ヨード化蛋白の研究

ヨード化蛋白の研究

著者 石川 信雄, 藤田 礼三

雑誌名 星薬科大学紀要

号 4

ページ 57‑65

発行年 1954

URL http://id.nii.ac.jp/1240/00000005/

ヨード化蛋白の研究

      石川信雄 藤田礼三

 ヨード化蛋白研究の主流は二大別される、1つは低温ヨード化（又は中性ヨード化）で蛋白変性 を起さぬ条件にてチロシン基、ヒスチジン基のみをヨード化する方法であり、活性蛋白の研究に広

く用いられて来た。他の1つは高温ヨード化で最近の生体内サイ・キシン生成機構の究明等花々し い業績は主としてこの分野より端を発したものである。

 本綜説に於ては、この二方向に分けて、業績を蒐集して見た。

 生物学的試験法にっいてぱReineke，（91）硬蛋白質のヨード化にっいてはRoche，（92）の綜 説を、又良参老文献としてSalter，（93）， Olcott（94）を挙げる。

  中性ヨード化

 蛋白に対するヨードの反応として附加置換が挙げられる。附加反応ぱチオエーテル基については 考えられるがペプチツド窒素には確定した説がなv・。むしろ高含量ヨード蛋白（ヨード18％Peri−

odo−casein）に於てはヨード、ヨードイオンの吸着が見られる。（1）之に反して置換反応及び酸化 反応ぱ常に起る反応である。活性蛋白の有効基を検索する場合傍生する酸化反応を制禦すれば蛋白 変性を来さないヨード化を実施する事が出来る。我々は之を申性ヨード化と呼ぶ。例えばPH5．0〜

6．0（叉は中性緩衝液）ヨードヨードカリ液、O℃の条件下でペプシン②③、血清アルブミン（4）（5）（6）

÷」

イログロブリン⑦の研究に用いられる．蛋白申のヨード含量は添加試薬の量により1〜4％、後 述アルカリ性ヨード化で6〜14％のヨードが入る。然し後者の場合は蛋白の一部変性が起る為注意し なければならない。天然蛋白は遊離チロシソよりもヨードとの反応度が低い然し尿素変性後はヨー

ドとの反応度がずつと増加する。⑧⑨、安定な蛋白の例としてツエイン、カゼインがある。ヨード ツエイン（Iodozein）はチロシン基の完全ヨード置換によつても変性を来たさない（6．9〜7．5％12）。

⑩然し一般蛋白では部分ヨート化に止める。血清アルブミンのヨード化（4）（5）（6）叉Iodopeps：n（2）③

の各種ヨード含量のものも得られて居るが3％までは変性を来たさない。ただヨード含量の相異に よ｝）溶解度は変化して来る。Iodopeps三nはハロゲンのε0％がヨードチロシンとして存するに反し てヨード化度の低v・他のヨードペブシンは65％がモノヨードチロシンである。

 Har五ngton⑪により得られたヨードインシユリンは15．4％の1，を含むがこの場合は完全ヨー ド化されて居るにも拘らず生理的効力が5〜10％残存し接触還元により50％の効力が恢復する。叉 三一ド化フィプロィン⑫にてチロシンの蛋白内配位状態の研究が行われた。以下申性ヨード化を用 いる活性蛋白（ホルモン、酵素）の研究を眺めて見よう。

  ホルモンのヨード化

 乳汁分泌ホルモンにPH7．0の燐酸緩衝液申でヨード化を行うと分子中のチロシン基のみが反応

 58

しジョードチロシン基となる。するとホルモンの生物学的効力は失われ等電点は4．7に低下する，

⑬チロシソ基には遊離チロシンと同じヨード化速度のものと若干遅v・ものの二種が存在する。貫ち ホルモン分子申には二型の異なつた結合状態でチロシソが内部結合してることが分つた⑭

 成長ホルモンのヨード化の場合もチロシン基に選択的に働きヨード化の程度と効力減少の速度と 比例する為チロシン基がホルモン作用に重要な事が証せられる。㈲

 インシユリンではアルコール性アンモニア液中でのヨード化ではフエノール基をヨード化置換し た場合やはり効力低下を来すが脱ヨード化すると再び効力が現れて来る。然しフエノール基の半分

ヨード化に於ては街60％の効力がある，⑪この半分ヨード化め場合ヨードインシユリソの分光学的 検索によればチロシソの18％はD．1．T，32％はM．1．T．，として検出される。ところが大過剰ヨード による反応ではD．1．T．，が大部分を占めて来る。これ等の変化はペーパークロマトグラフイーによ

りて観察される。旬Rocheによれば過剰ヨード化によつてサイロキシソが生成されると云う。⑯  humam chorionic gonadotrop三nの申性ヨード化による完全無効化はチロシン基と生理作用の

重要関係を示す。⑰

 Ferrob㏄はA．C．T．H．，をRadioactive I131を以ってヨード化しその生物学的反応機序を研 究した。⑱伊藤は⑲唾液腺ホルモンを申性ヨード化すると著明な効力減損を来す事を報告した。メ

ラニン細胞拡張因子も中性ヨード化により効力が低下する。⑳   酵素のヨード化

 ペプシンは1分子当り34〜40個のヨード原子が結合された時完全に失活する。⑳このヨード化 ペプシンを加水分解するとジヨードチロシンが得られる。叉1分子申2個のヨードが入る程度の部 分ヨード化ペプシンを（生理的効力は15〜20％減少）加水分解するとモノヨードチロシンが得ら れる。②1分子中17個のチロシン中12個のみが自由にヨード化され、5個は抵抗がある。この難ヨ

ー

ド化チロシン5個の内3個ぱ7．17M尿素で処理後はヨード化される様になる。（9）Fraenkel−

Co㎜t（22）はトリプシン中の有効因子となる作用基を調らべる為アセチル化、ヨード化等の各 種反応を実施したが酵素作用の減少を来さなかつた。そしてインドール核及アミドが重要であると 報告した。イチヂクの乳液申の酵素Ficinは過酸化水素及ヨード化により失浩すると云う。 （23）

Ureaseのヨードによる阻害は恐らく置換よりもむしろその酸化作用に因する。 SH→−S−S一の変化

の為であろう。 （24）

 Lysozymeは酸性に於ては加熱にも耐える安定度を示すがアルカリ性では不安定である。従つて ヨード化は酸性に於て研究された。ヨード化により失活し亜硫酸塩により賦活される為最初は一SH 基の酸化還元によるものと考えられた。（25）然しこれは誤りでヨード化はチロシン基のみならず

イミダゾール基にも行われる事が知られ、叉一SHが存在しない事もわかつた。亜硫酸塩はヨード

 ィミダッォールより脱ヨード化をし（N一結合ヨードははつれ易い）この為に作用が賦活する事

化

      59 が証明された。即ちこの場合ヒスチヂン基が酵素作用に重要である。（26）トリプトプアンを多量 に含有する（6％）キモトリプシンはPH3，5ではヨード化出来なかったが恐らく中牲では反応せ

しめる事が出来よう（27）

  抗原抗体反応

 蛋白の血清学的特異性は極めて特右な性質であり正常条件下では変化しないが、この蛋白を他の 分子と結合させる事によつてその特異性を変える事が出来る。ヨード化した蛋白の特異性ぱそのジ 巨一ドチロシン基によるものである。しかしこれらの蛋白に対する抗体は甲状腺蛋白なるチレオグ ロブリンと反応しなv・。（28）この事はチレオグロブリンのジヨード基が大きv・チレオグロブリン 蛋白分子の内部に位置して居る事及びジヨードチロシン抗体が夫に近付き難v・事を示して居る。初 期の研究では各抗原がその抗元分子の決定族に相補的に適合した唯一の型の抗体を形成すると考え

られて来た。処が最近1つの分子に2っあるv・は夫以上の異つた型の決定族を有する抗原を注射す ればそれぞれ異つた型の抗体が得られる事がわかった。ヨードとアゾフエニールアルゾニツク酸を 分子申に導入したグロブリソの注射によつてはジヨードチロシンに対する抗体とアゾフエニルアル ソニック酸基に対する抗体の形成が起る。（29）この二つの型の抗体は前者の方はIodoova lbum−

．nとの沈澱により後者の抗体はアルザニルアゾアルブミンによつて分離されるがiodoarrsanilazo

ユ

ovalbu面nを加へてもそれ以上の沈澱を起さなv・。 Psessma㎜は』血清の部分ヨード化と抗体との 関係を報告して居る。（30）蛋白分子のヨード化により細菌凝集素作用の低下する事が知られて居

る。（31）放射性元素の中でP31がよく使われるがこれは蛋白分子と容易に結合する事、チロシ ン、ヒスチジン残基に置換により入り安定化学結合をつくる事、測定も容易で適当な半減期を有す る事等の為である。臓器に対する抗体をその動物に注射すると抗原抗体反応によつてある臓器に障 害の起る事が知られて居る。この場合P31で印をつけた抗体を用いるとどの組織で抗体が結合し て障害を及ぼしたかが分る。（32〜36）1一とヒブリノーゲン凝固に及ぼす影響の報告がある。（37）

  過剰ヨード化

 過剰のヨードを用v・ると蛋白の変性が起る。過剰ヨード化には粉末ヨードそのまま或は12KI溶 液で微アルカリ性にて行う方法がある。（38〜43）叉アンモニア溶液申nitrogen iodideを用いる

ときは最も大量のヨードを入れることが出来る。（44）ヨード化の完了を見る方法としてはMillon 反応、トリプトフアン核に因するVoisenet and Adamkiewig反応、 Pauly反応の陰性になるの を応用する。（45）（46）（47）ビウレツト反応は微弱となリメチオニンの分解による小量のメチル ヨージトが見られる。高温ヨード化は相当乱暴な反応である事がわかる。rSH、−S−S，−S CH3 の酸化、ペプチド橋の切断も行われるかも知れなv・。滴定曲線解析（48〜51）及び直接定量にてチ

ロシンの一部でさえも変化して居る位である。Sp三ege1−Adolph（52）はX線解析によリチロシン、

ジョードチロシン、サイロキシンの蛋白分子内配置につき報告した。アルカリ性に於て過剰ヨードを

 60

加へた場合はチロシン量よりの理論値以上のヨード結合が起る。Pauly（54）はこの過剰ヨードぱ ヒスチヂンのイミダゾール核に入ると予想して居る。（51） （53）（11）直接にヨード蛋白よりヨ

ー

ドヒスチヂンを取り出す事は証明出来なかつたがベンツオイル及びパラニトロベンゾイルヨード ヒスチヂンを検出して居る。イミダッオール核の炭素と結合せるヨードは強固なものであるがイミ ノ窒素と結合せるヨードは亜硫酸塩で離脱せしめる事が出来る。（15）今過剰ヨード化蛋白をA物 質、亜硫酸塩でN一結合ヨードを除去した蛋白をB物質、短時間ヨード化物質をCとすると次表の

如くなる。 （第1表）

 グロビン蛋白はヒスチヂン含量が多くこのヨード化により（55）11．4％のヨードが入る。亜硫酸 処理により7．6％がC一結合として残り再びヨード化すると11．4％に戻る。この差がヒスチヂン

のヨード消費とされて居る。ニトログロビンは（56）チロシンの炭素に1個のNo2基が入つて居る 為理論量のソ4のみしかヨードが結合しない。以上を要約すると高温ヨード化に於てはヨード化と 同時に酸化反応が副生する。

  ヨード化蛋白の甲状腺＊ルモン作用

 Lenhart（60）は21％ヨード含量のヨードアルブミンを最初におたまじやくし形態変化に用いて 促進作用あるを認めたが毒作用も亦劇しき為サイロキシン作用を確立できなかつた。Rogoff（61）

はヨードアルブミンに於ては甲状腺作用ぱ非常に弱いと報告した。Ludwig Mutzenbecher（62）

は初めてヨード蛋白が甲状腺末と同様にサイロキシンを含むことを追つてHar五ngtonぱ之を確認 した。（93）それまでの報告の或る者は甲状腺作用はなv・と記し、又或る者は加水分解後には非常 に強い作用があると云う様に主張が一致しなかつた。この原因はサイロキシン生成に関するヨード 化の条件がわからなかつた為である。このヨード化蛋白の甲状腺作用を確立したのはReinecke

（64）である。彼は毒作用なく径口投与で一定した効力を有するヨードカゼィンを作製した。モル モット（65）マゥス（66）による実験でも蛋白そのま入の注射でもアナヒラキシーが起らずと云う データを得た。おたまじやくし（65）化学的定量（67）でも検出しうる。Re：neckeはヨード化の 条件として次のものを挙げているご

（a） 湯ミカロヨード量

 蛋白中のチロシンー分子に対してす2原子のヨード以下の添加でサイロキシン作用は弱く4．5〜

6．0原子のヨードで最も強い作用を有する。添加ヨードのソ2が次亜ヨーソ酸の生成に消費されたと すると、置換に費われたヨードぱ丁度…モルチロシンに対して2原子の割合となる。この量を越え

ると再び効力が低下する。次にヨード化終了後70°Cにて18〜20hrs incubateする事により著し

（サイロキシン含量が高まる。（68）即ちチロシンよリヂヨードチロシンの生成後更にこの2分子の 酸化縮合を起さしめる訳である。尤もこのIncubationの報告に対して反対論もある（69）。

（b）PHの影響

      6互 反応申に次亜ヨーソ酸が現われて反応液中のPHを低下させる。それで或る程度緩衝液として役立 つアンモ三ア苛性ソーダ液重曹液がつかわれるが重曹液が最も適するのは1、の酸化ポテンシヤル が良v・為である。（70）PH7．0叉ぱそれ以上に常に保つ事：が必要である。（65）Radioactive P「タ』

でiabeledしたIodocase；nで60℃にincubateすると増量する。（71）

（c）反 応 温度

 Mutzenbecher（72）はカゼインをアンモニア液申冷時ヨード化を行うと殆んどサイロキシソ作 用がなv・と報告した。これを重曹液に再溶解し37°C，2〜3days incubateするとサイロキシソ作 用が現れる。ところが温度を60−70°Cに高めると著しくサイロキシン量が増加することが見られ

る様になる。 （65）

（d）manganese化合物の触媒作用、

 カップリング反応にはヒポヨージドが重要と思われBarkdoll Rossは酸素を導入する事が必要と し（73）Relneckeもマソガン化合物と強撹拝してエアレーシヨンすると効力が高まる（74）と報告 した。以上の諸条件を以て行えば2．8〜3．37％のサイロキシ含有に迄生成せしめ得ると云われる。

これはヂヨードチロシンの場合でも同様である。（74）カゼイン中のチロシン含有5．65％とせばサ イロキシンの理論量は10．6％である。最高実際生成量3．7％は理論量の約30％である。マンガン のみでは駄目で提搾が必要である。

（e）蛋白の適当なるもの

 チロシン含量の多い蛋白質がサイロキシソ生成が多いとは限らない。（表皿）チロシンの蛋白内 部に於ける他アミノ酸との結合がカップリング反応に適するか否かが最も大切である。Ludwig、

Mutzenbecher（62）はヨードカゼイン、血清アルブミン、血清グロブリン、絹ヒプロィンェデスチ ソから結晶サイロキシンを得た。然しペプトソから取り出す事ぱ出来なかつた（69）。絹ヒプロイン の場合チロシン基が互に遠い所に結合して居る為反応が起りにくいらしい。（75）Blaxter（7g）ぱ

ヨード化血清蛋白の甲状腺作用は比較的低くヨード化アルデイン之につぎヨードカゼイソが最高で あると云う。Re三necke，Tumer（65）に詳細は記載されて居る。絹ヒプロインは如何なる条件下で も80％ヨード化されるのみである。（77）上記Re三necke． Turnerとは別にRoche，Michel（70）

及びSadhu（69）はヨードカゼインにつき次の如く述べている。 6％（Case三n）、 3％（thyro−

globulin）、4．5％（Zeln）の線にヨード化が達する迄はサイロキシンは殆んど少く、叉夫を越える と再び減少する．之は過剰のヨード化により酸化分解が起るからである。ジヨードチロシンの一部 ぱdiiodo−hydroxy benzaldehydeに酸化される。（78）湊はヨードカゼイン中の異種ヨードを除 去する事に依わ、効力増強を報告して居る。（79）

   ジヨードチロシン及び誘導体よりのサイ0キシン生成

 ジヨードチロシンとサイロキシンが甲状腺中に同時に存在する事は両者間に何かの関連性が有る

 62

と長い間想像されて居つた。この実証が最初にMutzenbecher（72）により行われた。即ち37°c 2週間微アルカリ性に反応せしめる時0．1％のサイロヰシンが生成する。この時酸素の存在が必要 であり、チオ硫酸亜硫酸塩の如き還元剤は反応を阻止する。同様な実験はTo㎞son，Tewkesbury

（80）、Barkdol1 R（鵬（73）、 Har近1gton（81）により追試され過酸化水素添加の下n−Butallo1とよ く振邊せしめ生成サイロキシンをブタノール層に移行せしめる事に依り工36％に収量を増加せし めた。Reineke， Tumer（74）はN／10 NaOH PH 9．5申Mn：〜04触媒で18〜・20時間反応せしめ 反応温度を60°Cを推奨した。2．8％収量

 以上のジヨードチロシンからサイロキシンの反応はPHが重要因子であり、Opti血㎜PHはチ ロシンがPhenoxideの型で存在するPH10である。 D．1．T．の分解に依り生じた12が酸化剤とし て反応を促進すると云うb（82）叉12とアルカリから生ずる次亜ヨード酸が酸化剤であるとの説も

ある。（80）更にヂヨードチロシンのアミノ基置換体に於てもサイロキシン生成が好収量で報告さ        ノ れた。N一アセチル体から7％の収量でN−Ac−Thyroxineが作られN−Ac−D．1．T．−Gultamine菖是

からは36％の収量でN−Ac−Thyrox血e−Gultamlne酸が得られた。（78）之に反しN−be⑭yl D．1．

T．よりは得られなかつた。Leucyl−Tyros：nを22時間，37℃， PH 8．5で4原子【2にて26％

の収量を得るのに対して、Glycyl Tyros血， tyrosylglycln， Glycy1−ty］rocy1−glycinよりは同一条

件ではサイロキシソは生成しない。（83）この場合アミノ酸のベプチド配列がサイロ干シソペブチ

ド生成に影響する事が分る。遊離アミノ酸よりの生成PHは前記の通リユ0．0であるに反しペプチ ド型チロシンよりのOptimum PHは7．5である。生体内サイロキシン生成の生理的な条件下に

〔PH 7．5，37°C〕殆んど等しい事は誠に意味深v・。抗甲状腺物質Th三〇uraci1は分解に依り生じた ヨードをヨウ化物に還元し、サイロキシン生成を阻害する。 （84）

  生体内サイロキシン生成のメカニズム

 Fmkは甲状腺の加水分解申にM．1．T．を認め（85）α1aikoffもRadioact五ve II」tをマウスに 注射すると数時間後に甲状腺にヨードが蓄積され、その型はM．1．T．，D．1．T， Thyroxineとして定 量された。（86）（87）、注射後15分では投与ヨードの82．7％がD．1．T．12．5％がThynoxine中に 見出される事がペーパークロマトグラフイーで判つた。5時間後では7ユ．4％i29％とサイロキ

シン量が増加して来る。更にRocheは1131を含んだ甲状腺をトリプシンで加水分解しペーパー クロマトグラフィーで三者が同量生ずることを示した。（88）艮1〕ち生成機構はチロシソからD．1．

T．の第1反応D．1．T．よリサイロキシンの生成（第皿反応）の二段階よりなる。第∬反応は生体外 反応でも既述の如くよく説明し得る。第1反応のチロシンのヨード化が甲状腺内で如何に行われる かが問題である。チロシンがD．1．T．になるためにはヨードイオンは次亜沃素酸に酸化されねばな らない。がこの反応は甲状腺のみに特有であるから酵素反応と思われる。甲状腺内にはcyt㏄hro−

moxydase， Perox三dase， Xanth；nox三daseの如き酸化酵素系により先ずヨードィオンがヨードとな

るのであらう。又甲状腺がMn静を保留する能力がある事は酵素系の存在を示す。（89）この沃素

      ．

酸化物がチロシソのヨード化を行う。抗甲状腺物質は沃化物の酸化を防害する為である。叉甲状腺 中のチロシンペプチドの長さもサイロキシン生成に重要な因子であらう。 （83）カゼイソ、イソシ ニリソ、ツエィンのヨード化によるとチロシンの一部分だけがサイロキシンとなり大部分はD．1．Tウ として存在する．蛋白内部構造がサイロキシン生成に何等かの関係がある（69）事は充分想像され 得る。こ人に面白いのぱ蛋白にチロシソを添加したヨード化でありサイロキシン生成量の増加が見 られる。（90）二分子のD．LT．，よりサイロキシンの生成（第兀反応）は酸化的であるが然し酵 素反応であるか否かは決定されなV㍉

Prepalation Iodoovalburnin

IodoserumalbUmin

Iodo⑨e㎜globulin

Iodothy1て）globulin 工odOCasei11

       TABLE． r．

  Iodine Content

ご 

       セ コ     ベノへ         コ

A．   B．   C．

7．55    5．12    4，91

8．96     6．73     6．70

8．30    6．64     − 6．ユ4    4．88    4．96 7．51    7．51    7．51

TAB工E∬

Nit・・9・・一〃C。，6。。．1

   ｛：1    ｝：2    0：2

  E絶ct of progressive iodbation and high temperature incubation on Thyroidal Act ivityof Iodinated

Protei

Series No、

I  Iodinate∂

 casein

旺  Iodhlated

 soy bean

 prote⑩

P「epa−

ration

 1  2  3  4  5  6  1  2  3  4  5  6

Iodine

added

perlOO gprote一

㎞e

（9）

 7．5  t2．5

 丘9．0

 25．0  32．5  38．0  6．O  H．5  17．5  23．5  30．0  36．0

Iodine

added

pe「

mole

tyrOSlne

（atoms）

 1．89  3．16  4．80  6．31

 8．21

 9．60  2．03  3．88  6．35  8．95

10．14 12．17

    Iod血e     colnbmed Iodine peτmole

combined tyrosine Thyrxoine Todpole

per cent

11

93 55 19 ω

13

457889

コ       コ   コ       コ

21

20

15 51

78⑳

356677

お   タ   ロ   コ   コ   コ

（atoms） content     Per cent

 LO8     0、67

 1：59      1．31

 2．06     L85

 2．29     1．72  2．38     1．35  2．54   1．04

 1．12

 4L85

 2．22  2．35

 2．70  2．85

    pe江ent

responses thyroxine per cent response

229686

コ   お  ぶ     

コ   ロ

674︑114

1n∠百︶21

259796 122 4．12721

ロ   ぶ   ひ   コ   コ   コ

4．17 5．83

8．50

5．07

3．42 2．40 3，82

5．07

5．29 2．92 2．35 2．32

P115115 5にノー15

祈P−the per cent probability that the diffetence from the preceding member of the series is due tσ

 chance variation．

      TABLE II

 Yield of Thyroxine in the Iodination of Prote垣s and Pepsin−lnduced Peptons Treated by the Method

of Rehleke a Turner（act ion of 6 atorns I per molecule of thyroxine）

P丈oduct studied

Casein Fibro血

Insulm

Thyroglobulin Zein

Ca8ein peptone

Case加peptone

Initial tロ。s血e

content  （％）

  A

 7．20

 12．00  12．20

 3．30  5．84  i．07  2．70

Thymxine cont頭t

after iodination（％）

   B

  I．65   0．40   1．35   0．68

  L61

  0．04   0．14

  oo O l

．

×  9376572

＆ 旦A2え緩麦

64

∋

勾 め め の 旬 め

︵︵︵︵︵︵︵︵︵ooooOooo＠oロ＠＠＠eロρe＠＠OOOG臼O 助 のり勾刃め男旬η旬助旬り勾刃のつ旬り旬男のり勾刃∋刃

       〔文    献〕

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〃   ：

  〃   ：

RocheJ．：

Li，C．H．：

Feπobe，J．W．：

伊藤四十＝：．水谷 石川、藤田

Herriott．，RM．：

Hraenke1−Conrat，H．：

Walti，A、：

Sizer，1． W．：

Alderton，G．：

Fraenkel−Conrat，H．：

Anson，M工．：

Adant，M．：

Haurowitz，F．：

Pressmann．：

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