肝 細 癌 胞 結 節 内 け 多様性 検 討

金沢 大学 十全 医^学会雑 誌 第1 0 3巻 第² 号 ^{36 9}‑^{3 8 0(1 9 94)}

肝細胞癌^の結節内^{に お}け^{る ゲ ノ ム D N A の}多様 性^の 検討

金沢 大 学 医 学 部 内科 学 第^一 講 座 (^主任^: 小 林健 ^一 教授) 大 阪大 学 細 胞 生 体^工学^{セ ン タ ー}

染 色 体 構 造機 能 研 究 分 野 ( 主任^: 松 原 謙^一 教 授)

佐 伯 理 恵 子

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進 行^{し た}肝 細 胞 癌 (肝 癌) ^の組 織 学 的 多 様性 (^{tu mo r hete r o}ge n ei_{t y}) ^における遺 伝^子の変 化を明ら か^にする た め^に, 申 分 化 型 肝 癌3 例^の同^一肝 癌 内^の結 節 内結 節^{と その周}囲の癌 組 織, さ ら^に2 例^の均^一 な高 分化 型 肝癌 内^の2部位よ り高 分子 D N A を抽 出^し, B 型 肝炎^{ウ イル スの}阻み込み を検 出 する^サザンブリッ ト^ハイ プ リ ダ イゼ ^ー シ _ョ ンと, D N A を 2 次 元的^に泳 動 する

こと に よ り ゲ^{ノ ム}構 造を解 析 す^{る リス ト リクシ} ョ ソ ラン ド^{マ ー} クゲノ ムス キ_ャ ン (^{r e strictio n la ndm a rk} ge n o mic s c a n ning,

R L G S) 法を 用^いて検討した^. サザン プ^ロ ッ ト^ハイ プリダ イゼ ^ー シ ョ ソで B 型肝 炎ウ イ^ルス D N A の組み込み を検 討し え た 1 例

では結 節 内結 節^{と その}周 囲^の癌 組 織^のB 型 肝 炎^{ウ イルス の}組み込^{みパ タ ー ソほ}同^一 で両者は単^{クロ ー} ン由 来^である事が示さ れ た^. R L G S パ タ ^{ー ン}の比 較^では, 均^一 な高分 化 肝 癌 内^の場 合, 離れ た 2部 位^{の R L G S パ タ ー ンに}差 異^ほ認^{め ら れ}ず,肝 癌 細 胞

の保 有す^{る ゲノ ム の不}均 ^一性^は証 明^{さ れ な かった. 一} 方, 申分 化 型 肝 癌^でほ, 非 癌部との比較^{でほ 2} 箇所^の癌 部^には明らかに

共 通し た ゲノ ム の変 化が認め られ た^こと^に加え, 結 節 内結 節と 周囲^の癌 阻織^の間^には症例に よ り 4 か ら1 4個^{のス ポットに}強 度

の差^が検 出^され, ゲノム D N A 構 造^の相違が認め られた^. し た が って結 節 内結 節と そ^の周 囲^の癌 阻 織^は単^{クロ ー ン}由 来^であり な が ら,

一 部^{の D N A} 構 造^に違^いを持^つ細 胞 集 団^である^こと が 示 さ れ, 肝癌^の紅 織 学 的多 様 性ほ遺 伝 子^の変 化^によ る多 段 階 的 な腫 瘍 進 展^の結果と考え ら れ た^.

K ey ^{w o r}ds 肝 細 胞癌, 結節内結 節, 多 段階発癌, R L G S 法

臨 床^上問題^{と な る}痛^が形 成^{さ れ る まで にほ イ ニ シ エ ー シ ョ}

ン

, プ^{ロ モ ー シ} ョ ン

, プ^ログ^レッ シ ョソ と^いっ た多数^の段 階を

経^{ること が}必要である と さ れ て^いる^{‑ ) 2).} 近 年, 多 段 階 発 癌^にお ける が ん遺 伝子 や が ん抑 制 遺伝 子な ど^の役 割が 同定^{さ れ}分子生 物 学 的 異 常^の蓄 積が癌^の進 展, 増 悪^に大き く 関 与し て^いる^こと が明ら か と なっ てき^{た3 卜 ら).} 肝 細 胞 癌 ( 肝 癌) ^においても 染 色 体

欠 失^{6 卜 8)}や p5 3 遺 伝 子異 常^{)〜1 2 )} といった分子生物 学 的 異 常^が指

摘さ れて いるも^{の の}, 多 段 階 発 育^{の ステ ップ と}分子生物 学 的 異 常^の関連^につい てほ未だ 不明な点^が多 く 残さ れて い る^{1 3 )}.

進行し た肝 癌でほ 1 つ のが ん結 節^の中^に形態 学 的^に異な る^コ

ン パ ^ー トメ ン ト, 結 節 内 結 節 (^{n odule}‑ⁱⁿ‑^{n Odule}) ^が認^{め ら れ}

る^{1 4 )1 5 ). 一} つの肝 癌 内部^では結 節 内 結 節 もそ^の周 囲^の癌 組 織 も

元来 同 ^一細胞^{の クロ ー ナルな}増 生によ る細 胞 集 団^であること が 立証さ れてお り^{1 G) 1 7)}, こ の魁 織 学 的 多 様 性 (^{tu m o r hete r o}ge n ei‑

t y) ほ, 癌 結 節^の発 育^にともな^{い 一}部^の癌 細 胞が脱 分 化して新 た な細 胞 集 団(結 節 内結 節) ^を形 成 す^{る といっ た}多 段 階 的^な腫 瘍進 展を示し た結 果と して理解さ れて いる1 6) 1 8) 1 g)

. 多段 階進 展^は 本 来 同^{一 で}あ^った遺 伝子 が段 階 的^に変 化を蓄積した結 果^である と考え られて いる た め, 鼠 織 学 的 多 様 性^が多 段 階進 展^{に よ る}も

平 成⁵ 年^{1 2}月^{1 6 日}受付, 平 成6 年^{2 月3 日}受理 A b br e viatio n s : [^{α‑3 2P}] ^{d C T P}, [^{3 2P}]^{de o x}y^cy tidin e

のな らば^{一 つ}の肝癌 内^に存 在する形 態学 的^に異なった 2 部 位 間

には遺伝 子 構 造^の変 化が認め ら れ る^はずである^. し か し, これ ま でに肝 癌 同^一結 節 内^におけ^る組 織 学 的多 様 性^と遺 伝 子構 造^の 変 化を検討した報 告は少ない.

近 年 開発さ れ た ゲノム スキャ ^ニ ソ グ法であるレ ス トリク シ ョ ソラン ド^{マ ー} クゲ^{ノム ス}キャ ン(^{r e strictio nla ndm a rk} ge n o mic s c a n ning,R L G S) 法^{2 n 2 =は}制 限 酵 素^で切 断さ れ た ゲ^ノム D N A を 直接 末 端 標 識し, そ れ を高 分 解 能²次元電気 泳 動 法^で分 離 解 析 する と^いう方 法で,

一度^に全ゲノム中^の2 00 0 ^〜3 0 0 0箇 所( 全 ゲ ノム の数 %) という広^い範 囲^{にわ た り}極めて鋭 敏^に ゲノ ム

D N A 構 造^の差 異を検 出できる^こと が特 徴^であ^{る. R L G S} 法^が

ヒ ト痛^{のゲノム D N A} 構 造^の解 析^に応用 可能であること は既^に 立 証^{さ れてお り2 1 ),Na}g^ai ら^{2 2) 2 3)}によ る R L G S を 用いた肝 癌と そ の非 癌 部と を比 較し た検 討^では 両者^にゲノム構 造^の差 異が認め られ る^こと が報 告さ れ ている.

今回, 肝 癌^の組 織学 的多 様性^に伴う ゲ^ノム D N A 構造^の変 化 を検討 する 目的^で, 結 節 内 結節^{と その}周 囲^の癌 阻 織^における ゲ ノム構 造を R L G S 法を 用^いて解 析^{した. ま た},今^まで既 成^の方 法では遺伝 子 構 造^に差を検 出さ れ ていな^い微 小 高 分化 型 肝癌と

5 ^'‑tri_phosphate; [^a‑32P]^{d G T P,} [^32P]^{de oc}y g^{u a n o s}ine

5^'‑tri_pho sphate ; bp, ba s e pair; d CTP[^αS], 2^㌧de o xy^cy tidin e 5^'‑[^{a‑thio]tripho sphate; d d A T P[αS], 2 ',31‑}

dide o xy^aden o sin e 5^'‑[^α‑thio]^tripho sphat_{e ;} d d T T P[^αS], 2^',3^'→dide o xy th_ymi dine 5^'→[^α‑thio]^tripho sphate; dG T P[^aS],2^,‑de oxy g^{u a n o s}in e 5^'‑[^α‑thio] ^tripho sphate; D T T, dithiothr ei^tol;E D T A , eth_ylen edia min etetr aac etic