原発性 肺 癌切除例 性 関す 研究 け 肺 癌 細胞 腫瘍内多様

6 0 0 金 沢 大 学 十 全 医学 会 雑 誌 第1 0 4巻 第5号 6 0 0 ^‑6 1 0 (1 9 95)

原 発性肺癌 切 除例^におけ^る肺癌細胞 ^の腫 瘍 内多様性^に 関す^る研 究

一 増殖 細 胞 核 抗 原と核 D N A 量^の二 重 染 色^によ る同 時 定 量 的解析 ^‑

金 沢大 学 医 学 部 外 科 学第 ^一講 座 (主任^:渡 辺 洋 宇 教 授)

森 田 克 哉

原 発 性 肺 癌^の細 胞 増殖 能を客観 的^に評 価し, 腫 瘍 内 多様 性 (hete r oge n eit y) を検 索 すること を 目的と し て,切 除 肺 癌 材 料

につい て増 殖細 胞 核 抗 原 (p^{r o}life r atim g ^{c e}11 n u cle a r a nti_ge n,P C N A) と核 D N A 量を二重 染色^にて同時 定 量 的^に解 析^{し た.} 手 術 的に採 取さ れ た原 発性 肺 癌 症 例9 6例^の新 鮮 切 除 標 本^の最 大割 面で複 数 部 位^{サ ン}プ^ルを採 取し て細 胞を単 離 後^{フロ ー サ}イト メ ^ー タ ^ーの試料と し, これ^に抗 P C N A 抗 体 (P C l O) を反 応させた後, 蛍 光イ ソ チ オ シ アネ ^ー ト(flu o r e s c ein is othio cya n ate,

F I T C) 標 識^二次 抗 体 (^{F 3 1 3}), よう化^{プロ ビジ ウムを}加^え, P C N A と核^{D N A の}同 時^二重 蛍光 染色を施^し, フ^{ロ ー}サイ ト^{メ ー} タ ^ーで解析した^. D N A 指 標 (^{D N A inde x,D I})⁼1^.0 の GoGlの細 胞 群を二倍 体 (d iploid) 細 胞 群と し, DI ≧1^.1 の G｡Gl の細 胞 群 を異 数 倍体 (^{a n e u}ploid) 細 胞 群と し, そ れぞれ^の細 胞 群におい てもP C N A 標 識 率 (^{P C N A labelin}ginde x, P C N A LI)を算 出し た^. 異 数倍 体 細 胞 群^{の P C N A L I}(^{4 0.4 ±22.7 %}) ほ^二倍 体 細 胞 群^{の P C N A L I}(^{1 5.}9 ±1 1^.2 %) ^に比^べ有 意^に高かった(p <0^.0 5)^, 異 数倍 体細 胞 群^において D I と P C N A L I と^にほ相 関を認め な かっ た^. 腺 病で ほ異 数 倍 体 細 胞 群^の占め る割 合が高 くな るに つ

れ て, 測 定^{サ ンプル の P C N A L I が}高く^{な る}傾 向^を認^{め た. P C N A LI は}腺 病^{で は}腫 瘍 中心部と辺 綾 部と で差を認め な か った が, 扁 平上皮 癌で は腫 瘍 辺 綾 部^で有 意^に高値を 示 し た(p <0^.0 5)^. 核D N A 量^の評価で は, 1 症 例か ら測 定^サンプル数が少な^い ほど D N A ^二倍 体 と 判定される割 合が多か った. 性 別, 年齢, 術 後病 期∴組織 塾, 分 化 度^{と P C N A L I の}検 討^でほいず れ も 有 意 差を認め な か った^. 扁 平上皮 癌^では腫 瘍 径と P C N A LI と ほ 正の相 関を認め た が, 腹 痛で は腫 瘍 径^との相 関は認め な か っ

た^. リン パ節 転 移^の有無と P C N A LI の検 討^では有 意 差を認め な か った が, 腫 瘍 径が小さくか^つ P C N A L I が高 値^のも^の, す なわ ち発 癌^{か ら}診 断^{ま での}期 間^が短^いと考え ら れ るも^{の でほ リン パ}節 転 移を認め な か った. 非 小 細 胞肺 癌^の治 癒 切 除 例に にお い て予 後^との関 連^を検 討する と, P C N A LI が高 値^のも^のほ低 値^のも^{の に}比し予 後不良^の傾 向を認め たr^{. D N A 異 数 倍 体パ ター}

ンを 示 したも^のは D N A 二倍 体^{パ ター} ンを 示 したも^{の に}比し有 意^に予後^不良であ^り(p< 0^.0 5), さ らに D N A 異 数 倍 体^{パ ター ン} を示^{し た}も^{の の}うち P C N A L I が高値^のも^のほ低 値^のも^{の に}比し有 意^に予後不良であった(p< 0^.0 5)^. 原 発性 肺 癌^の細 胞 増 殖 能 お よ び核D N A 量^の評価^に際して は腫 瘍 内多 様 性^によ る影響を最 小 限^にする た め^に腫 瘍^の最 大 割 面か ら検体を採 取 する^こと が 妥 当^と思^{わ れ た. P C N A L I は}腫 瘍 増殖^の動 的 状 態^を反 映 す^{る と}考え られ, 癌^のあ^る時 点^{で の}進 行 度を表 す 原 発腫 瘍, 所 属リ^ン

パ節, 遠 隔 転 移 (^{T‑Prim a r}y Tu mo r, N^‑Regio nal Lym ph Node s, M‑^{D ista nt M eta sta sis},T N M) 分 類と は独立 した予 後 因 子^であ る^こと が示 竣さ れ た.

K ey ^{w o r}ds lung ^{c an c e r,} flo w cy t^{o m e}try^, p^rOlife r ating ^{c e}ll n u clea r a ntlg^en,

C e11ula r D N A c onte nt, hete r og^enei_{t y}

原 発性 肺 癌症 例^は年^々増加^の傾 向^にあり, 男 性^では全 癌 死亡 中 第1位を占め るに至 っている^{1 〉}. しか し肺 癌^は発 見 時^にはす

でに進 行し ているものが多く^, 外 科 的 切 除, 化 学 療 法, 放 射線 療 法さ らにほ免疫 療 法な ど^の薬 学 的 治療が試み ら れ^{て い}る^にも 関^わらず, その予 後^{は 不}良^であ^る. 最 も 良好な成 績^が期 待され る Ⅰ期例でも, その5 年 生存 率は 6 0 ^〜7 0 % とけ^っし て満 足 す

べき成 贋で ほ な^{い2) 3). こ}れは腫 瘍^の大 き^さ, リン パ節 転 移 有 無一

他臓 器 転 移^の有無^が病 親 分頼^の主 な 因 子と なっ て お り^▲), 同 ^一 病 期^の中にも 細胞 生 物 学 的に ほ多 様な腫 瘍をもつ症 例が含ま れ

て^いる^ことによ る と考え ら れ る^{5 ).}

こ のた め最 近 肺 癌^の病 態や予 後と, 腫 瘍^を構 成 する癌細 胞 個^々の悪 性 度^との関 係を検 討^{し た}報 告^が多 くみ ら れ る^{6 ト 1 4 ).} 肺 癌^の生物 学 的 悪 性 度^の指 標と し て, 核 D N A や増 殖 細 胞 核 抗 原, ブロモデ オ キ^シウリジン_, K ト6 7 な どの各 種 増 殖 関 連 因 子 な ど が注 目さ れ て^いる^. し か し, 肺 癌ほ他^の臓 器 癌^に比^{べ て}腫 瘍 細胞^の腫 瘍 内多 様 性(hete r oge n eit y)が著し^い癌である^. 従^っ て そ れ らの臨 床 的 意 義^{につ い て は}様^々 な結 果^が報 告さ れてお

り, ま た免 疫 組 織 染 色^の評 価 方 法な どの問題が存 在し, いまだ

一定の見解^が得^{ら れ ていない.}

本 研究で は肺 癌 新 鮮 切 除 標本^を対 象^{に フロ ーサイト メ ト リ ー} 平 成7 年⁹ 月5 日受 付, 平 成⁷ 年⁹ 月^{27 日}受 理

A b br e viatio n s : B S A , bovi n e ser u m alubumi n; DI, D N A inde x; F C M _, flo w cy t^{o m e}try ; FI T C, flu o r e s cein

is othio cy^{a n a}te; L I, 1abeling ind ex; P B S, phop^sphate^‑buffer ed s aline;∵P C N A, prOlife rating c ell nucle a r a nti_ge n ; Pl, p^{r O}pidiu m iodide ; T N M , T ^‑Prim a ry T u m or, N ^‑Regi ^{o n al L}y^m ph N ode s, M ^‑Dista nt M eta sta sis

を用^いて核D N A 屋と腫 瘍 増 殖能^の指 標である増 殖細 胞 核 抗 原 (pr olife r ating ^{c e}lln u cle a ra ntige n･P C N A) ^{の 二}重 染 色^によ る同 時定 量 的解 析^を行^い, 腫 瘍 内多 様性^の有 無^に影 響^{さ れ ない}腫 瘍 増殖 能^と核 D N A 量との関 連評 帆 お よ び従 来^の免 疫観 織 染 色 で は困 難^で あ^{っ た P C N A} 標 識 率 (^{P C N A labelin}g inde x,

P C N A LI) ^の客 観 的 評 価を行った^. さ ら^に得ら れ た結 果と腫 瘍 内 多様性^との関 係や臨床 病理学 的 因 子と^の関連^につい て検討し た^.

対 象 お^よび 方 法

l ^. 対 象

1 9 9 2年^{1 0}月^{か ら1 9 9 4}年3月ま で^に金 沢 大 学 医学 部 第 ^一外 科で 切除された原発 性 肺 癌 症 例^のう ち新 鮮 標 本^での検 討が 可能^で あ^{った9 6}例を対 象と し た^. 年 齢は4 0 ^〜8 0才 ( 平 均6 5^.6才), 性 別 は男性6 8例, 女性^{2 8}例^であ^った. 病理組 織型 分類^{で ほ}1 腺 病⁴⁶ イ札 扁 平^上皮癌3 8例, 小 細 胞 癌⁸ 例, 大 槻 胸 痛4 例であった^.

組織分 類, 手 術所 見 記 載 法^t 病期 分 類 ( 術 後 病 期) は 日本 肺 癌 学 会取り扱^い規約^5)によった^. 対 照 群 (正常 肺) ^{と して}, 対象 群^の 切除肺^{か ら}任 意^に抽 出した 1 0例^の非 癌正常 肺 部 分を 用いた^.

Ⅰ^. 方 法

1 ^. 核D N A 量と P C N A の同時^二重 蛍 光染 色

摘 出^した手 術 標本^の最 大 割 面^で, 約3m m 角^の大 きさで腫 瘍 中心部と辺 綾 部^に分 け複 数 部 位 (^{2 〜1 0}個! 平 均^5.3個) か ら材 料を採取した. 材 料^の採 取^にあたって は 血球 成 分 等^の正常 細 胞 混入 を でき^る限り少なく す^{る た め}, 採 取^{し た}腫 瘍 塊^{を リン}酸 緩 衝食 塩 水 (pho sphate‑ ^{buffe r ed s alin e,P B S) で十 分に洗 浄し,}

ま た採取 組 織 周 囲^に付着 す^る結 合 組織を取り除 き上座 瘍 細胞^の 実質 部 分を確 実^に取り出すよ うにし た. 得ら れ た材 料^ほ直^ちに 眼科 用 鋏^{で ペ ー} ス ト状^に細 切し, 7 0 % ^エ タ ノ ^ー ル( 和 光, 大 阪) ^{で2 4}時 間 以^上固 定^{し た.} そ^の後⁴恥 ^{の ナイロ ン メ ッ シ ュ}

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(^{N B C 工}業! 大 阪) を通 し 単離 遊 離細 胞^を得^{た. こ}れを 4 ℃ P B S にて 2 回洗浄 後, 4 ℃ 0^.2 % ウ^シ血清^{ア ル}ブ^ミン(^{bo vin e}

s e r u m alubu mi n.B S A) ( 和 光) 加 P B S で遠心洗 浄し,0^.5 % トウ

ィ ^{ー ン}2 0(^{Tw e e n 2 0}) ( Sig^{m a,} St. Lo uis, U S A),0.5 % B S A ,

1 0 % 筋 注^ヒトγグ^ロブ リソ (グ^ロ プ リン ^ー ミド リ) (^ミド リ十 字, 大 阪) 加P B S 2 5 0F^Ll に浮 遊^{さ せ}, 5分 間 放 置後, 0.5 % トゥ

イ ^{q ソ}2 0,0^.5 % B S A ,1 0 % 筋 注^ヒトT グ^ロ プ リ^ン加 ^{P B S で} 2 0倍^に希 釈^{し た}抗^{P C N A マウス I}gG 抗 体 (P C l O) (D A K O,

G l^{o str u}p^, De n m a rk) ^{1 0 0}F^Ll を加え, 混 和^{. 4 ℃}, 6 0分 間 放 置^し た^. 0^.2 % B S A 加 P B S で遠心洗 浄し. 0^.5 % トゥイ ^{ー ソ}2 0,

0.5 % B S A,1 0 % 筋 注^ヒトT グ^ロ ブ リン加P B S 2 5 0F^Ll に再 浮遊 さ せ, 5分 間放 置 後, 0^.5 % トゥイ ^{ー ソ}2 0, 0^.5 % B S A,1 0 % 筋 注^ヒトγグ^ロプ リン加^{P B S で5 0}倍に希 釈し た蛍 光イソ チオシ アネ ^ー ト(^flu o r e s c ein is oth io cy^{a n a}te,F I T C) 標 識 ^二次 抗 体 (F 3 1 3) (D A K O) 1 0 0f^Ll を加え, 混 和, 4 ℃, 3 0 分 間 放 置,

P B S で洗 浄 後, よ う化^{プロ ビジ ウム} (pr opid iu m iodide, PI) (Ho e chst_,Fr a nk fu rt_,Ge r m a ny) (1 0J 唱/^ml)/ ^{リ ボヌ ク レ ア ー ゼA} (^{S i}gm a) (^{2 0 0}F^Lg/^ml) ^を加え, 室温で 1 時 間 放 置し, 4 ℃ で遮 光

し て 1 時 間以 内^{に フロ ー サイ トメ 〜 タ ー}(^{E PI C S} P R O F I L E n,

C O U L T E R, M ia mi,U S A) ^にて測定し た^. 2 . フ^{ロ ー}サイ トメ ^ー タ ^ーによ る定 量的 解 析

核 D N A 量は D N A 指 標 (D N A inde x,DI) と し て相 対 的^に評 価^{し た. DI の}算定^には患者 末 梢^{血 か ら F ic olト Co n r a}y 法^にて分 離し た リ^{ン パ}球を内 部標 準 試 料と し^て検 体^{の 一}部^に混入 し,

D N A ヒス ト グ^ラム上 で検 体^の第1 ピ ^ー ク チ _ャ ンネル数 (fir st pe ak cha n n el n u mbe r) ^{を リン パ}球^の示 し た第^{1 ピー ク チ ャ ン} ネル数で除し た値を D I と し た^. G｡Gl ピ ^ー ク の変 動 係 数 (^{c o efficie ntofv a riatio n,C V}) が 8 % 以上^の症 例は測 定不能 例と して評 価 対 象 外と し, D I の差は 0^.1 を測 定 限 界^棚 と し た ^. D N A ^ヒス トグラム上^でD I が1^.1以上^の G｡Gl ピ^ー クが存 在 する

O

D N A c o nte nt(^{r elativ eP I in te n sit}y)

5 0

F ig^.1. Q u a ntitativ e e valu atio n of D N A ^{c o nte nt a n}d P C N A u sing do uble staining in tu mo r tis s u e by fIo w cy t^{o m e}try^･ T he c ut off lin e w a s s et ted at the cha n n n el n u mbe r of r elativ e FI T C inte n si_{t y} showi ng the P C N A po sitiv e c ells w e r e le s s tha n l % in the c o ntr oI study^. (^A) ^{Co ntr oI stud}y (^{a nti‑P C N A a ntibod}y ( ^‑))^･ (^B) ^{A ntトP C N A a}･^{ntibody (+)･} ̀F I T C, flu o r e s c ein

is othio cya n ate; P C N A , pr Olife r ating c e11 n u cle a r a ntige n;P I, pr Opidiu m iodide^･