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D-バリン培地法により選択的に初代培養したラット胆管上皮細胞に対する Phospholipase A(2) の細胞増殖促進効果の解析

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岡山医学会雑 誌  第114巻 January 2003, pp. 289-296•@

原 著

D-バ

リン培 地 法 に よ り選 択 的 に 初 代 培 養 し た ラ ッ ト胆 管 上 皮 細 胞 に 対 す る

Phospholipase

A2の 細 胞 増 殖 促 進 効 果 の 解 析

小 倉 薫1,4),渡 辺 泰 宏1),平 峯 千 春2),中 川 利 孝3) 土 岐 彰1),徳 田 雅 明4) キ ー ワ ー ド:膵 ・胆 管 合 流 異 常,胆 管 上 皮 細 胞, D-バ リ ン, Phospholipase A2,細 胞 増 殖 緒 言 膵 ・胆 管 合 流 異常 は,解 剖 学 的 に 膵 管 と胆 管 が 十 二 指 腸 壁 外 で合 流 す る先 天 性 の 奇 形1)と定 義 さ れ る疾 患 で,胆 道 発 が ん を高 率 に合 併 す る2)ことが知 ら れ て い る.そ して こ の奇 形 と本 疾 患 の 病 態,特 に胆 道発 が ん と を結 び付 け る上 で重 要 な の が,膵 液 の 胆 道 へ の病 的 な逆 流 で あ る. 正 常 な膵 管 と胆 管 は 十 二 指 腸 壁 内 で合 流 し,そ の 周 りを Oddi氏 筋 で取 り囲 まれ るた め膵 液 の 胆 道 へ の 逆 流 は 見 ら れ な い.そ れ に 対 し て膵 ・胆 管 合 流 異 常 で はOddi氏 筋 が膵 ・胆 両 管 合 流 後 の 共 通 管 を取 り囲 む ため,膵 管 と胆 管 の 内圧 差 に よ りに 膵 液 が 胆 道 に逆 流 す る こ と と な る. 逆 流 した膵 液 中 のAmylase, Lipase, Trypsin, Elastase I, Phospholipase A2 (PLA2)と い った 消 化 酵素 に長 期 間暴 露 され る こ とに よ っ て 胆 道 上 皮 が 障 害 を うけ,炎 症 性 障 害 に引 き続 く再 生 を慢 性 的 に く り返 す 状 態 が 存 在 す る.こ こで さ ら に胆 道 内 変 異 原 物 質3)に暴 露 され る こ とに よ って が ん 化 を 引 き起 こ す と考 え られ て い る.現 在 で は 病 理 学 的 検 討 に よ り,膵 ・胆 管 合 流 異 常 に しば しば 観 察 され る上 皮 の 過 形 成 性 変 化 が4),5)がん化 の 初 期 変 化 と して 支 持 され て い る. 近 年,膵 液 に含 まれ るPLA2が 新 しい 情 報 因 子 と して 再 認 識 され る よ うに な っ て き た. PLA2は 分 子 量14KDa の 低 分 子 量 分 泌 型PLA2と 分 子 量30か ら85KDaの 高 分 子 量 細 胞 内 在 型PLA2に 分 類 さ れ,ほ 乳 類 の 低 分 子 量 分 泌 型PLA2は Ⅰ型 と Ⅱ 型 の サ ブ グル ー プ に さ らに分 類 さ れ る. Ⅱ型PLA2は 血 小 板 や 炎 症 組 織 で 検 出 され 炎 症 の メデ ィ エ ー ター と し て注 目 され て い る.一 方 Ⅰ型PLA2 は 膵 臓 の 腺 房 細 胞 よ り産 生分 泌 され,食 物 中 の 脂 肪 酸 の 消 化 酵 素 と して働 くこ とが 主 た る働 きで あ る と考 え られ て き た.し か し Ⅰ型PLA2が 肺 や 脾 臓 な どの 非 消 化 器 官 で も発 現 し て い る6),7)ことが 明 らか に され た こ とを き っか け と して, Ⅰ型PLA2の 新 しい生 理 機 能 が 明 らか に され つ つ あ る.そ の 中 で 我 々 が 注 目 した の が 特 異 的 レ セ プ タ を介 した 増 殖 因 子 と して の 働 き8)であ る. 本 研 究 で は膵 ・胆 管 合 流 異 常 に お い て 胆 道 に 逆 流 し た Ⅰ型PLA2(以 後 単 にPLA2と 記 載)が 胆 道 上 皮 に対 し 直 接 に 増 殖 因子 と し て働 き,過 形 成 性 変 化 を 引 き起 こ し て い る可 能 性 を検 討 す る た め に,ラ ッ ト肝 外 胆 管 上 皮 細 胞 の 初 代 培 養 を行 い, PLA2添 加 に よ る増 殖 性 の 変 化 を 解 析 した. 材 料 と 方 法 1.  ラ ッ ト胆 管 上 皮 細 胞 の 分 離 と 同 定 1)  初 代 培 養 及 び ク ロ ー ニ ン グ SDラ ッ ト(8週 齢:雌)を ネ ン ブ タ ー ル 麻 酔 下 に 開 腹 し,総 胆 管 を 十 二 指 腸 入 口 部 で 結 紮 切 離 し た. 2週 間 後 に 拡 張 し た 肝 外 胆 管 を 摘 出 し, PBSで 洗 浄, 1000PU/ml デ ィ ス パ ー ゼ(合 同 酒 精, Tokyo), 500U/mlコ ラ ゲ ナ ー ゼ(Wako, Osaka)を 含 むPBS中 に37℃ で30分 静 置 し た.そ の 後 十 分 に ピ ペ ッ ト操 作 を 行 い 胆 管 上 皮 を剥 離 さ せ た.遊 離 し て き た 細 胞 を1,000rpmで2分 間 遠 沈 し て 細 胞 を 回 収 し, 5% FBSを 含 むD-バ リ ン(D-val) MEM 培 地(Gibco, Gaithersburg)で 一 ヶ 月 間 培 養 し た.そ の (平成14年1月31日 受 理) 香川 医 科 大 学 生 理 学 講 座 指 導:徳 田雅 明 教 授 1) 香 川 医 科 大 学 小 児外 科 学 2) 同 基 礎 看 護 学 3) 同 附 属 実 験 実 習 機 器 セ ン タ ー 4) 同 生 理 学 論 文 請 求 先:小 倉 薫 電 話:087-891-2095 FAX: 087-981-2096 E-mail:kog@kms.ac.jp

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後 はD-valを92mg/Lの 濃 度 で 加 え たDMEM/F-12培 地 (Gibco, Gaithersburg) (5% FBS添 加)で 培 養 し た. 細 胞 の 継 代 に は, 0.5% Trypsin-0.2% EDTA溶 液 (Gibco, Gaithersburg)をPBSで10倍 に 希 釈 し て 使 用 し た.ク ロ ー ニ ン グ は コ ロ ニ ー 形 成 法9)を 用 い,以 後 の 電 子 顕 微 鏡 に よ る微 細 構 造 の 観 察,上 皮 細 胞 マ ー カ ー タ ン パ ク 質 で あ るcytokeratinの 免 疫 染 色,多 糖 類 染 色,細 胞 増 殖 に 与 え るPLA2の 影 響 の 検 討 に は こ の ク ロ ー ン を 使 用 し た. 2)  ク ロ ー ニ ン グ し た 細 胞 の 同 定 (1)  電 子 顕 微 鏡 に よ る 微 細 構 造 の 観 察 2.5%グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド1時 間 固 定, 1%オ ス ミ ウ ム 酸 後 固 定 後,エ ポ ン 包 埋 し,超 薄 切 片 を 作 成,酢 酸 ウ ラ ニ ウ ム,ク エ ン 酸 鉛 の 二 重 染 色 を し て 透 過 型 電 子 顕 微 鏡

(JEM-1200 EX:日 本 電 子, Tokyo)で 観 察 し た.

(2) cytokeratin蛍 光 免 疫 染 色

培 養 細 胞 を チ ェ ン バ ー ス ラ イ ド(Nunc, NY)上 で 培

養 し, 1%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドで3分 間 固 定 し た. 0.2

% Triton X-100で10分 間 処 理 後, 50倍 希 釈 抗cytoker atin (pan)ポ リ ク ロ ナ ー ル 抗 体(Cappel, Ohio)を 室 温

で1時 間, FITC結 合 抗rabbit IgG抗 体(Vector, CA)

を 室 温 で30分 順 次 反 応 さ せ た.各 ス テ ッ プ 間 はPBS-T

(0.05% Tween 20)で 洗 浄 し た.観 察 に は 共 焦 点 レ ー

ザ ー 顕 微 鏡(LSM-GB 200: 0LYMPUS, Tokyo)を 用

い た.ま た 陰 性 コ ン ト ロ ー ル と し て は 非 免 疫rabbit IgG (lnter-Cell Technologies Inc, NJ)を 同 様 の 濃 度 で 使 用 し た. (3)  多 糖 類 染 色 培 養 細 胞 を チ ェ ン バ ー ス ラ イ ド(Nunc, NY)上 で 培 養 し, 10%中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン で5分 間 固 定 しPAS染 色,ア ル シ ア ン プ ル ーpH 2.5染 色 を 行 っ た. 2.  ラ ッ ト胆 管 上 皮 細 胞 に 対 す るPLA2の 細 胞 増 殖 促 進 効 果 に つ い て の 検 討 35mm dishに3×104個 の 細 胞 を ま き こ み30時 間 後 に

PLA2 (Pig pancreas: Boehringer, Heidelberg)添 加 培 地 に 交 換 し た. PLA2濃 度 は10nM, 50nM, 100nM (n=

5)と しPLA2添 加 後1, 3, 5日 目 に 粒 子 計 数 分 析 装

置(CDA-500: Sysmex, Kobe)で 細 胞 数 を 計 測 し,非

添 加control群(n=5)と 比 較 し た.各 群 間 の 有 意 差 検 定 に はt検 定 を 用 い た. 結 果 1.  ラ ッ ト胆 管 上 皮 細 胞 の分 離 と同 定 1) 初 代 培 養 及 び ク ロー ニ ン グ 初 代 培 養 開 始 時 に は 細 胞 集 塊 か ら這 い 出 す よ うに 増 殖 す る上 皮 細 胞(図1 A)と と もに繊 維 芽 細 胞(図1 B) の増 殖 を認 め たが, D-val培 地 下 で の 培 養1ヶ 月 頃 か ら は繊 維 芽 細 胞 は 目 立 た な くな っ た.そ の 後10代 以 上 の 継 代 を く り返 し たの ち,単 一 細 胞 よ り形 成 さ れ た コ ロニ ー か ら敷 石 状 の 形 態 を示 す クロ ー ン(図1 C)を 得 るこ と に成 功 した. 2)  ク ロー ニ ン グ した 細 胞 の 同 定 (1) 電 子 顕 微 鏡 に よ る微 細 構 造 の観 察 細 胞 表 面 に は微 絨 毛(図2 A)を,細 胞 内 に は トノ フ ィ ラ メ ン ト(図2 B)を,細 胞 間 に は デ スモ ゾー ム(図2 C) を認 め た. (2) cytokeratin蛍 光 免 疫 染 色 培 養 細 胞 で は 抗cytokeratin抗 体 に よ り,細 胞 質 に 陽 性 反 応 を認 め た(図3 A). (3) 多糖 類 染 色 細 胞 はPAS染 色 陽 性 で あ っ た(図3 C)が,ア ル シ ア ン プ ル ー 染 色 陰 性(図3 D)で あ っ た.ま たPAS染 色 で は 細 胞 質 に粗 大 なPAS陽 性 顆 粒 が 散 見 さ れ た. 2.  ラ ッ ト胆 管 上 皮 細 胞 に 対 す るPLA2の 細 胞 増 殖 促 進 効 果 に つ い て の 検 討 PLA2添 加 に よ り 胆 管 上 皮 細 胞 は3日 目 でcontrol 群: 9.5±0.7×104 cellsに 対 し50nM PLA2添 加 群: 16.2±1.0×104 cells, (P<0.01)お よ び100nM PLA2 添 加 群: 13.7±0.7×104 cells, (P<0.05)が, 5日 目 で はcontrol群: 14.3±0.5×104 cellsに 対 し50nM PLA2 添 加 群: 18.8±0.4×104 cells, (P<0.001)お よ び100 nM PLA2添 加 群: 21.3±1.1×104 cells, (P<0 .01)が 有 意 な 細 胞 数 の 増 加 を 示 し た.ま た50nM添 加 群 と100nM 添 加 群 間 に は 有 意 差 は な か っ た. 考 察 膵・胆 管 合 流 異 常 で は 膵 液 の 胆 道 内 逆 流 が 起 こ り,胆

道 内 にAmylase, Lipase, Trypsin, Elastase I, PLA2 と い っ た 膵 酵 素 が 高 濃 度 に 認 め ら れ る10).さ ら に こ れ ら膵 酵 素 は 活 性 化 さ れ た 状 態 で 存 在 す る11),12)と が 報 告 され て い る.活 性 化 さ れ た 膵 酵 素 は 胆 道 上 皮 に 障 害 を あ た え,

細 胞 回 転 の 亢 進 を 引 き起 こ す こ と がPCNA, Ki-67,

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Phospholipase A2の 胆 管 上 皮 細 胞 増 殖 促 進 効 果  291 れ て い る.そ し て 細 胞 増 殖 能 の 亢 進 し た 細 胞 が 胆 道 内 の 変 異 原 物 質 に 暴 露 さ れ る こ と に よ っ て,が ん 遺 伝 子 で あ るK-ras15)や が ん 抑 制 遺 伝 子 のP5316)等 に 遺 伝 子 変 異 を 起 こ し,が ん 化 を 引 き 起 こ す と推 測 さ れ て い る. 上 皮 系 細 胞 の 悪 性 化 モ デ ル と し て は,大 腸 が ん 発 生 に お け るVogelsteinのAdenoma-Carcinoma-Sequence17) が 有 名 で あ る が,膵・胆 管 合 流 異 常 に お い て は 病 理 学 的 見 地 よ りHanadaら4)のHyperplasia-Dysplasia-Carcinoma-Sequenceが 支 持 さ れ て い る . 図1  培 養細 胞 の 位 相 差 顕 微 鏡像 A:敷 石 状 の 形 態 を示 す 初 代 培養 時 の 胆 管 上 皮 細 胞. B:初 代 培 養 時 に 混 入 す る繊 維 芽 細 胞. C:ク ロー ニ ン グ後 の 胆 管 上 皮 細 胞. (× 200). 図2  透 過 型 電 子 顕 徴 鏡 像 A:細 胞 表 面 に 多 数 の 徴 絨 毛 を 認 め る(×2000, bar=2μm) . B: 細 胞 内 に 網 目 状 に 走 行 す る ト ノ フ ィ ラ メ ン ト(arrow head)を 認 め る(×8000, bar=1μm) C:細 胞 間 に デ ス モ ゾ ー ム(arrow) を 認 め る(×15000, bar=500nm). 我 々 は こ の膵 ・胆 管 合 流 異常 胆 道 上 皮 の初 期 変 化 で あ る過 形 成 の 原 因 と してPLA2に 注 目 し た.膵 液 に 含 まれ るPLA2は 脂 肪 酸 を加 水 分 解 す る消 化 酵 素 と して知 られ

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て い る が,近 年PLA2が 特 異 的 レ セ プ タ ー を 介 し てSwiss 3T3細 胞8),膵 が ん 細 胞18)等 に 増 殖 因 子 と し て 働 く こ と が 報 告 さ れ た.こ のPLA2レ セ プ タ ー は マ ク ロ フ ァ ー ジ の マ ン ノ ー ス レ セ プ ター と起 源 を 同 じ くす る 分 子 量 約190 kDaの1回 膜 貫 通 型 レ セ プ ター19)で,肝 臓 を 含 む 多 く の 臓 器 に 発 現 し て い る20)こ と も 明 ら か と な っ て い る. 本 研 究 で は 胆 管 結 紮 ラ ッ トの 肝 外 胆 管 よ り得 ら れ た 胆 管 上 皮 細 胞 をPLA2添 加 培 地 で 培 養 し, PLA2の 細 胞 増 殖 促 進 効 果 に つ い て 検 討 し た.

図3  光 免 疫 染 色 像(A, B) A:細 胞 質 にcytokeratinの 陽 性 反 応 を 認 め る. B: control. (×1000). 多 糖 類 染 色 像(C, D) C: PAS染 色. D:ア ル シ ア ン ブ ル ーpH 2.5染 色. (×400).

図4  PLA2添 加 後 の 細 胞 数 の 変 化

control (0nM PLA2, □), 10nM PLA2 (〓), 50nM PLA2(〓), 100nM PLA2 (■)の 細 胞 数 を 平 均 値+SDで 表 し て い る(n=5). (*** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05) これ ま で も胆 道 上 皮 細 胞 の初 代 培 養 にっ い て の報 告 は 散 見 さ れ る21),22)が,機能 解 析 を行 っ た 報 告23)は少 な い.こ れ は繊 維 芽 細 胞 の 混 入 が 大 き な障 害 と な っ て い る こ とに よ る と推 測 され る.繊 維 芽 細 胞 の 混 入 が 培 養 初 期 に極 少 数 で あ っ た と して も繊 維 芽 細 胞 は上 皮 細 胞 に く らべ て 増 殖 が 速 く,ま たvitroの 環 境 に 馴 化 しや す い た め 次 第 に 上 皮 細 胞 を圧 倒 す るこ と とな る24)からで あ る.繊 維芽 細胞 の 混 入 を 防 ぐ方 法 と して は コ ラー ゲ ン ゲ ル 上 で培 養 す る 方 法25),単離 した 細 胞 の 比 重 の違 い を 用 い る 方 法26),エ チ ル 水 銀 サ リチ ル 酸 を用 い る 方 法27)等が あ る.我 々 は以前, Scottら が 腎 上 皮 細 胞 を培 養 す る ため 考 案 し たD-val

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Phospholipase A2の 胆 管 上 皮 細 胞 増 殖 促 進 効 果  293

MEM培 地 を 用 い る 方 法24)を も と に し て 胸 腺 上 皮 細 胞 の

初 代 培 養 系 を確 立 し 報 告 した28)が,今 回 は 胆 管 上 皮 培 養 に

応 用 し た.細 胞 の 増 殖 に は 必 須 ア ミ ノ 酸 の 一 っ で あ る

valineが 不 可 欠 で あ る.さ ら にvalineに はD-valとL-val

の2つ の 異 性 体 が 存 在 し細 胞 に 必 須 な の はL-valで あ る.

上 皮 細 胞 に 存 在 す るD-amino acid oxidaseはD-valを 2-Ketoisovaleic acidに 変 換 す る. 2-Ketoisovaleic acidはbranched-chain amino acid: 2-oxoglutarate

aminotransferaseに よ りL-valに 変 換 さ れ る.つ ま り

上 皮 細 胞 は 必 須 ア ミ ノ 酸 で あ るL-valを 除 き,か わ りに

D-valを 添 加 し た 培 地 中 で も 増 殖 で き る.そ れ に 対 し て

D-amino acid oxidaseを 持 た な い 繊 維 芽 細 胞 の 増 殖 は D-val培 地 中 で は 阻 害 さ れ る こ と と な る24). D-val MEM培 地 を 用 い て 選 択 的 に 上 皮 細 胞 を 培 養 す る場 合 の 問 題 点 と し てFBSに 由 来 す るD-valの 存 在 が あ る.細 胞 培 養 技 術 が 発 達 し た 現 在 に お い て も初 代 培 養 に は, FBSが 不 可 欠 で あ る が, FBSに は44mg/L程 度 の L-valが 含 ま れ て い る29).つ ま り我 々 の 用 い た5% FBS

添 加D-val MEM培 地 中 に も92mg/LのD-valに 加 え て

FBSに 由 来 す るL-valが2.2mg/L程 度 含 ま れ て い る と 予 想 さ れ た.位 相 差 顕 微 鏡 に よ る 形 態 観 察 で は 培 養 細 胞 の 多 くは 敷 石 状 の 形 態 を 示 しD-val MEM培 地 は 胆 管 上 皮 細 胞 の 選 択 的 培 養 に も有 効 と 思 わ れ た.し か しD-val MEM培 地 を 用 い て も繊 維 芽 細 胞 の 増 殖 を 抑 制 で き な か っ た と の 報 告30)も 見 られ る た め,我 々 は 均 一 な 細 胞 ク ロ ー ン を用 い てPLA2の 影 響 を 検 討 す る こ と と し た .コ ロ ニ ー 形 成 法 に よ り ク ロ ー ニ ン グ し た 細 胞 はcytokeratin陽 性 で,表 面 に 微 絨 毛 を 持 ち,細 胞 内 に は ト ノ フ ィ ラ メ ン トを,細 胞 間 に は デ ス モ ゾ ー ム を 認 め た.さ ら に,正 常 ラ ッ ト総 胆 管 上 皮 はPAS染 色 陽 性,ア ル シ ア ン ブ ル ー 染 色 陰 性 で あ る と 報 告 さ れ て い る31)が,ク ロ ー ニ ン グ した 細 胞 も 同 様 の 染 色 性 を 示 す な ど 胆 管 上 皮 細 胞 の 特 徴 を 保 持 して い た. 細 胞 数 の 増 加 を 指 標 と し たPLA2の 増 殖 促 進 作 用 の 報 告 に よ る とSwiss 3T3細 胞 で は100nM8)で,膵 が ん 細 胞 で は25nM, 50nM18)の 濃 度 で 有 意 な 増 殖 促 進 作 用 を 示 す と さ れ て い る.我 々 は10nM, 50nM, 100nMの 濃 度 でPLA2を 添 加 し た 培 地 中 で 細 胞 を5日 間 培 養 し,細 胞 数 の 増 加 を 測 定 し た.胆 管 上 皮 細 胞 に お い て, PLA2の 50nM, 100nM添 加 群 で 非 添 加control群 と 比 較 し有 意 な 細 胞 数 の 増 加 を 認 め, PLA2が 胆 管 上 皮 細 胞 に 増 殖 因 子 と し て 作 用 し て い る こ と が 示 さ れ た.さ ら に,膵 ・胆 管 合 流 異 常 の 自 験 例 に お け る 胆 嚢 内 胆 汁 中 のPLA2濃 度 は273nMか ら1,571nMで あ り平 均 は992nM (n=4) で あ り(未 発 表 デ ー タ)胆 嚢 内胆 汁 は 胆 管 内 胆 汁 よ り5 ∼50倍 程 度 濃縮 さ れ て い る32)ことか ら,胆 管 内胆 汁 中 の PLA2濃 度 は,今 回細 胞 増 殖 を示 した 濃 度 と同 じ レベ ル で あ る と考 え られ,膵 ・胆 管 合 流 異常 で の 胆 管 上 皮 細 胞 の 増 殖 充 進 状 態 に はPLA2が 増 殖 因 子 と して直 接 作 用 し て い る 可 能 性 が示 唆 さ れ た. 結 論 我 々 は 膵 ・胆 管 合 流 異 常 の 胆 汁 中 に 多 量 に 含 ま れ る PLA2が 膵 ・胆 管 合 流 異常 胆 道 上 皮 に 対 し て増 殖 因 子 と して 働 き,過 形 成 性 変 化 を引 き起 こす 原 因 の 一 つ で あ る とい う仮 説 を立 て,ラ ッ ト肝 外 胆 管 上 皮 細 胞 の 初 代 培 養 系 を確 立 して, PLA2が 増 殖 に 及 ぼ す効 果 を検 討 した. D-val含 有 培 地 の使 用 と,そ れ に 加 え た コ ロ ニ ー 形 成 法 に よ る ク ロー ニ ン グ で,繊 維 芽 細 胞 の 混 入 して い な い ラ ッ ト肝 外 胆 管 上 皮 細 胞 の 選 択 的 培 養 に 成 功 した.こ れ らの 細 胞 は 敷石 状 の形 態 を示 し,上 皮 細 胞 マ ー カ ー で あ るcytokeratin陽 性 で あ り,微 絨 毛,ト ノ フ ィ ラ メ ン ト, デ ス モ ゾー ム 等 の 細 胞 内 構 造 を有 し, PAS染 色 陽性 で あ る な ど,培 養 材 料 とな っ た ラ ッ ト胆 管 上 皮 細 胞 の特 徴 を 保 持 して い た. こ の 細 胞 は 膵 ・胆 管 合 流 異常 の 胆 汁 中 に含 ま れ るの と 同 じ レベ ル で あ るnMオ ー ダー(50nM, 100nM)の 濃 度 のPLA2に よ り有 意 な 増 殖 の促 進 が 認 め られ, PLA2 の 増 殖 促 進 効 果 が 証 明 され た.膵 ・胆 管 合 流 異 常 で の 胆 管 上 皮 細 胞 の増 殖 亢 進 状 態 に はPLA2が 増 殖 因 子 と して 直 接 作 用 して い る可 能 性 が 示 唆 され た. 文 献 1) 日 本 膵 管 胆 道合 流異 常 研 究 会 ・診断 基 準 検 討 委 員 会: 膵 ・胆 管 合 流 異 常 の 診 断 基準. 第24回 日本 膵管 胆 道 合 流 異 常 研 究 会 プ ロ シー デ ィ ン グス (2001) 24, 18-19 . 2) 戸谷 拓 二, 渡 辺 泰 宏, 藤 井 正, 他: 膵 ・胆 管 合 流 異 常 お よび 先 天 性 胆 道拡 張症 に おけ る癌 発 生-本 邦 報 告例303例 の集 計 か らの 反 省-. 胆 と膵 (1985) 6, 525-535. 3) 加 藤 哲 夫, 水 野 大, 吉 野裕 顕, 蛇 口達 造, 山 田真 美 子: 膵 胆 管 合 流 異 常環 境 下 に お け る胆 道 内変 異 原 物 質 . 肝 胆 膵 (2001) 43, 465-472.

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Phospholipase A2の 胆 管 上 皮 細 胞 増 殖 促 進 効 果  295

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(8)

Effect of phospholipase A2 on proliferation of the primary cultured biliary epithelial cells from the extra-hepatic bile duct of rats using D-valine containing medium.

Kaoru OGURA 1,4), Yasuhiro WATANABE1), Chiharu HIRAMINE2), Toshitaka NAKAGAWA3), Akira TOKI1) and Masaaki TOKUDA4)

Departments of 1)Pediatric Surgery, 2')Basic Health Science and Fundamental Nursing, 3) Research Equipment Center

, and4) Physiology Kagawa Medical University Kagawa 761-0793, Japan

(Director: Prof. Masaaki TOKUDA)

We hypothesized that a high level of phospholipase A2 (PLA2) in bile juice works as a growth factor on biliary epithelial cells and causes hyperplastic change of the bile duct in pancreaticobiliary maljunction. In order to examine this hypothesis, we established a primary culture system of biliary epithelial cells from the extra-hepatic bile duct of rats. We successfully excluded fibroblasts from the epithelial cells using D-valine-containing medium and the single

-cell cloning method . The established cells exhibited the characteristic features of rat bile duct epithelial cells. They were stained with anti-cytokeratin antibody, a marker protein of epithelial cells, were positive with PAS stain, and possessed the architectures of microvilli, tonofilament fibers and desmosomes. The effect of PLA2 on proliferation of these cells was then examined. We clearly demonstrated that PLA2 at nano-molar concentration (50nM, 100nM), that is, equivalent to the level of PLA2 in the bile juice of pancreaticobiliary maljunction cases, caused a significant enhancement of epithelial cell proliferation.

参照

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