博 士 （ 医 学 ） 高 橋 弘 昌
学 位 論 文 題 名
Pyrimidine nucleoside phosphorylase‑activity and biological characteristics of breast cancer
（ 乳 癌 組 織 内PyNPase活 性 と 乳 癌 の生 物 学的 特 性 ）
学 位 論文 内 容 の 要旨
I緒 言
癌の生物 学的特性 の解明は 単に予後因 子との関 連のみで はなく、 診断治療 上重要な意義 を持っている。
乳癌の術 後成績を 予測する 予後因子と しては， 腫癖割面 最大径と 組織学的 リンバ節転移 の有無が 最も重要 なものと されている 。しかし 、これら の因子は 腫癌の進 行度を示すが、
腫瘍自体 の生物学 的性格を 反映するも のではな ぃので、 これらの 因子のみ により予後を推 定するには無理がある。Pyrimidine nucleoside phosphorylase（PyNPase）は5 ‑deoxy−5―f luorouridine（5 −DFUR）を5ーfluorouracil（5−FU）に変換する酵素であり，腫癌組織内では正 常組織中 よりもそ の活性が 高いことが 知られて いる。また最近PyNPaseが癌の遠隔転移と関 係するPlatelet―derived endothelial cell growth factor（PD−ECGF）と同一のものである ことが判 明した。 しかし、 悪性腫癌組 織内PyNPase活性が腫癌の生物学的性格や予後といか なる関係にあるかは明らかでなぃ。
本研究で は、乳癌 の生物学 的特性を表 わすとさ れている 諸因子と の関係を 検討し、PyNp aseの予後因子としての特徴を検索した。
II材料およぴ方法
対 譲は，StagelIの乳癌138例であり、年齢は28〜75才、55．2土10．0才（平均土SD）であ っ た。外科 手術によ り乳房切 除後速や かに腫瘍組 織を採取 し，ー20℃で凍結保存した。乳 癌組織内PyNPase活性、estrogen receptor（ER）、progesterone receptor（PgR）、epiderma l growth factor receptor（EGFR）、DNA ploidy pattern，proliferating cell nuclear an tigen（PCNA）、c−erbB―2gene amplificationにっいて随時以下の方法で測定した。また一 部は新鮮材料として用いた。
l.PyNPase活 性の測定 ：検体を 処理して 得たPyNpaseの粗 酵素と一定量の5 ‑DFURを反応さ せて生成された5FU量をHPLCにて測定し、PyNPase活性とした。
2.ERの 測定：Dextran Coated Charcoal（DCC）法によ り行った。ER値が5fmol/mg protein 以上を示す検体をER陽性とした。
3.PgRの測定：PgRモノクロ ナール抗 体によるEIAキットを用 いた。PgR値 が10fmol/mg pro tein以上を示す検体をPgR陽性とした。
4．EGFRの 測 定 ：（125）Iを用 いたcompetitive binding assayに より行っ た。EGFR値が 5fmol/mg protein以上を示す検体をEGFR陽性とした。
5.DNA ploidy patternの測定；DNAヒストグラムはFlowcytometry（Becton Dickinson社）
を用いて 測定し、 その解析は 単一のGO/G1ピ ークを有 するもの をdiploidとし、これか ら ず れ た も の 、 一 つ 以 上 のGO/G1ピ ー ク を 有 す る も の をaneuploidと し た 。 6.PCNA陽性細胞 の解析：FITC標識抗PCNA抗体 を使用し、FCMにより分析した。陽性細胞率 が10:g以上をPCNA陽性乳癌 とした。
7.cーerbBー2遺伝 子増幅の測定：スロッ卜ブロットハイブリダイゼーション法により行っ た。増幅 のあるも のをc―erbB−2遺 伝子増幅 陽性乳癌 とした。
測 定 値 はMEAN土SDで 示 し た 。 有 意 差 検 定 に はMann‑WhitneyUtestを 用 い た 。
m結 果
1.138症例 の 乳癌 組 織 内のPyNPase活性 は4.2〜626.0ロgFU/mg Protein/hrで 、平均は 207．3土122．4ugFU/mg Protein/hrであった。
2．腫瘍割面最大径とPyNPase活性の間に有意な関係はなかった。
3． 充 実 腺 管 癌 が 他 の 組織 型 よ りも 有 意に 高 いPyNPase活 性 を示 し た （p〈0.01） 。 4． リ ン バ 節 転 移 度 と PyNPase活 性 の 間 に 有 意 な 関 係 を 認 め な か っ た 。 5.ER，PgRとも に 陰 性例 が 陽 性例 よ り有 意 に 高いPyNPase活 性を示した （p〈0.05）。
6.EGFR、DNA ploidy pattern、PCNAとPyNPase活性との 間に有意 を関係は なかった 。 7.c−erbB−Z遺伝子増幅例は、非増幅例よりも有意に高いPyNPase活性を示した（p<0.05）。
IV考 察
乳癌組 織内PyNPase活性 にっいて のこれまで の報告例は、種々の病期のものを一緒にした もので あり，測 定値に大 きな幅があ ったが、 本研究で は対象を 病期IIのみ に統一した。し たがって病期の差によるバイアスが除かれた値が測定された。
腫癌割 面最大径 ，組織学 的リンパ節 転移度は 腫癌の進 展度を直 接示す指 標であるが、本 研究の 結果ではPyNPase活性値と の間に関係 がなく、PyNpase活性はこ れらの腫瘍の進展度 を示す因子とは独立．したものであると考えられた。
充実腺 管癌でPyNPase活 性が高い ことの意義 は不明である。悪性度が高く，増殖性の強い 乳癌はERを欠く傾 向が強く 、ER陰性乳癌 はER陽性乳 癌に比ベ ，予後不 良である。本研究で は ，ER陰 性 例 が 陽 性 例 よ り もPyNPase活 性 が 高 く ，PyNPase活 性 が 癌 の 悪 性 度 を 反 映 してい ることが 示唆され た。PgRはERに比 べると悪 性度との相関は少ないとされるが、陰性 例が陽性例よりも商いPyNPase活性を示した。
EGFRが悪性 度の高い 乳癌でそ の増殖に何 らかの役 割を果た している 可能性が示されてい るが、EGFR値とPyNPase活性 値の関連 は明かでは なく，両者は独立した因子と考えられた。
DNA aneuploidyはdiploidyよりも悪性度が高いとされるが，両者のPyNP'ase活性に差を認 めなかった。
細胞増 殖能の指 標であるPCNA陽性細胞数 とPyNPase活性の関連はなく，両者は互いに独立 した因子と考えられた。
c―erbB−2遺伝子の増幅は乳癌の10〜30Xに認められ、増幅群の予後は不良であり、とくに りンバ 節転移陽 性例で予後の差が顕著であった。多変量解析ではc一erbBー2遺伝子の増幅は 腫瘍径 やりンパ 節転移の 程度どは独 立した因 子とされ ている。 本研究に より，乳癌組織内 PyNPase活性はc―erbB−2遺伝子増幅群に高く、両者の間に有意な関係が見られた。この結果 は，乳 癌組織内PyNPase活性が腫 癌径やりン バ節転移度とは独立した因子であることを支持 するものと考えられる。
V結 語
ヒト乳癌stage138 症例の組織を用いて乳癌組織内PyNPase 活性を測定し、検討した結果、
以下の結諭が得られた。
1 ．腫癌径やりンバ節転移度とは独立した因子である。
2.ER 、 PgR 、 c ― erbB ― 2 遺 伝 子 増 幅 の 有 無 と 有 意 な 関 係 を 有 す る 。 3 ．乳癌の生物学的特性をを表す新しい因子と考えられた。
一
学位論文審査の要旨 主査 教 授 細 川眞 澄男
副査 教 授 加 藤紘 之 副査 教 授 内 野純 ・ 学位 論文 題名
Pyrimidine nucleoside phosphorylase activity and biological characteristics of breast cancer （乳 癌組 織内 PyNPase 活性 と乳癌の生物学的特性）
乳 癌 の 術 後 成 績 を 予 測 す る 予 後 因 子 と し て は ，腫 瘍 剖 面最 大 径 と組 織 学 的ル ン バ 節 転移 の 有 無 が 最 も 重 要 な も の と さ れ て い る 。 し か し 、 これ ら の 因子 は 癌 の進 行 度 を示 す が 、 癌 細 胞 自 体 の 生 物 学 的 性 格 を 反 映 す る も の で は な い 。ま た 、 乳癌 細 胞 の悪 性 度 示す 予 後 因 子 と し て 、estrogen receptor（ER） 、progesterone receptor（PgR） ｀epidermal growth factor receptor（EGFR） 、DNA ploidy pattern、prolifer．ating cell nuclear antigen（PCNA） 、c‑erbB‑2 gene amplificationな ど が 報 告 さ れ て い る が 、 こ れ ら も 乳 癌 の 生 物 学 的 特 性 を 表 わ す 因 子 と し て は 十 分 で な い 。 一 方 、Pyrimidine nucleoside phosphorylase（PyNPase） は5．‑deoxy‑5‑fluorouridine（5．‑DFUR）を5‑fluoro uracil （5 ‑FU） に 変 換 す る 酵 素で あ り ，腫 瘍 組 織内 で は 正常 組 織 中よ り も その 活 性 が 高い こ と が 知 ら れ て い る 。 ま た 、 最 近PyNPaseが 癌 の 遠 隔 転 移 と 関 係 す る 血 管 新 生 能 を 有 す る Platelet ‑ de rived endo thel ial cel｜growth factor（PD‑ECGF）と 同一のも のであ ると が 判 明 し た 。 し か し 、 悪 性 腫 癌 組 織 内PyNPase活 性 が 腫 癌 の 生 物 学 的 性 格 や 予 後 と ぃ か なる 関 係 にあ る か は明 ら か でな い 。
そ こ で 、 申 請 者 は 新 し い 乳 癌 細 胞 の 予 後 因 子 と し て のPyNPaseの 可 能 性 を を 明 ら か に す る こ と を 目 的 に 次 の 研 究 を 行 っ た 。 す な わ ち 、 乳 癌 組 織 内PyNPase活 性 と 既 に 報 告 さ れ て い るER、PgR、EGFR、PCNAな ど の 発 現 、DN． Aploidy pattern、c‑erbB‑2 gene amplific ationな ど の 乳 癌 の 生 物 学 的 特 性 を 表 わ す 諸 因 子 と の 関 係 を 検 討 し た 。
検 討 は ，138例 のStage lIの 乳 癌 患 者 を 対 象 と し て 行 わ れ た 。 ． 患 者 の 年 齢 は28〜75才
（ 平 均55.2土10.0才 ） で あ っ た 。 外 科 手 術 に よ り乳 房 切 除後 連 や かに 腫 癌 組織 を 採 取し ，
−20℃ で 凍 結 保 存 し 、 ま た 一 部 の 症 例 で は 新 鮮・ 材 料 を用 い 、 随時 以 下 の方 法 に より 各 因 子 を 検 索 し た 。
l.PyNPase活 性 の 測 定 ： 検 体 を 処 理 し て 得 た 粗 酵 素 分 画 を 一 定 量 のPyNpaseの 基 質 で あ る5．‑DFURと 反 応 さ せ て 生 成 さ れ た5‑FU量 をHPLCに て 測 定 し 、PyNPase活 性 と し た 。
2.ERの 測 定 ：Dextran Coated Charcoal（DCC） 法 に よ 5fmol/mg protein以 上 を 示 す 検 体 をER陽 性 と し た 。 3.PgRの 測 定 ：PgRモ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 に よ るEIAキ ッ
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り 行 っ た 。ER値 が ト を 用 い た 。PgR値 が
10fmol/mg protein 以上を示す検体をPgR 陽性とした。
4.EGFR の測定：￣＝＾I を用いたcompetitive binding assay により行った。EGFR 値 が ofmol/mg protein 以上を示す検体をEGFR 陽性とした。
5.DNA ploidy pattern の 測 定 ： DNA ヒ ス ト グ ラ ム は Flowcyto metry （ Becton Dickinson 社） を用 いて測 定し 、そ の解析は単一のGO/G1 ピークを有するものを diploid とし 、 こ れ から ずれ たも の、一 つ以 上の GO/G1 ピ ーク を有す るも のを aneuploid とした。
6.PCNA 陽性細胞の解析：FITC 標識抗PCNA 抗体を使用し、FCM により分析した。陽性 細胞率が10 ％以上をPCNA 陽性症例とした。
7.c‑erb B‑2 遺伝子増幅の測定：スロットプロットハイプリダイゼーション法により行 っ た 。 増 幅 の あ る も の を c‑erb B‑2 遺 伝 子 増 幅 陽 性 症 例 と し た 。 測 定 値 はMEAN 士 SD で 示 し た 。 有 意 差 検定 に は Mann‑WhitneyUtest を 用い た。
検索の結果は次のように要約される．。
1.138 症例の乳癌組織内のPyNPase 活性は4.2 〜626.0PgFU ／mg Protein ／hr で、平均 は207.3 士122.4 ＃ gFU/mg Protein/hr であった。
2 ． 腫 瘍 剖 面 最 大 径 と PyNPase 活 性 の 問 に 有 意 な 関 係 は な か っ た 。 3 ．充 実腺 管癌 が他の 組織 型よ りも有意に高いPyNPase 活性を示した（ p<0.01 ）。
4 ． リ ン バ 節 転 移 度 と PyNPase 活 性 の 間 に 有 意 な 差 を 認 め な か っ た 。 5.ER ， PgR ともに陰性例が陽性例より有意に高いPyNPase 活性を示した（p<0.05 ）。
6.EGFR 、 DNA ploidy pattern 、PCNA と PyNPase 活性との間に有意な差はなかった。
7.c‑erbB ． 2 遺 伝子増 幅例 では 、非増幅例よりも有意に高い PyNPase 活性を示した （ p<0.05 ）。
本研究は138 例の stageH 乳癌を対象とし癌組織内PyNPase 活性を測定したものであり、
申請者は得られた実験結果から、
1 ．乳癌 組織 内PyNPase 活 性は 腫癌径 やル ンバ 節転 移度と は独 立し た因 子である。
2 ．乳癌組織内PyNPase 活性は ER 、 PgR 、c‑erbB‑2 遺伝子増幅の有無と有意な相関を示 す。
3 ．乳癌 組織 内PyNPase 活性は乳癌細胞の生物学的特性をを表す新しい因子である。
などの新しい知見を示した。検索された各症例の経過観察による予後とPynPase 活性と の照合など今後の検討を要する事項もあるが、乳癌の診療に有意義な研究と思われる。
審査 にあたって、癌研細胞制御部門の浜田講師より組織の新生血管、細胞外への PyNPase 分泌の可能性などについて、加藤教授よりc‑erbB‑2 遺伝子との関連、リンバ節 内 PyNPase 活性、組織型による活性の差異、ER との関連、予後因子としての価値につい て、小柳教授より、臨床的応用について、細川教授よりPyNPase のinhibitor の臨床応用 に関して質疑があったが、申請者は概ね妥当な回答を行った。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、また研究者として誠実かつ熱心であり、研 究歴期間にける研鑽なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有 するものと判定した。
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