関す 研究 腫瘍増殖能 細 胞 肺癌 蛋白発現 原発性非小 け

原 発性 非 小細胞肺癌^{に お}ける p5 3 蛋 白発 現^{お よ}び 腫 瘍 増 殖 能 ^に 関 す ^る 研 究

金 沢 大学 医 学 部 外 科学 第 ^一講 座 (主任^: 渡 辺 洋 字 教 授)

家 接 健

原発 性 非 小 細 胞 肺 癌1 9 3症 例^におい て p5 3蛋 白^の発 現を^{モ ノ ク ロ ー} ナル抗 体( D O‑7) を 用い て検 出し, ま た腫 瘍^の増 殖 能 を反 映 する増 穂 細 胞 核 抗 原(Pr Olife r a ting c elI n u cle a ra ntige n.P C N A ) を同様に モ ノ ク^{ロ ー} ナ ル抗 体(P C l O) を 剛 ^､て標 識 率^を 算 出^L , 臨 床 的 背 景 因子 と^の相 関^{につい て}検 討L た^･ P5 3蛋 白 発 現 陽 性は1 9 3例 中97例_{(5 0 %}) ^に認^{め た. P C N A} 標 識率ほ1 9 3例 中▲1 7 6例^で測 定可能であり, 全 体で 3 8^･4 ±2 4･7 % (平均 値^±標 準 偏差) であ^った. p5 3 蛋 白 発 現陽 性 例^では,P C N A 標 識 率が 4 7･1±2 5･2 % と陰性 例^{の2 9･3 ±2 0･7 % に}比^べ有 意^に高かった (p <0^･0 0 5)^. p5 3 蛋 白 発 現 陽 性 率ほ, 男 性_{( 5 4}^.4 % )^. N ト 3 症 例 (6 3^･2堀L M l 例(6 9^･6 % ) ^で, そ れぞれ女 性( 3 7^･0 % ), N O( 43^･2 % ) ∴M O( 47^･7 % ) に比 較^し有 意^に 高^か っ た (p < 0 肪 p <0^.01,

p <0^･0 5)･ 病 期 別で は, p5 3 蛋 白 発 現 陽 性 率^{が l} 期^{41･0 %} , Ⅱ期5 2^.6 % , Ⅲ A 期5 3^.5乳, Ⅲ B 期8 7^.5 %, Ⅳ期 6 9^.6 % であ り･ ほぼ病 期^の進 行と ともi こ発 現 率が高く な ^った ^. ま た. T 因 子 別でほ, p5 3 蛋 白 発 現 陽 性 率^{が T l: 4 3.8 %}, T 2: 5 0.5 %,

T 3:4 8^･0 % ･ T 4: 9 1^･0 % であり, ほ ぼ T 因子^の進 行^{と と}も^に陽 性 率^が高 くな っ た^. P C N A 標 識 率ほ , 扁 平上 皮 癌で 4 3^･4 士2 6･1 % と腺 癌^{3 3･0 ±2 2･0 % に}比^べ有意^に高か った (p <0^･05 )^. 病 期 別^では, P C N A 標 識 率が Ⅰ期 ^{3 2.7土2 0.1 %} , Ⅱ期

49^･8土3 2^･2 % J Ⅲ A 期3 6^･l ±2 3^･6 %, Ⅲ B 期5 3^･9 ±2 1^･3 % . Ⅳ期5 3^･6 ±29^■4 % であ^り, ほぼ病 期^の進 行と とも^に標 識 率が高く なった･ N 困 子では, P C N A 標識 率^{が N O:3 4･6 ±2 2･7 附 こ}対^{L N l 〜3:4 5.}2 ±2 6^.8 % と有 意^に高かった (p <0^,0 5). M 国子で は, P C N A 標 識 率が M O‥3 6^･4±2 3^･5 % に対L M l:5 3^･6 ±2 9^･4 % と有 意^に高かっ た (p <0^.0 0 1)^. も^っとも 治療 予後 良好な Ⅰ期 9 2例^{につ い て の}検 討で は, P5 3 蛋 白 発現 陽 性 例^{の P C N A} 標 識 率^{は 3 8.7 土23.0 %} と陰 性 例の標 識 率^{2 8 A ±1 6.9 % に}比^べ有 意^に 高か っ た(p <0･0 5)^･ さ らi こ, Ⅰ期 症 例^のうち腺 病で ほt P C N A 標 識 率は p5 3 蛋 白 発 現 陽 性 例( 4 3^.9±2 1.3 % ) が陰 性 例 (2 6^･5士1 4^･2 % ) よ り有意^に高か っ た (p < 0^･0 1)^･ ま た, I 期 症 例に おい て, 術 前^の癌 胎 児 性 抗 原(^{c a r c}in o e mb_{ryo n}ic a n tige n,

C E A ) 値^の高^い症 例_{( > 5}ng/^ml) ^{は P C N A} 標 識 率^{が 3 8.1 士9.2 %} であり C E A 値が 正常^の症 例 (≦5ng/ml) ^の2 6^.7 ±1 8^.7 % に

比^べ有意^に高^か った(p < 0･0 5)^･ 次に転移^{リン パ}節20例^の検 討^では, 1 9例で原発 巣と転 移 巣^の p5 3 蛋 白 発 現^の有無^{が 一} 致し た^. P C N A 標 識 率は, 原 発 巣が 3 8^･4士2 3^･8 % に対^し転 移 巣^{では 5 4.0 土2 5 て % で}あり, 有 意^に高か った(p <0^.0 5 )^. 生存 率との相 関 を み る と, P5 3 蛋 白 発 現 陽性 例^は陰 性 例^に比^べ有意^に予 後不良であり (p <0^.01 ), 組 織 型別^でほ腺 病^におい て p5 3 蛋 白 発 現 陽 性 例が有意^に予 後不良であ^っ た (P< 0^･0 5)^, ま た, P C N A 標 識 率40 タほ 満^を低値 群, P C N A 標 識 率4 0% 以上 を高値 群と し た場 合

の生存 率^の検 討でほ, P C N A 標 識 率 高値 群^ほ, 低値 群^に比^べ有意^に予 後不良であ^っ た (p <0^,0 5)^{. こ}れ を組織 型別^にみ る と, 扁 平^上皮 痛^{におい て} P C N A 標識 率 高 値 群^が低値 群^に比^べ有意^に予後不良であった (p <0^.0 05)^. 1期^{におい て}も^{P C N A} 標 識 率 高 値群が低 値 群^に比^べ有 意^に予 後不良であり (p < 0･0 5), さ らに核^{D N A} 量を測定し核D N A 二倍 体 群お よ び D N A 異 数 倍 体 群を そ れぞれ P C N A 標 識 率 低 値 群, 高 値 群^に純 分し た結 A , D N A 異 数 倍 体群^において P C N A 標 識 率 高 値 群^が低値 群よ り 予後^不 良の傾 向を認め た (p ⁼0^･0 8)^･ 以上の結 果か ら, 原 発 性 非 小細 胞 肺 癌の p5 3 蛋白 発現 陽 性 例は腫 瘍 増 殖 能が高く, ま た, P5 3 蛋 白発 現 陽 性 軌 P C N A 標 識 率 高 値 群^の予後は 不良^であり予 後因 子 と な り う る と考え ら れ た^.

K ey ^{w o r}ds non^‑S m all c ell l_{u ng} can c er, im m un ohistochemi cal stainl ng, P 53 _pr otein,

p^rolife rating ^{c e}ll n u clear anti_gen, P^rOg ^{n OS}tic fa ctor

肺 癌^は比 較 的小 径であっても 発 見時^にほ, すでに リン パ節 あ るいは遠 隔 臓 器^{へ の}転 移^を認^{め る}場 合^が多^い. ま た, た と え手 術所 見, 病理組 織 学 的 所 見^{か ら}根 治 切 除さ れ た と考 えら れ る Ⅰ 期肺 癌であっ ても, 不良な 予後^{を 呈}する場 合^が少なくな^{い. こ} れ ほ, 臨 床で 剛 ^､ら れ る病 期 分類が必 ずしも予 後と相 関しな^い 場 合があること を意 味し ている. 病 期を決達 する因子 であ^る癌

の大 きさ, リン パ節 転 移^の有 無, 遠 隔 転移^の有 無^のみ で は説明 できな^い予後 因 子が他にあるものと推 測^{さ れ, その 一 つと して} 遺 伝子変異, 腫 瘍 増 殖 能や転 移 能な どの細 胞 生 物 学 的 特性^が重 要な意 義を有L て いるも^のと考え られ る. 著 者は▲ 肺癌^の分子 生 物 学レ ベ ルでの特 性^と臨 床経 過と^の相 関を解明^でき^{ないか と} 考え本 研究を行った^.

平 成⁵ 年^{5 月1 2 日}受付, 平成⁵ 年⁷ 月^{1 日}受 理

A b breviatibn s: Brd U , bro m odeoxy^{u r}idine ; C E A, C ar Cin o embry^{o n}ic a nti_gen ; D A B , 3, 3¹‑^{diaminobenzidine}

tetrahydr o chlo ride; L I∴1abeling inde x ; P B S , pho sphate^‑buffe r ed

'

s ali_{n e ;} P C N A , p^{r O}life r ating ^{c e}ll n uclea r a nti_ge n; 3 生率, 3 年生存率; 5 生 率, 5 年生 存率; 1 0生率, 1 0年生存率

肺 癌^の p5 3 蛋 白発 現と腫 瘍増 殖能 ^{49 3}

癌関 連 遺伝子 は癌 遺 伝子 と癌 抑 制 遺 伝子^に大別 され な か^で もp5 3 遺 伝^{子 は}癌 抑 制 遺 伝子^{の 一} つと して近 年 注目 さ れ^{て い} る^. p5 3 遺 伝子 はも^とも^と ▲ D N A 型 腫 瘍^{ウ イル ス で}あ^る S V 4 0 ^の T 抗 原(1^arg^e T a ntige n) と結 合 する^リン酸 蛋 白 質

p5 3 を^{コ ー} ドする遺 伝 子と して分 離さ れ^い21, 1 9 8 9年 頃か ら癌 抑 制 遺伝 子と して認 識さ れ る よ うにな り^3､多 く^の研究が な さ れて

き^{た. その}結 果, ヒ ト腫瘍^におい ても 最 も 高 頻 度^に異 常が認め ら れ る遺 伝子^であ^{ること が}分か ってきた^{帖 1 0 ゝ}. ま た肺 癌^におい て はよ フ ^{ロ ー} サイト メト リ^ー を 用^いた研 究で p5 3 遺 伝 子 異常^に ょ る p53 蛋 白 発現 例^は腫 瘍増 殖能が高^いと報 告さ れ^{I l}＼そ^{の こ} と が高^い転移 能や 予後不良 化^に関 与 する 可能性^がある と予 想^さ れ る. さ ら^に胃 癌^{1 2‑}, 乳 癌^{1 3､}等^で p5 3 蛋 白 発 現例^の予後は 不良 であった との報 告^{が な さ れて いる が} ト肺 癌^{に ついてこ のよ う な} 検討が な さ れ た報 告は極めて少な^い. 本 研 究は, 原 発 性 非 小細 胞 肺癌^の p5 3 蛋 白発 現 陽 性 率お よ び腫 瘍 増 穂 能^の指 標である 増 殖細 胞核 抗 原(pr olife r ating c ell n u cle a r a ntige n.P C N A ) の標 識 率を^{モ ノ クロ ー ナ ル}抗 体を 用いて評 価し, さ らiこ転 移^{リン パ} 節^{につい て}も染 色^を行^い, 病理覿 織 学 的 意 義, さ らには 予後 国 子 と な りうる か を検 討し た^.

対象お よ び方法

Ⅰ^. 対 象

1 9 7 8年¹ 月か ら1 9 8 9年1 2月まで に金沢大 学 医学 部 第^一 外科 学 教 室で外 科的 治 療を行っ た原 発 性 非 小 細 胞 肺癌 症 例^のう ち 1 9 3 例を対 象と し た^. 男 性1 4 7例, 女 性4 6例であり, 平 均 年 齢は 6 3.4 歳^であ^{っ た.} 肺 癌 取 扱^い規約^{仙 によ る}病 期 分 類^の内訳^は,

Ⅰ期1 0 0例, Ⅱ期1 9例, Ⅶ期5 1例( Ⅲ A 期4 3例, ⅢB 期8 例), Ⅳ 期2 3例であり, 組 織 型別 で は腺 病⁹鋸軋^, 扁平 上皮癌9 5例であっ

た.

[ ^. パ ラ フィ ン包 埋 ブ^ロッ ク の選 択

切除 標 本^は, 金沢大 学 医学 部 附 属 病 院 中 央 検査 部 病理部^にお

いて^パ ラフ ィ ン包嘩 さ れ保 存さ れて いるも^のを使用 し た^{. パ ラ}

フ ィ ン包埋 ブ^ロ ック は _, 腫 瘍が大 き^い症 例では腫 瘍 辺 綾 部^を選 択し た. ま た, 癌 転 移 陽性と診 断さ れ たリン パ節^{のパ ラ}フ ィ ン

包 唾ブ^ロ ックは, Ⅲ A 期症 例2 0例^の縦 隔 内^リン パ節を選 択し た^.

Ⅲ. p 5 3 蛋白に対 する免疫 組 織 染 色 法

パ ラフ ィ ン包 唾さ れ た癌 組 織, お よ び転 移 陽 性^リ ン パ節を 3/^ノm の厚^さに薄 切^し,0.0 2% ポリー^L‑^{リジンで スライ ドに付 着}

さ せ,1 0 0% キシ レ ンで5 分間, 3 回^の脱^{パ ラ}フ ィ ン を行^った 後,1 0 0% ,9 0% , 7 0% , 4 5% ^{のエチ ルア ル コ ー ル に て}各⁵ 分間 脱水 し, そ^の後2 0分 間 室温^{にて 0.3 %} 過 酸 化 水素 水^で内因性^ペ

ルオ キシダ ^ー ゼを阻 害し た. 次^に ,1 0% ^{ウ サ}ギ 正常血清(^{ニ チ}

レイ, 東 京) を用^{い てブロ} ッ キン グ を行な^い, リン酸 緩 衝 食 塩 水(pho sphate^‑buffe r ed s alin e, P B S ) ^にて洗 浄し, 抗 p5 3 蛋 白 抗 体(^{D O‑}7) ( No v o c a str a Labo r ato rie s Ltd.,Xe w c a stle,U K ) を 蒸 留 水^で5 0倍^に希 釈し, 4 ℃ で ^一 晩 反 応さ せ た ^. 続い て ,

P B S にて 5 分 間, 3 回洗 浄 後, ビ オチン標 識ウサギ抗^マウス

IgG + I_gA + IgM (H + L )( ^ニチレイ) を 用い て室 温^{にて 3 0}分 間反 応さ せ,P B S で 5 分 間, 3 回洗浄^し, ペ ルオ キシダ ^岬 ゼ標 識^ス

トレプ トア ピ ジン ( ^ニチレイ) ^で室 温^{にて3 0}分 間反 応^{さ せ た.} P B S で 5 釧 乳 3 回洗 浄 後, 四塩 酸 ^{3,31‑ ジア ミ ノベ ン ジン} (3,3^l‑diami n obe n zid in etetr ahydr o ch lo ride,D A B)( 協 和^メデッ ク

ス

, 東 京) で室 温^にて顕微 鏡^で発 色 状 態を確 認しな が ら約³分

問^の反 応で発色さ せ, メチル グリ ^ー ン液( M e r ck^. Da r m s t adt.

Ge r m a ny) ^{に て}核 染色を行った. 最 後^に, 1 0 0% ^キシ レ ンに よ

り, 5 分 間, 3 回の透 徹を行^った.

Ⅳ^. p53 蛋 白 発 現の検 出

免疫 染 色^を行^{ったス ライ ドガ ラスを}顕 微鏡^{に て}全 視 野^を観 察 L , P5 3 蛋白 発 現の有無^を判 定し た^. p5 3 蛋 白 発 現 陽 性^と判 断 し た核は, ほ ぼ均^{一 に}褐 色^に染 色さ れ, 染 色^の漉 淡^の違^いを認 め た が, 定性 的^に判定 し 観 察^{し た}癌組 織^の核^{が 一} 部分 で も染 色さ れ ていた場 合をp5 3 蛋白 発 現 陽 性 例と判 定L た^.

V . PC N A 免 疫 組織 染色 法

パ ラフ ィ ン包唾 さ れ た癌 組 織, お よ び転 移 陽 性^{リン パ}節を 3/^Jm の厚さ^に薄 切し, 0^.0 2 % ポ リ^ーL‑^{リジン でス ライ ドに付 着}

させ, 1 00% ^{キシ レンで 5} 分間, 3 回^の脱^{パ ラフ} ィ ンを行った 後, 川0 % ^,9 0 %,70 %^.45 % の^エチ ル ア ル コ ^ー ルに て各5分 間 脱 水L , そ^の後^{2 0}分 間室 温にて 0.3 % 過酸 化^水素 水^で内 因性^{ペ ル}

オキシ ダ^ー ゼを阻 害し た^. 次^に, 1 0% ウ^サギ 正常血清 (^{ニチ レ} イ) を 用^{い て}ブ ^ロ ッキン グ を行^い , P B S に て 洗 浄し, 抗 P C N A ^マウス IgG 抗体(P C l O) ( D^ako.G lo s t r up^.De n m a rk) を 蒸 留 水で2 0倍に希 釈^し, 4 ℃で ^一 晩反 応させた^. P B S に て 5 分 間, 3 回洗 浄 後, ビ オ チ ン標識^{ウ サ}ギ抗^{マ ウスI}gG +IgA + IgM ( H⁺ L ) (^ニ チレイ) を 用い て室 温^にて3 0分間 反 応さ せ P B S で 5 分間, 3 回洗 浄し, ペ ルオ キシ ダ ^ーゼ標 識^{ス ト}レプト ア ビジン

(^ニチ レイ) で室 温^{に て3 0}分 間 反応^{さ せ た. P B S で 5} 分 間, 3 回 洗 浄 後, D A B で室 温に て, 顕 微 鏡で発 色状 態を確 認し な が ら

約3 分 間^の反 応で発色さ せ, メチル グ^{リ ー} ン液( M e r ck) に て核

染色を行^{っ た.} 最 後^に,1 0 0% ^{キシ レ ンに}よ り^, 5分 間, 3 回^の 透 徹を行^っ た^.

11. PC N^A 標 識 率^の算 出

P C N A 免 疫 組織 染 色 陽性^の核を定 性 的^に判定し た^. 核は均^d あるいは小 斑 点 状^に染 色さ れ た . P C N A 標 識 率(P C N A labeling inde x,P C N A‑^{L I) ほ ト顕 微 鏡下に腫 瘍辺綾 部の任 意の} 視野を選び, 癌 細 胞 約1 0 0 0個^に対す る陽性 桟 敷^の割 合( % ) を算 出 L た. ま た, 陽 性率⁵タ_る未満^の場 合^は染色^不良^と判定^L, 検 討か ら除 外し た^.

Ⅵ^. フ ロ ^ーサ イ ト メ ト リ^ー に よ る核 D N A 量の測 定 癌 組 織^を包^{増 し たパ ラフ}ィ ン ブ^ロ ッ クを 5帥^{m の}厚さ^に 8 ^〜 1 0枚 切り, キシ レ ンに て1 時 間, 2 Lロ｣の脱^パラフ ィ ンを行^った

後, 1 0 0% , 9 6タ石, 7 0% , 50% の^エ チル ア ル コ ^ー ルに て各3 0 分,

脱水 を行っ た. 次^に蒸 留 水で2時 間^{の再 水}和 後, 0^.2⁵% ト リプ

シ ン( Sigm a^.St^.Louis.し^'.S^.A ) を含む^クエ ン酸 緩 衝 液(³m M ク^エン酸^{三 ナ ト リ ウム} (和 光)^,0.1^q6 ノ ^ニ デ

ッ ト P‑^{4 0 (S}i g ^{m a})^, 1^.5m M ^{ス ペ ルミン}四塩 酸 塩( Sigm a)^.0^.5m M ト リス ア ミ ノメ タ ン (S igm a),PH 7^.6 0) 3ml に て ^疇 晩, 3 7⁰C の温度^{下に て}保温 L た^. 次^に4恥m の ナイ ^{ロ ン メ} ッシ ュ で濾 過, 遠心 を行^い,̲^土清 除 去 後, 遊離 細 胞を作成し た. 次^に, 細 胞 浮 遊 液2 0恥=^こ対し 溶 液 A (ト リプシ ン( D if k^o,Detr oit,U .S.A.) 1 5^m g^. ク^エ ン酸 緩 衝 液5 00ml) l^.5ml を加え,1 0分 間 水冷し た後, 溶液B (^{ト リ}プ

シ ン イ ン ヒ ビ タ ^ー (S igm a) 2 5 0^m g^, リボ ヌ ク レ ア ^M ゼ A ( S ig^{m a}) 5 0^mg^, ク ^エン酸 緩 衝液^{5 0 0ml) 1.5ml を 加 え.1 0}分 間 水

冷L た^. さ ら^に, 溶 液C( ヨウ化プロ ビ ジ ウム2 08皿g, ス ペル ミ ン四塩 酸 塩^{5 8 0m}g, ク^エ ン酸緩 衝 液^{5 0 0ml})^{1.5r n}l を 加 え,1 0分 間水 冷し, 核 D N A の染 色を行^った^. 核 D N A 畳は, フロ ^ーサ イ ト^メ ト リ ^ー F A C S^‑C A N (^{Be cto n‑D ickin s o n, Ne w} J^{er s e}y^, U.S.A.) を 用^いて, 約2 0,0 0 0個の細 胞を測 定し,D N A ^ヒス トグ