例 (58歳 男, 72歳 男)を 選 ん だ. 2.方 法 赤 血 球 系 細 胞 内Ft量 の 測 定 は 免 疫 蛍 光 測 光 法 を用 い た.そ の 概 要 と各 種 パ ラ メ ー ター の 測 定 法 を以 下 に 示 す. 1)塗 抹 標 本 作 製 法(図1) ヒ ト骨 髄 細 胞 を小 宮 式 穿 刺 針 を 用 い て 胸 骨 よ りへ パ リ ン 加 で 吸 引 採 取 し,生 理 的 食 塩 水 に て 3回 洗 浄 し た 後,図1の 如 く ス ラ イ ドグ ラ ス (Matunami無 蛍 光frost slide glass No. 1) 上 の 一 側 に 骨 髄 液 を 塗 抹 し,対 側 に は 陽 性 対 象 と し てHL60細 胞 を 塗 抹 し て か ら 直 ち に1時 間 冷 風 乾 燥 し, 70%ethanolで15分 間 固 定 し た. 2) Ft半 定 量 の 為 の 抗 体 処 理(図2) 上 記 標 本 を10%羊 血 清(Irvine Scientific, California)に て10分 間 処 理 し た 後,以 下 の 如 く 抗 体 処 理 を 行 っ た. (1)抗 ヒ トFt polyclonal抗 体 処 理 Ft半 定 量 の 一 次 処 理 と し て ま ずanti-human Ft家 兎 血 清(DAKOPATTS, Denmark)を,
二 次 抗 体 と し てanti-rabbit IgG FITC labelled F (ab')2 fragment(gout, ZYMED, Califor-nia)を 各 々 室 温 に て60分 間 反 応 さ せ た.な お, こ れ らの 抗 体 はlot検 定 を行 っ た 上 で 一 定 力 価 の も の を 使 用 し, 10%羊 血 清 に て 希 釈 し た 液 を 標 本1枚 に つ き100μl添 加 した.か か る標 本 に 蛍 光 減 衰 を 抑 え る た め に5%n-proply gallateを 含 むglycerolを 滴 下 し26),カ バ ー グ ラ ス(Matu nami coverglass No. 1透 過 率(405nm): 92%) を か け て そ の 周 囲 を 乾 燥 防 止 の 目 的 で 市 販 の エ ナ メ ル で 被 っ た. (2)抗 ヒ トFt monoclonal(H, L鎖)抗 体 処 理(図2-①, ②) 赤 血 球 系 細 胞 内Ftの 各subunitの 変 化 に つ い て 検 討 す る 目 的 で,一 次 抗 体 と して 抗 ヒ トFt H, L鎖monoclonal抗 体(RAMCO, Texas)
を使 用 し た.こ の 際 は,免 疫 動 物 の 相 違 か ら二 次 抗 体 と して は 図2の ①, ② に 示 す 様 にanti mouse IgG FITC-labelled F(ab')2 fragment
(rabbit, ZYMED, California)を 使 用 し,そ れ
ス ラ イ ドグ ラ ス
図1 塗沫 標本作製 法
図2 赤 血 球 系 細 胞 の 成 熟 度 を 同定 しつ つ 胞体 内 の Ft, TfR,可 染 性 鉄 顆 粒 を 同 時 に検 討 す る方 法 ぞ れ10%羊 血 清 で30倍, 50倍 に 希 釈 の 後,標 本 1枚 に つ き100μl添 加 して 室 温 に て60分 間 反 応 さ せ た.な お,何 れ の 抗 体 も そ の 飽 和 量 を 添 加 し た. 3) Ft蛍 光 顕 微 測 光 落 射 型 蛍 光 顕 微 鏡(Olympus MMSP-RF)の green励 起 光(546nm)下 で 赤 血 球 系 細 胞 に 焦 点 を合 わ せ 写 真 撮 影 に よ りmappingし,細 胞 と核 の 長 径,短 径 を れ ぞ れ 計 測 して 核 ・細 胞 質 比 率 か ら予 め 細 胞 成 熟 度 の 判 定 を す る と 同 時 に そ の 細 胞 の 大 き さ に 適 し た 最 小 の ピ ン ホ ー ル 径 を選 択 し た.し か る 後 にblue violet励 起 光(405 nm, 435nm)下 で 対 象 細 胞 の 蛍 光 測 光 を行 っ た. 4) Ft半 定 量 法 陽 性 対 象 と し たHL 60細 胞 は 急 性 骨 髄 性 白 血 病 か ら樹 立 し た 細 胞 株 で あ り, Ftを 豊 富 に 含 有 し て い る こ とが 知 ら れ て い る27).こ の 細 胞 を10% FCS(FLOW, Virginia)加RPMI1640ヒ ト赤 血 球 系 細胞 の フ ェ リチ ン と他 の鉄 代 謝 関 連 因子
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目毎 に 一 定 条 件 下 で 継 代 培 養 し,陽 性 対 象 と し てmediumを 交 換 後4日 目 の もの を 使 用 した. こ のHL 60細 胞 内Ftは 生 理 的 食 塩 水 に て 洗 浄, 超 音 波 破 砕 し た 後 にFtキ ッ ト「第 一 」(immuno-radiometric assay,第 一 ラ ジ オ ア イ ソ トー プ 研 究 所)に よ り測 定 し た と こ ろ, 23.9±2.2fg/cell の 安 定 し た 値 を 示 し て お り,陽 性 対 象 と し て の 信 頼 性 を確 認 し た.な お,こ の 値 はFibachら の 報 告 し た 値 と も近 似 して い た28).こ の 値 か ら 図 3の 計 算 式 に 従 っ て 各 赤 血 球 系 細 胞 内 のFt量 を算 出 し た. 5)赤 血 球 系 細 胞 に お け る 成 熟 度 の 判 定 Ft蛍 光 顕 微 測 光 を 施 行 後, 100%methanolに て 封 入glycerolを 除 去 し た の ちWright-Giem sa染 色 を 実 施 し,型 の 如 く赤 血 球 系 細 胞 の 成 熟 度 を 同 定 し た.す な わ ち,好 塩 基 性 赤 芽 球,早 期 及 び 晩 期 多 染 性 赤 芽 球,正 染 性 赤 芽 球,未 熟 赤 血 球,成 熟 赤 血 球 に 分 類 し た.な お,前 赤 芽 球 は 極 め て 少 数 で あ る た め そ の 染 色 性 の 確 認 を 行 う に と ど め,成 熟 段 階 同 士 の 比 較 検 討 の 対 象 か ら除 外 し た. 6)細 胞 内 可 染 性 鉄 顆 粒 数 の 算 定 次 に 可 染 性 鉄 顆 粒 算 定 の 目的 で, 70%ethanol と100%methanolを 用 い てWright-Giemsa染 色 を 各1時 間 脱 色 し た 後, Kaplanの 変 法 に て 鉄 染 色 を 実 施 し た.さ ら に 次 のautoradiography 実 施 時 の 染 色 に よ る化 学 か ぶ り を 防 止 す る 目 的 で0.7%celloidin液 に て 膜 処 理 を施 し,光 学 顕 微 鏡 観 察 下 で 胞 体 内 可 染 性 鉄 顆 粒 数 のcountを 行 っ た. 7) autoradiographyに よ るTfR算 定 法(図 2-③) 図2-③ に 示 す 様 に 木 村(文)の 方 法29)に従 っ てTfR半 定 量 の 為 に 一 次 抗 体 と してOKT 9(Ortho, New Jersey)を,二 次 抗 体 と し てanti mouse IgG125 I-labelled F(ab')2 fragment (Amersham, Amersham Place)を60分 間 室 温
赤血 球系細胞内Ft量 =赤 血球系細胞蛍光量 × HL 60細 胞 内Ft量 / HL 60細胞平均蛍光量
図3 赤血球 系細胞の蛍光量 か ら細胞内Ftを
算出
す る方 法
で 反 応 させ た.但 し,抗Ft抗 体 と し てmono clonal抗 体 を 使 用 し た 際 はcross reactionを 避 け る 目的 でhuman transferrin, diferric125 I -labelled(MEN Research Products, Boston)の20倍 希 釈 液 を 同 様 の 方 法 で60分 間 反 応 させ た. か か る標 本 に2倍 希 釈 し たautoradiography用 乳 剤NTB 2(Kodak, New York)をdipping 法 に て 塗 布 し た 後4℃ で4日 間 露 出, D-19
(Kodak, New York)に て 現 像,氷 酢 酸 に て 停 止, 12%チ オ 硫 酸 ナ ト リ ウ ム に て 定 着 し た.対 象 のHL 60細 胞 に はTfRが 豊 富 に 存 在 し て い
る こ とが 知 られ て お り30), human transferrin, differric125 I-labelled(MEN Research Pro
ducts, Boston)を 用 い たradiolabelled receptor assayに よ りそのTfR数 は4.43±0.48×105/cell (Ka=5.63×108 M-1)と 安 定 し た 値 を 示 し,陽 性 対 象 と し て の 信 頼 性 が 確 認 さ れ た.こ の 点 に 基 づ い て 測 定 対 象 細 胞 のTfR数 をHL 60細 胞 とのgrain数 比 率 に よ り図4の 式 に て 算 出 した. 以 上 の 方 法 に よ り,骨 髄 塗 抹 標 本 上 の 同 一 の 赤 血 球 系 細 胞 に つ い て,そ の 細 胞 の 成 熟 度, Ft, 可 染 性 鉄 顆 粒 及 びTfRの4つ のparameterに つ い て 同 時 に 解 析 が 可 能 と な っ た.図5に 各 処 理 段 階 に お け る 多 染 性 赤 芽 球 の 顕 微 鏡 写 真 を示 す.
結
果
1.赤
血 球 系 細 胞 内Ftの
半定 量法 の検 討
今 回考 案 した赤 血 球 系 細 胞 内Ftの
定 量 法 に
つ い て その 反 応特 異性 を確 認 す る 目的 で,一 次
抗体(各 抗Ft抗
体)処 理 を行 っ た群 と行 わ な
か った群 とを比較 した.そ の結 果,処 理 群 では
図5の 様 に赤 血球 系 細 胞 に特 異的 に蛍光 を認 め
たが,未 処 理群 で はback
groundと
比較 して
殆 どそ の差 を認 め な か っ た.ま た,過 量 の ヒ ト
Ft(liver及 びheart)を
用 い た吸 収 試 験 で著 明
な反 応低 下 を認 め た こ とか ら も,こ の 実 験 系 で
観 察 され た蛍 光 が 赤 血球 系 細 胞 内Ftを
特 異的
赤血球 系細 胞TfR数 =赤 血 球 系 細 胞 上grain数 × HL 60細 胞TfR数/ HL 60細 胞 平均grain数 図4 赤 血球 系 細 胞 上 のgrain数 か らTfR数 を算 定 す る方 法図5 赤 血 球 系 細 胞 の 成 熟 度, Ft,可 染 性 鉄 顆 粒, TfRを 同 時 に 検 討 す る方 法 の 各 処 理 段 階 に お け る赤 芽 球 像 a: Wright-Giemsa染 色像, b: Ft蛍 光 像, C: 鉄 染 色 像, d: autoradiography像 図6 赤 血 球 系 細 胞 の 成 熟 度 と細 胞 内Ft量 (抗Ft-polyclonal抗 体 に よ る解 析) に 認 識 して い る もの と考 え ら れ た. 2.赤 血 球 系 細 胞 内Ftと 成 熟 度 と の 関 係 ま ず 健 康 成 人 の 赤 血 球 系 細 胞 に つ い て 細 胞 内 Ft量 が 細 胞 の 成 熟 過 程 に 伴 っ て どの 様 に 変 化 す る か を検 討 し た.抗Ft polyclonal抗 体 に よ る 解 析 で は,最 も幼 弱 な 前 赤 芽 球 の 段 階 か らFt蛍 光 を 認 め た.ま た,各 成 熟 段 階 に お け る 細 胞 内 Ft量 の 平 均 値 はbaso. Ebl: 16.11±1.67fg/ cell, early poly. Ebl: 9.83±2.16fg/cell, late poly. Ebl: 8.82±2.83fg/cell, ortho. Ebl:
7.13±1.68fg/cellで あ り,好 塩 基 性 か ら正 染 性 へ と成 熟 して 行 くに つ れ て 減 少 す る傾 向 が 認 め ら れ(r=-0.78, p<0.05),未 熟 赤 血 球 及 び 成 熟 赤 血 球 で は 測 定 感 度 以 下 に 著 減 し た(図6). な お, Ftの 蛍 光 強 度 は 細 胞 の 大 き さ に 依 存 す る こ と が 判 明 し,ま た 核 の 上 に は 蛍 光 を殆 ど認 め ず,さ ら にFtそ の も の は 核 内 に は 存 在 し な い こ と か ら3),細 胞 表 面 積 か ら核 の 面 積 を差 引 い た 細 胞 質 面 積 で 蛍 光 強 度 を 除 した 値 を 細 胞 内Ft濃 度 と し て 使 用 し,同 様 の 検 討 を行 っ た.そ の 結 果,細 胞 成 熟 度 と 細 胞 内Ft濃 度 と の 間 に は 明 瞭 な 相 関 は 得 ら れ ず,未 熟 赤 血 球 以 下 の 段 階 で は 同 様 にFt濃 度 は 著 明 に 減 少 し た(図7).次 に 抗Ft monoclonal抗 体 に よ る 同 様 の 解 析 を実 施 し た と こ ろ, Ft-L鎖 抗 体 を 用 い た 場 合 に は 細 胞 成 熟 度 と細 胞 内Ft濃 度 と の 間 に は 有 意 な 相 関 関 係 は 認 め ら れ な っ た が(図8),抗Ft-H 鎖 抗 体 で は 成 熟 に 伴 っ て 細 胞 内Ft濃 度 が 減 少 し て い く傾 向(r=-0.62, p<0.05)が 窺 わ れ た(図9). ま た,正 常,鉄 欠 乏,鉄 過 剰 の 各 病 態 間 で 赤
ヒ ト赤血 球 系 細 胞 の フ ェ リチ ン と他 の 鉄代 謝関 連 因 子
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図7 赤 血 球 系細 胞 の 成 熟 度 と細 胞 内Ft濃 度 (抗Ft-polyclonal抗 体 に よ る解 析) 図8 赤 血 球 系 細 胞 の 成 熟度 と細 胞 内Ft濃 度 (抗Ft-L鎖 抗 体 に よ る解 析) 図9 赤 血 球 系 細 胞 の 成 熟 度 と細 胞 内Ft濃 度 (抗Ft-H鎖 抗 体 に よ る解 析)血球 系 細 胞 の各 成 熟 段 階 と平 均 細 胞 内Ft濃
度
とを比較 す る と,正 常 人 に 比 して鉄 過剰 症 で は
Hsubunit,
L subunitと もに好 塩 基 性 赤芽 球 か
ら正 染 性 赤 芽球 ま での 段 階 でFtは
増加 して お
り,鉄 欠 乏 で は逆 に 減 少 して い た(図10,図11).
3.赤
血 球 系 細 胞 内FtとTfRと
の 関係
健 康 成 人 の赤 血球 系細 胞 における細 胞 内Ft濃
度 と細 胞 内TfR密
度 との 関係 について検 討 した.
図10 赤 血 球 系 細 胞 の 成 熟 度 と細 胞 内Ft濃 度 (症例 間 比 較,抗Ft-L鎖 抗 体 に よ る解 析) 図11 赤 血球 系 細 胞 の 成 熟 度 と細 胞 内Ft濃 度 (症例 間 比較,抗Ft-H鎖 抗 体 に よ る解 析) 図12 赤 血 球 系 細 胞 内Ft濃 度 とTfR密 度 (抗Ft-polyclonal抗 体 に よ る解 析) 抗Ft polyclonal抗 体 に よ る 解 析 で はr=0.40 (p<0.01)と 弱 い な が ら正 の 相 関 関 係 を 認 め た (図12).ま た,抗Ft-L鎖 抗 体 に よ る解 析 で は r=0.31(p<0.01,図13),抗Ft-H鎖 抗 体 に よ る解 析 で はr=0.52(p<0.01,図14),と な り, H subunitに お い て 比 較 的 強 い 正 の 相 関 が 認 め ら れ た.4.赤
血 球 系 細 胞 内Ftと
可 染性 鉄 顆 粒 との 関
係(単 一 症 例 内 比較)
健 康 成 人の 単 一症 例 につ いて,個 々 の 赤芽 球
細 胞 内 のFt濃
度 と可染 性 鉄 顆粒 密 度 との 関係
につ い て検 討 した とこ ろ,抗Ft
polyclonal抗
図13 赤 血 球 系 細 胞 内Ft濃 度 とTfR密 度 (抗Ft-L鎖 抗 体 に よ る解 析) 図14 赤 血球 系 細 胞 内Ft濃 度 とTfR密 度 (抗Ft-H鎖 抗体 に よ る解 析) 図15 赤 血 球 系細 胞 内Ft濃 度 と可 染 性 鉄 顆 粒 密 度 (抗Ft-polyclonal抗 体 に よ る解 析) 体 を 用 い た 解 析 で は そ の 相 関 はr=0.21(p< 0.05,図15)で あ っ た.ま た,抗Ft-L鎖 抗 体 に よ る解 析 で はr=0.27(p<0.01,図16),抗 Ft-H鎖 抗 体 に よ る 解 析 で はr=0.31(p<0.Ol, 図17)と な り,い ず れ も 明 らか な 相 関 は 得 ら れ な か っ た. 5.赤 血 球 系 細 胞 内Ft量 と可 染 性 鉄 顆 粒 と の 関 係(症 例 間 で の 比 較) 可 染 性 鉄 顆 粒 及 びFtは い ず れ もnon hemin 鉄 の 一 表 現 型 と考 え られ て お り,両 者 の 相 互 関 係 に つ い て は さ ら に 症 例 間 で の 解 析 を 試 み た.す な わ ち,健 康 人4例,鉄 欠 乏2例,鉄 過 剰 症(続 発 性 へ モ ジ デ ロー シ ス)2例 に つ い て 細 胞 内Ft濃 度 と平 均 可 染 性 鉄 顆 粒 密 度 と を 比 較 検 討 し た 結 果,抗Ft monoclonal抗 体 に よ る 解 析 に お い て H subunit, L subunit共 に 正 の 相 関 関 係 が 窺 わ れ,こ の傾 向 はH subunitに つ い てr=0.76(p< 0.05)と よ り明 瞭 で あ っ た(図18,図19). 図16 赤 血球 系 細 胞 内Ft濃 度 と可 染 性 鉄 顆 粒 密 度 (抗Ft-L鎖 抗 体 に よ る解 析) 図17 赤 血 球 系 細 胞 内Ft濃 度 と可 染 性 鉄 顆 粒 密 度 (抗Ft-H鎖 抗 体 に よ る解 析)ヒ ト赤 血球 系 細 胞 の フ ェ リチ ン と他 の鉄 代謝 関連 因子
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考
察
赤 血 球 系 細 胞 に お け る 鉄 代 謝 の う ち,特 に 非 へ ミ ン鉄 の 代 謝 や 役 割 に 関 して は 不 明 な 部 分 が 多 い.そ こ で か か る 点 を 解 明 す る研 究 の 一 環 と して,今 回 蛍 光 抗 体 法 及 び 蛍 光 顕 微 測 光 法 を用 い た ヒ ト骨 髄 赤 血 球 系 細 胞 内Ftの 半 定 量 法 を 考 案 し,さ ら に そ の 方 法 を 応 用 し て 同 一 細 胞 に お け る細 胞 成 熟 度,細 胞 内Ft, TfR及 び 可 染 性 鉄 粒 の4因 子 の 関 連 に つ い て 検 討 を 加 え た. ま ずFt定 量 の 方 法 に つ い て は,従 来Ftの 測 定 は 等 電 点 電 気 泳 動 法, enzyme immunoas say, radioimmunoassay, flow cytometryなどの 方 法 が 主 体 で あ っ た が31) 32),骨 髄 穿 刺 液 の 様 なheterogenousな 細 胞 集 団 の 中 で 特 定 の 細 胞 集 団 の 複 数 の パ ラ メ ー タ ー に つ い て検 討 す る こ とは な か な か 困 難 で あ っ た.本 法 は 抗Ft抗 体 を 用 い た 免 疫 組 織 学 的 方 法33)に蛍 光 顕 微 測 光 法 を 組 み 合 わ せ る こ と に よ り,骨 髄 細 胞 の 成 熟 段 階 別 に 細 胞 内Ftの 半 定 量 を可 能 と し た も の で, こ の 様 な 試 み は 本 報 告 が 初 め て で あ る.ま た 使 用 す る 抗 体 のvariationに よ っ て 異 な る ア プ ロ ー チ が 可 能 で あ る ば か りで な く, TfRや 可 染 性 鉄 顆 粒 な ど の 鉄 代 謝 に 関 連 し た 他 の 重 要 な 因 子 につ い て 同 時 に 検 討 が 可 能 で あ り,赤 芽 球 のiron metabolismを 検 討 す る 上 で優 れ た 方 法 と言 え よ う.さ ら に 本 法 を 発 展 させ れ ば 赤 芽 球 に お け る Hb, DNA, RNA等 を 同 一 細 胞 に つ い て 定 量 す る事 も 可 能 で あ り25) 34),個 々 の 細 胞 に お け る 多 因 子 の 解 析 方 法 と し て 今 後 多 方 面 に 活 用 し う る 可 能 性 を 有 し て い る. 図18 赤 血 球 系 細 胞 内Ft濃 度 と可 染 性 鉄 顆 粒 密 度 (症例 間 比 較,抗Ft-L鎖 抗 体 に よ る解 析) 蛍 光 顕 微 測 光 に は 芦 原 等 の 方 法 を 応 用 し た が35),従 来 こ の 方 法 は 測 定 感 度 が 高 く,測 定 対 象 の 分 布 誤 差 が 少 な い 等 の 利 点 を 有 し て い る 反 面36) 37),蛍光 の 減 衰 や 非 特 異 的 光 が 測 定 上 の 問 題 点 と な っ て い た.今 回 の 測 定 で は,こ れ ら の 問 題 に 対 して ① 事 前 の 励 起 光 照 射 を控 え,マ ッ ピ ン グ に は励 起 光 か らか け 離 れ た 波 長 を使 用 し38), ② 測 光 は 励 起 シ ャ ッ タ ー を 開 い た 直 後 の 最 大 値 を 測 定 す る39), ③ n-propyl gallateを 含 む 封 入 剤 を 用 い て 減 衰 を 防 止 す る26),と い っ た 種 々 の 工 夫 を 施 す こ と に よ り,測 定 上 の 問 題 点 は 最 低 限 に 抑 え ら れ た. 次 に,今 回 の 観 察 結 果 か ら,赤 血 球 系 細 胞 の 前 赤 芽 球 か ら 成 熟 赤 血 球 ま でFt蛍 光 は 観 察 さ れ た が, back groundと の 比 較 や 測 光 法 の 測 定 信 頼 限 界 か ら 考 察 す る と評 価 可 能 な 蛍 光 を発 し た もの は 前 赤 芽 球 か ら正 染 性 赤 芽 球 ま で で あ り, こ の 事 実 は 免 疫 化 学 染 色 に よ っ て 定 性 的 に 為 さ れ た 報 告 と も 一 致 して い る40) 41).しか し そ の 一 方 で,未 熟 赤 血 球 や 成 熟 赤 血 球 に もFtが 含 まれ て い る こ と も判 明 し て お り,山 田 ら に よ る と そ の 正 常 値 は8∼19ag/cellで あ っ た42).こ れ に 対 し て 今 回 の 測 定 結 果 で は 正 染 性 赤 芽 球 のFt量 は7.13±1.68fg/cellで あ り,単 純 比 較 で も正 染 性 赤 芽 球 と未 熟 赤 血 球 との 間 に は103程 度 の 差 が あ る こ と に な る.し か し なぜ 正 染 性 赤 芽 球 か ら 未 熟 赤 血 球 に 分 化 す る 過 程 で か くも大 き なFt量 の ギ ャ ッ プ が 生 じ た の で あ ろ う か.こ の 問 題 に 対 し て は2つ の 推 論 が 成 り立 つ.第 一 に は 赤 芽 球 内 で のHb合 成 が そ の 成 熟 の 終 盤 に 加 速 度 的 に行 わ れ る た め に 鉄 が 急 激 に 消 費 さ れ,そ の 結 図19 赤 血 球 系 細 胞 内Ft濃 度 と可 染 性 鉄 顆 粒 密 度 (症例 間 比 較,抗Ft-H鎖 抗 体 に よ る解 析)
果Ftの 発 現 に 抑 制 が か か っ た と す る考 え で あ る.し か しな が ら, Hb濃 度 は 正 染 性 赤 芽 球 か ら 未 熟 赤 血 球 に い た る 段 階 で 加 速 度 的 に 増 加 す る と は い え,あ く ま で 連 続 的 に 変 化 し て お り43) 44), こ の 推 論 に は 少 々 無 理 が あ る よ う に 思 わ れ る. 第 二 は 脱 核 に と も な っ て 細 胞 内 の 鉄 が 大 量 に 失 わ れ た とす る考 え で あ る.脱 核 の 際 に 核 周 辺 の 細 胞 質 帯 も同 時 に 失 わ れ る こ と は 電 子 顕 微 鏡 観 察 で 確 認 さ れ て お り45),こ の事 実 に 関 連 した 現 象 と 推 定 す れ ば こ の 機 序 が よ り 妥 当 と思 わ れ る. と こ ろ で 陽 性 対 象 と したHL-60細 胞 に つ い て そ の 細 胞 の 大 き さ と蛍 光 量 と の 関 連 を検 討 す る と,今 回 成 績(図)は 示 さ な か っ た が, r=0.71 (p<0.001)の 正 の 相 関 関 係 が 認 め ら れ た,こ れ は 細 胞 の 大 き さ がFt含 量 を大 き く規 定 す る 可 能 性 を示 唆 して い る.そ こ で 大 き さ の 要 素 を 除 外 す る た め,細 胞 個 々 のFt量 を そ の 細 胞 質 の 表 面 積 で 除 し たFt濃 度 を 設 定 し て 検 討 を行 っ た.こ れ は 赤 芽 球 が そ の 大 き さ を 減 じつ つ 成 熟 す る 過 程 を考 慮 す る と妥 当 な 導 入 と言 え よ う. そ の 結 果, polyclonal Ft, Ft-H subunit, L subunitの 各 濃 度 と 細 胞 成 熟 と の 間 に はH subunitに の み 明 ら か な 負 の 相 関 関 係 を 認 め た (r=-0.62, p<0.05).従 来, H subunitとL subunitで は 鉄 に 対 す る 動 態 が 異 な っ て お り,前 者 は 等 電 点 電 気 泳 動 法 上 よ り酸 性 側 に 位 置 し て 鉄 の 取 り込 み や 放 出 に 関 与 し,後 者 は よ り塩 基 性 側 に 位 置 し て 鉄 貯 蔵 に 重 要 な 役 割 を果 た す と 報 告 さ れ て い る46) 47).ま た,赤 血 球 系 細 胞 内Ft に つ い て はH subunit優 位 で あ り,鉄 の 含 有 量 は 少 な く,そ の 鉄 交 代 は 極 め て 迅 速 で あ る と い っ た 特 徴 を持 つ こ と が 既 に 知 ら れ て い る48).今 回 L subunitに 比 してH subunitが 成 熟 と共 に よ り大 き な 変 動 を 示 し た が,こ れ はH subunitが 赤 血 球 のHb合 成 を 含 め た 成 熟 過 程 に お い て, よ り重 要 な 役 割 を 演 じて い る 可 能 性 を 示 唆 す る も の と言 え よ う.と こ ろ で 今 回 使 用 したFt poly clonal抗 体 に よ る結 果 は,抗L鎖 抗 体 に よ る解 析 結 果 と 類 似 の 傾 向 を 示 し た.こ れ は 本 抗 体 が 等 電 点 電 気 泳 動 法 に よ る分 析 か ら, L subunitが よ り優 位 で あ る との 報 告49)を考 慮 す る と妥 当 な結 果 で あ っ た と 言 え よ う. ま た 鉄 過 剰,正 常,鉄 欠 乏 と鉄 貯 蔵 状 態 の 異 な る 症 例 間 で 比 較 し た と こ ろ, Ft-H subunit, L subunitと も に 好 塩 基 性 赤 芽 球 か ら 正 染 性 赤 芽 球 の 段 階 に 至 る ま で 鉄 貯 蔵 状 態 の 多 寡 に 平 行 し たFt濃 度 の 推 移 を示 し て い た.こ の こ と か ら,赤 芽 球 のFt濃 度 はH, L subunitの 別 を 問 わ ず,こ れ ら の 成 熟 段 階 に お い て は 体 内 の 鉄 レ ベ ル に も依 存 して 発 現 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た. Hentzら は,ヒ トFtのmRNAの5'非 翻 訳 領 域 に 鉄 依 存 性Ft合 成 の 調 節 を 行 うIREと 呼 ば れ る28塩 基 配 列 構 造 を発 見 し た50).さ ら に こ の 部 位 にIRE結 合 蛋 白が 結 合 す る こ とに よ っ てFt 合 成 が 翻 訳 レ ベ ル で 抑 制 を受 け る こ とや51), TfR は 細 胞 内 の 鉄 レベ ル に よ り相 反 し た コ ン ト ロー ル をpost transcriptional levelで 受 け て い る こ とが 報 告 さ れ て い る52).し か し こ れ らはin vitro のcell lineを 用 い た 実 験 系 に お い て な さ れ た 推 論 で あ っ て, in vivoの 種 々 の 組 織 系 に つ い て も 普 遍 化 で き る か 否 か は ま だ不 明 で あ る.今 回 の 検 討 に お い て は 細 胞 内FtとTfRと の 間 に は 弱 い な が ら正 の 相 関 関 係 が 窺 わ れ, H subunitに お い て よ り強 い 相 関 を 認 め た.教 室 の 木 村(文) は 赤 芽 球 のTfR発 現 は 細 胞 の 成 熟 度 に よ り down regulationを 受 け る こ と を 明 ら か に し て お り, Ft-H subunitと 同 様 にTfR密 度 は 幼 弱 な 赤 芽 球 に よ り高 く発 現 し て い る こ と を報 告 し て い る29).こ の 事 実 は 細 胞 内 の 鉄 レベ ル の み に 依 存 し てFtとTfRと が 相 反 し て 発 現 す る とす る 先 の メ カ ニ ズ ム の み で は 説 明 で き る も の で は な い.赤 血 球 系 細 胞 は 他 の 細 胞 と 異 な り, Hb合 成 と い う特 殊 な 機 能 を 有 す る と 同 時 に,そ の 目的 の た め に 大 量 の 鉄 を 取 り込 ま ね ば な ら な い.取 り込 ま れ た 鉄 が 速 や か にHb合 成 に 利 用 さ れ れ ば 問 題 は な い が,合 成 に 利 用 さ れ な か っ た 鉄 を 収 容 して そ の 毒 性 を 除 く た め に 貯 蔵 蛋 白 で あ る Ftが 十 分 量 準 備 さ れ て い るの は 当 然 と も言 え よ う.従 っ て 赤 血 球 系 細 胞 が 赤 芽 球 前 駆 細 胞 を 経 て 前 赤 芽 球 へ と分 化 成 熟 す る 過 程 で, TfR及 び Ftが 共 に 高 レベ ル で 共 存 す る よ うな 状 態 が 形 成 さ れ る必 然 性 は 十 二 分 に あ り,こ の よ う な 状 態 が 生 じ得 る た め に は 細 胞 成 熟 あ る い は サ イ トカ イ ン や 細 胞 環 境 等 の 細 胞 内 鉄 レベ ル 以 外 の 因 子 が 働 か ね ば な ら な い と思 わ れ る.
赤 血 球 系 細 胞 にTfRを 介 し て 取 り込 まれ た鉄 は,ト ラ ン ス フ ェ リン か ら 遊 離 さ れ た 後 そ の 大 部 分 は ミ トコ ン ド リア 内 で ヘ モ グ ロ ビ ン合 成 に 利 用 さ れ,残 りはFtや 可 染 性 鉄 顆 粒 と い っ た 非 へ ミン 鉄 と して 細 胞 内 に 存 在 す る こ と と な る が, cytosol内 に 入 っ て か ら ミ トコ ン ド リ ア に 至 る ま で の 鉄 の 存 在 形 態 に つ い て の 詳 細 は 未 だ 不 明 で あ る.正 常 人 の 赤 芽 球 内 でFtは 散 在 性Ft, 集 合 性Ft, micropinocytic Ftと い っ た 存 在 様 式 を と っ て い る が,こ の 他 に 細 胞 膜 周 囲 や 細 胞 間 のstromal Ftも 存 在 す る53).一 方,可 染 性 鉄 顆 粒 に つ い て は,正 常 人 の 赤 血 球 系 細 胞 内 に 起 こ る通 常 の 現 象 で あ る とKaplanが 報 告 して 以 来54)数 多 くの 研 究 が 為 され て 来 た.教 室 の 木 村 は こ の 赤 芽 球 の 可 染 性 鉄 顆 粒 に つ い て そ れ が 赤 血 球 造 血 機 能 を反 映 し て お り,赤 芽 球 の 非 へ ミ ン鉄 代 謝 の 一 側 面 を 示 す もの で あ る こ と を 報 告 し,併 せ てsideroblastgramの 解 析 を 各 種 血 液 疾 患 の 鑑 別 法 と し て 簡 便 か つ 重 要 な 方 法 と し て 確 立 した24).し か し な が ら,そ の 本 態 及 び 鉄 代 謝 に お け る役 割 の 詳 細 に つ い て は 未 だ 不 明 な 点 も 多 く残 さ れ て い る.そ こ で 同 一 の 非 へ ミン 鉄 で あ る 立 場 か らFtと 可 染 性 鉄 顆 粒 との 関 係 に つ い て 検 討 し た 結 果,症 例 内 比 較 で はr=0 .21 (polyclonal), r=0.27(L鎖), r=0.31(H鎖) と強 い 明 瞭 な相 関 は 認 め ら れ な か っ た.可 染 性 鉄 顆 粒 に つ い て は 既 に 教 室 の 木 村 が 報 告 し て い る よ うに 赤 血 球 系 細 胞 の 主 に 成 熟 後 半 期 に お い て観 察 して い る もの で あ っ て55), Ftは 今 回 の 検 討 で 細 胞 成 熟 と と もに 減 少 し て い く傾 向 を 認 め て は い る も の の,こ の よ う に 同 一 症 例 内 の 各 成 熟 段 階 に お い て 量 的 に 異 な る もの を 同 一 視 し て 比 較 検 討 し よ う と す る と こ ろ に は い さ さ か 無 理 が あ る と思 わ れ,今 後 の 検 討 を要 す る と こ ろ で あ る.そ の 一 方,正 常,鉄 欠 乏,鉄 過 剰 と鉄 貯 蔵 状 態 の 異 な っ た 症 例 間 で検 討 す る と, r=0.63 (p<0.1, L鎖), r=0.76(p<0.05, H鎖) と強 い 正 の 相 関 が 得 られ た.こ れ はFtも 可 染 性 鉄 顆 粒 と 同 様 に 生 体 内 の 鉄 貯 蔵 状 態 を 反 映 す る指 標 で あ っ て,鉄 レベ ル に よ っ て 両 者 がregula tionを 受 け て い る た め と推 定 さ れ る.一 部 に 可 染 性 鉄 顆 粒 を集 合 性Ftで あ る と る 報 告 も見 受 け ら れ る が56),本 来Ftそ の もの は 鉄 染 色 の プ ル シ ア ン 青 に 染 ま る性 質 の も の で は な く,こ の 点 も考 慮 す る と可 染 性 鉄 顆 粒 がFtと 同 一 物 質 と は 考 え 難 い.し か し な が ら,今 回 のFtに つ い て の 検 討 はFtの 蛋 白構 造 に 対 す る も の で あ っ て,分 子 内 に 含 有 さ れ る鉄 分 子 そ の もの の 評 価 で は な い 点 か ら,単 に 認 識 して い る対 象 の 相 違 で あ る 可 能 性 も考 え ら れ る.従 っ てFtに 近 い 物 質 で 鉄 染 色 陽 性 と な る もの と い え ば, Ft蛋 白 殻 の 一 部 が 変 性,重 合 を 受 け た 鉄 含 量 の さ ち に 多 い 状 態 で あ る ヘ モ ジデ リン,あ る い は そ の 段 階 に 至 る 中 間 産 物 で あ るFt重 合 体 が 可 染 性 鉄 顆 粒 の 本 態 と考 え る の が 現 時 点 で最 も妥 当 と 言 え よ う. 結 論 ヒ ト骨 髄 塗 抹 標 本 を 用 い て 同 一 の 赤 血 球 系 細 胞 に つ い て そ の 細 胞 形 態 を観 察 し つ つ,細 胞 内 Ft量,可 染 性 鉄 顆 粒, TfR数 を 半 定 量 す る 方 法 を考 案 す る と共 にFtと 他 の パ ラ メ ー タ ー と の 関 係 に つ い て 解 析 を行 っ た 結 果,以 下 の 成 績 を得 た. 1.赤 血 球 系 細 胞 内Ft濃 度 は,抗Ft-H鎖 monoclonal抗 体 を用 い た検 討 で は好 塩 基 性 赤 芽 球 か ら正 染 性 赤 芽 球 ま で 成 熟 に 伴 い 減 少 す る一 方(r=-0.62, p<0.05),抗Ft polyclonal抗 体,抗Ft-L鎖monoclonal抗 体 を用 い た 検 討 で は 不 変 で,い ず れ も脱 核 以 後 著 減 し た. 2.正 常,鉄 欠 乏,鉄 過 剰 の 症 例 別 の 検 討 で, 平 均 細 胞 内Ft濃 度 は 好 塩 基 性 赤 芽 球 か ら正 染 性 赤 芽 球 ま で の 段 階 で 鉄 過 剰 症 例 で は 正 常 よ り 増 加 して お り,鉄 欠 乏 症 例 で は 逆 に 減 少 し て い た. 3.赤 血 球 系 細 胞 内Ft濃 度 とTfR密 度 と の 間 に は 弱 い な が ら正 の 相 関 関 係 が 窺 わ れ,こ の 傾 向 は 抗Ft-H鎖 抗 体 に よ る解 析 で よ り明 ら か で あ っ た(r=0.52, p<0.01). 4.赤 血 球 系 細 胞 内Ft濃 度 と可 染 性 鉄 顆 粒 密 度 との 間 に は 個 々 の 症 例 内 で は そ の 相 関 は 明 らか で は な か っ た が(L鎖: r=0.27, p<0.01, H鎖: r=0.31, p<0.01),正 常,鉄 過 剰,鉄 欠 乏 の 症 例 間 比 較 で は 正 の 相 関 を 認 め た(L鎖: r=0.63, p<0.1, H鎖: r=0.76, p<0.05). 以 上 か ら 赤 芽 球 の 分 化 成 熟 過 程 に お い て はFt
ヒ ト赤 血球 系 細 胞 の フ ェ リチ ン と他 の鉄 代 謝 関 連 因子
581
のL subunitよ りH subunitが よ り重 要 な 機 能 を果 た して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た.ま た, Ft の 発 現 に は 細 胞 内 鉄 レ ベ ル 以 外 の 因 子 の 関 与 が 考 え られ た. 稿 を終 え るに あ た り,御 指 導 な ら び に御 校 閲 を賜 っ た 恩 師 木 村 郁 郎 教 授 に 深 謝 致 す と と も に,終 始 懇 切 な る御 指 導 と助 言 を賜 りま した 高 橋 清 講 師,宗 田 良博 士,木 村 文 昭助 手 に 感 謝 の 意 を表 し ます. な お,本 論 文 の 要 旨は 第52回 日本 血 液 学 会 総 会 に お い て 発 表 した.
文
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