博 士 （ 医 学 ） 高 橋 周 作
学位論文題名
Frequency and pattern of expression of the stem cell marker CD133 have strong Prognostic effeCtonthe SurgiCa10utCOmeofC010reCtalCanCerpatientS
（発現頻渡・発現パターンから見た大腸癌における 癌幹細胞マーカーCD133 の臨床的意義についての検討）
学 位論文内 容の要旨
【背景と目的】
近年全身化学療法の 進歩等に伴い大腸癌の治療成績は向上しているが、再発・遠隔転移に対する成績 はいまだ満足できるも のではない。
近年腫瘍細胞は一様 でなく腫瘍細胞内に自己複製能と腫瘍細胞産生能を持つ細胞集団の存在が報告さ れ「癌幹細胞」と言わ れている。この細胞集団は自身が分裂・増殖するのと同時に分化した腫瘍細胞を 生み出し腫瘍塊を形成 する。またこの細胞集団は化学療法・放射線療法に抵抗性を示し、遠隔転移や腫 瘍再発の原因とされる 。
CD133は 分子 量120kDaの5回 膜貫 通型 の糖 蛋 白で 、実 際の 発現機構は不明な部分 が多いものの、神 経系・血液系・上皮系 の幹細胞に発現が確認され、幹細胞マーカーと言われていた。近年脳腫瘍・大腸 癌・前立腺癌・膵癌等 で、このCD133を使用して癌 幹細胞の同定に成功したとする報告が認められ、さ らにその発現は、予後 を含めた臨床病理学的事項と関連しているとする報告もある。大腸癌においても 同様の報告があるが、 いずれも発現頻度からの報告で発現バターン（細胞膜発現・細胞質発現）も加味 し た報 告は認めていない。 そこで今回当科の大腸癌臨床検体を使用して発現頻度と 発現バターンから CD133の臨床的意義について検討した。
【対象と方法】
2001年1月か ら2007年12月ま での 初発 大腸 癌手 術症 例175例中 、高 ／中 分化 腺癌 ．stageI‑IV(TNM 分 類 ） の151例 を 対 象と した 。stage0くTNM分類 ）． 多発 大腸 癌・ 他臓 器重 複癌 症例 は除 外 した 。 組織学的解析では二人の独立した病理専門医により腫瘍の特徴が最も反映されている切片が抽出され、
CD133抗体(rabbit anti‑human polyclonal CD133; Abcam)を使用した免疫染色を施 行後、その発現頻 度・発現パターンが評 価された。
臨床 病理学的事項とCD133発現に関する統計学的解析 はx2乗検定とStudent's t‑testsを使用。生存 率・無再発生存率の算出はKaplan‑Meier法を使用、logrank testにより比較検定した。各因子は単変量・
多 変 量 解 析(Cox比 例 ハ ザ ー ド モ デ ル ） を 施 行 。Pく0.05を 統 計 学 的 有 意 差 あ り と し た 。
【結果】
1）対 象症 例の 背 景： 平均 年齢 は67.1才(33‑89)、 男性89例 ／女性62例。高分化腺 癌59例、中分化腺 癌92例 。TNM分 類stageI：28例 、stage II：45例 、stage III：41例、stage IV：37例（肝転移：26 例）。リンパ管侵襲陽 性：113例、静脈侵襲陽性：81例であった。
2）フオローアップ：平均観察期間41ケ月(3‑98)。45例(29.8％）が死亡。死因は原癌死：38例、他癌死：
4例 、 他 病 死 ：3例 。stage I‑IIIの114例 中 、27例(23.7％ ） に 再 発 が 確 認 さ れ た 。 3）CD133発 現の 評価 ：CD133の 発現 は、151例 中138例(91.4％）で腫瘍細胞の細胞 膜または細胞質に 確 認さ れた。全視野の50％ 以上の腫瘍細胞に発現が認められるCD133過剰発現陽性例は41例(27.2％）
― 95一
であった。
4）CD133過 剰 発 現 と 臨 床 病 理 学 的 事 項 ：CD133過 剰 発 現 と 年 齢 、 性 別 、 腫 瘍 径 、 腫 瘍 占 居 部 位 、 組 織 型、TNM分類、肝転移、リンパ管侵襲、静脈侵襲との間に関連を認めなかった。
5）CD133過 剰 発 現 と 予 後 ・ 再 発 ：CD133過 剰 発 現 陽 性 例 の5年 生 存 率 は45.5％ で 陰 性 例 の74.3％ に 比 較 し 有 意 に 不良 で あ っ た（p二ニ ニ0.002)。stageI‑Inの114例の 無 再 発 生存 率 はCD133過 剰 発 現陽 性 例 61.9％、陰性例76.7％で統計学的有意差は認めなかった（p 0．08）。
6）CD133発 現 バ タ ーン の 評 価 ：細 胞 膜 発 現136例(90.1％） 、 細 胞 質発 現44例(29.1％）で 、42例(27.8％ ） で 両 者の 発 現 を 確認 し た 。 細胞 膜 発 現 のみ を 示 す 症例 は94例(62.3％ ）で あ っ た が、 細 胞 質 発現の みを示 す 症 例 は2例(1.3％ ） だ け で あ っ た 。 細 胞 膜発 現 が 全 視野 の50％以 上 の 腫 瘍細 胞 に 認 める 細 胞 膜 過剰 発 現陽性例は25例(16.6％）に認められた。
7）CD133発 現 パ タ ーン と 臨 床 病理 学 的 事 項： 細 胞 膜 過剰 発 現 は 高分 化 腺 癌 に有 意 に 多 く(p:ニ0.019)、細 胞質発現は、中分化腺癌（pニニ0.0002)．リンバ節転移陽性(p:ニ0.0009)．TNM stage (III十rVp二二〓0．03）．ル ンバ管侵襲陽性(p二ニ0.0009)例に有意に多く認められた。
8） 細 胞 膜 過 剰 発 現 と 予 後 ・ 再 発 ： 細 胞 膜 過 剰 発陽 性 例 は 、陰 性 例 に 比較 し 生 存 率に お い て 有意 に 低 率 (p‑ニ0.0008)で あ っ た 。同 様 の 傾 向は 無 再 発 生存 率 に も 見ら れ た が 有意 差 は 認 めな か っ た(p:ニ0.12)。 9） 細 胞 質発 現 と 予 後・ 再 発 ： 細胞 質 発 現 陽性 例は、 陰性例 に比較 し生存 率にお いて有 意に不 良(p=ニ0.01) で 、 さ ら に 無 再 発 生 存 率 に お し ゝ て も 細 胞 質 発 現 陽 性 例 は 有 意 に 不 良 （p− ー0.004)で あ っ た 。 10） 生 存 に 関 す る 解 析 ： 単 変 量 解 析 で は 、 ′I丶NM分 類 で のT因 子 、N因 子 、M因 子 、 肝 転 移 、TNM分 類stage、 リ ン バ 管 侵 襲 、 静 脈 侵 襲 、 細 胞 膜 過 剰 発 現 、 細 胞 質 発 現 、CD133過 剰発 現 が 有 意な 予 後 因 子 で あ った 。 腫 瘍 関連 因 子 に よる 多 変 量 解析 で はTNM分類M因子 （pく0.05)と 細 胞 膜 過剰 発 現(p=ニ0.003)． CD133過剰発現(p:ニ0.005)は独立した予後規定因子となった。
11） 無 再 発 生 存 に 関 す る 解 析 ： 単 変 量 解 析 で は 、 組 織 型 、TNM分 類N因 子 、 リ ン バ 管 侵 襲 、 静 脈 侵 襲 、 細 胞 質 発 現が 有 意 な 因子 で あ っ た。 腫 瘍 関 連因 子 に よ る多 変 量 解 析で は 細 胞 膜過 剰 発 現 が独 立 し た 予後規定因子くp=0.008)であった。
12）CD133発 現 と 化 学 療 法 抵 抗 性 ： 画 像 上 計 測 可 能 な 評 価 病 変 を 有 す るstageIV． 再 発 の33例 を 対 象 に 化 学 療 法 の 効 果 を 検 討 し た 。 効 果 判 定 はRECIST評 価 基 準 に 従 っ た 。CD133過 剰 発 現 ・ 細 胞 質 発 現 症 例 で は 、 病 勢 コ ン ト 口 ー ル 率 （ CR+PR+SD)に 統 計 学 的 有 意 差 を 認 めな か っ た が、 細 胞 膜 過剰 発 現 症 例 で は 、陽 性 例 の14.3％(1/7)に 比 し陰 性 例 は57.7％(15/26） で、陽 性例は有 意に病 勢コン ト口ー ル率が 低率
（p―0．04冫であった。
【考察】
CD133は 大 腸 癌 の 癌 幹 細 胞 マ ー カ ー と され る 。 し かし こ れ ま での 報 告 で は、 癌 幹 細 胞の 特 徴 で ある 自 己 複 製 能 と 腫 瘍 細 胞 産 生 能 を 持 っ た 細 胞 はCD133陽 性 細 胞262個 中1個 の 割 合 と 推 測 さ れ て い る。 ま た 近 年CD133陰 性 細 胞 の 中 に も 癌 幹 細 胞 様 の 特 徴 を 持 つ 細 胞 集 団 が 存 在 す る と の 報 告 も あ り 、CD133陽 性 細 胞 集 団 だ けに 癌 幹 細 胞と し て の 特徴 を 求 め るこ と は 困 難で あ る 。 そこ で 今 回 あら た め て 大腸 癌 に お けるCD133発現の臨床的意義を発現頻度・発現バターンの両方から検討した。
今 回 のCD133抗 体(rabbit anti‑human polyclonal CD133；Abcam)を 使 用し た 検 討 では 、 大 腸 癌に お け るCD133の 発 現 率 は こ れ ま で の 報 告 よ り やや 高 率 で あっ た が 、 予後 と 関 係 して い る 点 はこ れ ま で の報 告 と 一 致 し て い た 。CD133の 発 現 パ タ ー ン は 細 胞 膜 発 現 と 細 胞 質 発 現に2分さ れ た が 、こ れ ま で の報 告 で は 細 胞 膜 に のみ 発 現 を 認め た と し て評 価 さ れ てい る 報 告 が大 半 で 、 細胞 質 発 現 は今 回 の 検 討を 含 め て 少 数 に と ど ま る。 し か し 膵癌 ・ 肝 細 胞癌 ・ 神 経 膠腫 ・ 卵 巣 癌な ど で は 主に 細 胞 質 に発 現 し た と報 告 さ れ ている。
こ の よ う な 免 疫 染 色 にお け る 細 胞内 で の 発 現の 局 在 性 につ い て 検 討さ れ た マ ーカ ー と し ては 、CD24と HER‑2が あ る 。 その 報 告 の 中で は 、 局 在性 の 原因 として 細胞内 での標 的蛋白の 過剰産 生や分 配・退 化障害 、 さらに一方が人工産物であったり交差反応の可能性も報告されている。
CD133発 現 に お け る 細 胞 内 の 局 在 が 、 それ ぞ れ 異 なっ た 細 胞 機能 を 反 映 して い る か は不 明 で あ るが 、 今 回 の検 討 で は それ ぞ れ に 臨床 的 意 義 が確 認 さ れ た。 細 胞 膜 過剰 発 現は 予後や 化学療 法抵抗 性と関連 し、
細 胞 質 発 現 は ル ン パ 節 転 移 を 含 め た 腫 瘍 進 行度 と 関 連 した 。CD133過 剰 発 現 例で は 有 意 が予 後 不 良 ぬこ と か ら も 、CD133陽 性 細 胞 に は 癌 幹 細 胞 と して の 純 粋 な分 化 能 等 の他 に 、 悪 性度 の 指 標 とな る 浸 潤 能や 遠 隔 臓 器 へ の 転移 増 殖 能 とい っ た 特 徴を 併 せ 持 って い る 可 能性 が 示 唆 され る 。 ま た今 回 の 検 討か ら は 再 発 に 至 る 要 因 とし て は 細 胞質 発 現 で の腫 瘍 進 行 度が 主 に 影 響し 、 再 発 後に は 細 胞 膜過 剰 発 現 での 化 学 療
― 96ー
法抵抗性が影響し、CD133陽性症例全体の予後不良の原因となっている可能性が示唆された。細胞膜台 細胞質問での発現蛋白の移動が異なった表現型となる可能性を示唆する報告もあり、今後も検討が必要 である。
【結諭】
大腸癌において、免疫染色によるCD133の発現頻度・発現バターンを評価することは、再発・化学療法 感受性・予後を予期するのに有用であった。
− 97―
学位 論文審査の要旨 主 査 教 授 松 野 吉 宏 副 査 教 授 田 中 伸 哉 副 査 教 授 藤 堂 省 副査 准教授 神山俊哉
学位論文題名
Frequency and pattern of expression of the stem cell marker CD133 have strong Prognostic effeCtonthe SurglCa10utCOmeofC010reCtalCanCerpatientS （発現頻渡・発現パターンから見た大腸癌における 癌幹細胞マーカーCD133 の臨床的意義についての検討）
近年 腫瘍内に自己複製能と腫瘍細胞産生能を持つ細胞集団「癌幹細胞」の存在が注目されている。こ の癌幹細胞は、自身が分裂・増殖するのと同時に分化した腫瘍細胞を生み出すことで腫瘍塊を形成する。
また化 学療法・放射線療法に抵抗性を示し、遠隔転移や腫瘍再 発の原因とされる。CD133は大腸癌にお ける癌 幹細胞マーカーとされ、発現頻度と予後を含む臨床病理学的事項との関連が報告されているが、
発現パ ターン（膜発現・細胞質発現）も加味した報告は認めて いない。
本 研 究 で は2001年1月 か ら2007年12月 ま で の 初 発 大 腸 癌 手 術 症 例175例 中、 高 ／中 分化 腺癌 ． stageI‑IV(TNM分類）の151例を対象に、CD133抗体(rabbit anti‑human polyclonal CD133; Abcam)を 使用し た免疫染色を施行、CD133の 発現頻度と発現パターンを解析し、その臨床的意義について検討し た。
その 結果、1）CD133の発現頻度は91.4％(133/151)で、発現バターンとしては膜発現と細胞質発現に2 分され た。2）全視野の50％以上の 腫瘍細胞に発現が認められるCD133過剰発現群は27.2％(41/151)で、
各臨床 病理学的因子との間に関連を認めなかったが、生存率は有意に不良で、多変量解析にて独立した 予 後規 定因 子 とな った 。3）膜 発現 は90.1％(136/151)、細胞質発現は29.1％(44/151)に観察され、
27.8％(42/151)の症例で両者の発現が混在した。
4）膜発現が全視野の50％以上の腫瘍細胞に認める膜過剰発現群は16.6％（25/151)で、高分化腺癌症例に 多く発 現。また有意に生存率が低率で、多変量解析の結果生存・再発の予後規定因子であった。さらに 画像上 計測可能な病変を有するstageIV．再発の33例で化学療法の効果を検討すると膜過剰発現群のみ、
病勢コ ントロール率（ CR+PR+SD)が有意に低率であった。
5） 細胞 質発 現群 は中 分化 腺癌 症例に多く、ルンバ節転移．TNM stage (III十IW．リンバ管侵襲など の腫瘍進行度と有意に関連した。この細胞質発現群は陰性例に比較し生存率、無再発生存率におし〕て有 意 に 不 良 で あ っ た が 、 多 変 量 解 析 で は 独 立 し た 規 定 因 子 と は な ら な か っ た 。 6） 大腸 癌幹 細胞 はCD133陽 性細胞262個中1個の割 合とされる。さらにCD133陰 性細胞にも癌幹細胞の 特徴を 持つ細胞集団が確認されたとの報告から、CD133陽性細胞集団だけに癌幹細胞の特徴を求めるこ とは困 難である。7）今回の検討で 、再発に至る要因として細胞質発現での腫瘍進行度が主に関与し、
再発後 には膜過剰発現での化学療法抵抗性が関与し、それがCD133陽性症例全体の予後不良の原因となっ
一 98―
ている可能性が示唆された 。8）CD133陽性細胞は癌幹細胞としての特徴の他に、細胞質発現細胞は腫瘍 進行度に関する遊走能・浸 潤能・リンバ節や遠隔臓器への転移増殖能を持ち、膜発現細胞にはABCトラ ンスポーターやMDR1が優位 に発現している可能性があった。
発表 後、 副査 の田 中教 授か ら1）対象症 例を高・中分化腺癌とした理由、2）CD133発現の化学療 法 抵抗性の臨床応用の質問が あり、申請者は1）低分化腺 癌や印環細胞癌・粘液癌などの特殊型では症例 数が少ない割に腫瘍自体の 悪性が非常に高いため CD133の解析に不向きと判断したこと、2）対象症例 の化学療法のレジメも同一 ではなく、症例数も多くないので今後の検討課題と回答した。副査の神山准 教 授か ら遠 隔転 移巣 でのCD133の発現状況 の質問があり、申請者は原発巣と比較してCDユ33の発現 頻 度・パターンは多くの場合 類似し、CD133陽性細胞が転 移巣形成の主体となっている可能性があると回 答した。副査の藤堂教授か ら1）大腸癌においてCD133以外に可能性のある癌幹細胞マーカーについて、
2）腫 瘍細 胞内 でのCD133発現 の局 在性 につ いて の質 問 があ った 。申 請者 は1）こ れまでの報告か ら CD44、CD166、Lgr5、SOX2、OCT4な ど が あ り 、CD133と 組 み 合 わ せ る こと でよ り癌 幹細 胞を 抽出 できる可能性があること、2）細胞質発現が腫瘍内の分化度の低い部分に多く発現したことを報告した。
最 後に 主査 の松 野教 授か ら1）発癌過程に おけるCD133の関与について 、2）実臨床において再発の 高 リ スク群などを抽出できる可能性について の質問があった。申請者は、1）腺腫と癌ではCD133の発 現 にかなりの差があることか ら、正常幹細胞→癌幹細胞の過程でCD133が何らかの関与をしている可能性 があること、2）臨床的にstageIIにおける再発のルスク要因についてエピデンスレベルの高いものが無 い中、今回stage別の層別解析（特にstageII)でも、発 現バターンから再発率に差を認めていることか ら 、 リ ス ク フ ァ ク タ ー の1つ に 成 り 得 る と回 答し た。 いず れの 質 問に も妥 当な 回答 をな しえ た。
本研究により大腸癌にお いてCD133の発現頻度・発現 バターンを評価することは、再発・化学療法感 受性・予後を予期するのに 有用であることが確認された。この論文は，CD133が大腸癌において癌幹細 胞マーカーとしてだけでな く、その発現頻度・発現パターンがそれぞれ臨床的意義を持つ点を示唆した こ と で 高 く 評 価 さ れ ， 今 後 の さ ら な る 症 例 の 蓄 積 に よ る 検 討 と そ の 臨 床 応 用 が 期 待 さ れ る 。 審査員一同は，これらの 成果を高く評価し，申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を 有するものと判定した。
‑ 99ー
