緑茶カテキン類の抗変異原性に関する研究 学位論文内容の要旨

序論

博 士 （ 薬 学 ） 武 藤 重 治

学 位 論 文 題 名

緑茶カテキン類の抗変異原性に関する研究 学位論文内容の要旨

  緑茶 の飲用 がヒト のがん 発生 ネを低 下させ る可能 性が 疫学研 究から 示唆されている。齧歯類におい て、タールなどに含まれるbenzo[々］pyrene（B［々］P）は肺、胃、皮膚などにがんを誘発する。緑茶に含ま れるカテキン類はB［a］Pによる肺、胃などの発がんを抑制することが報告されている。化学発がんのイニ シエー ショ ンは、 がん原 物質の 活竹 イ℃荊 物が、 がん遺伝了Iやがん抑制遺伝予などに突然変異を誘発 する過 程で ある。 緑茶カ テキン 類は遺伝子突然変異の綉発を扣｜制する可能性が示唆されている。木研 究では、緑茶カテキン類が発がんのイニシエーションを桝I制するか、すなわち抗変異原tI三を青するかを 明らかにすることを目的とし、1）変異原・がん原物質の代調tnり淅他fヒ、2）変異原・がん原物質の解毒 化、3）損傷をうけた遺伝イIの修復、のそれぞれのj咼ほにおljニばすカテキン類の影響を検討した。さらに 4）緑茶カテキン類の抗変異原性についてmWmにて検証した。

I．変 異原・ がん原 物質の 代翁t的活性化に関与する酵素の活f生におよばす緑茶カテキン類の影響   環境 巾の 変異原 ・がん 原物質 の多く は生 体内で 活f生化さ れて初 めて毒t生を示す。この代謝的活性 化に はチト クロームP450 (CYP)の関与が最も大きいことが明らかとなっている。そこで、ヒトCYPによる 変異 原・が ん原物質の代翻t的活性化におよぼす緑茶カテキン類の影響を験許tした。酵素源としてCYf． とNADPFI−CYP還元酵 素(OR)を 同時に 発現 するサ ルモネ ラ繭″ ）膜 両分を 使用し た。緑 茶カテ キン葡 はB[a]P、PhIPお よ びArB,のCYP1八I、CYPIA2お よびCYI':3A1によるf℃ 謝的活 性化 を阻害 したー 緑 茶カテキン類の主成分であるepigallocateching（11aLe（EGCG）による阻害が最も強く、CYPlAlによる10 IIMB［ お ］Pの 代 調j的活t生化 に対す るI岨吉のIC50値は 約1511Mであっ た。 また、EGCGは多 種のCYr 分子 穏によ る薬物 の酸 化反応 を非特異的に阻害した。例えばCY卩1八｜による7−エトキシレゾルフイン

〇−脱エチル化に対する阻害のん値は約15．｜IMであった。さらに、緑茶カテキン類によるヒトCY卩の非 特 異 的阻 害 の 一 因 とし て、0Rー の緑 茶カテ キン類 の影響 を検 討した ところ 、EGCGがORを朋値 約2．5 uMで阻害した。

  以上 、緑 茶カテ キン類 の主成 分であ るEGCGが 、CY卩 による 変異原 ・が ん原物質の代翁｜的活性化を 阻害すること、またORの阻害が一因であることを明らかにした。

II．変 異原・ がん原 物質の 解毒酵 素の 発現量 におよばす緑茶カテキン類の影響

  B［司卩の解毒化に関与，するglutnthione S‑transferase (GST)、UDP glucuronosyltransrerase (UGT)お よ びNADPFI: quinone oxidoreductaseI (NQO｜）の発現におよばす緑茶カテキン類の影響を検許tした。

7週令の 雄性C57Bしノ6Jマウス にEGCGを含む溶液を与．え1週間飼育した。薬物代翻‖こ関与，する主要 職器である肝と、B[n卩による発がんのキ票的臓器の1っであるfliliのミクロゾームおよび細胞質画分を調 製 し た 。GST、UGTお よ びNQO｜ のmRNA量 お よび 酵 素 活flを 測 定 し た。F.GCGの投与 により 、肝臓 で

GSTAIのmRNAは 約3倍 、 肺 で はGSTAIとGSTA3のmRNAが そ れ ぞ れ 約2f各 、 約3倍 に ｜ 曽JJnし た 。   B(a]Pは生体内で代翻1的に活性化され、B［冖］卩一7．8−ジヒドロジオール―9．IO―エポキシド(BPDE)が生 成 す る。BPDEは 究極発が ん物質として知lられている 。BPDF.の 解毒化に関与するGSTの活｜ 生におよば すEGCGの効県を験葺寸した。ラットJITミクロゾームをB［問Pの活t´E化酵素源とし、EGCGを舍む飲零1水で 飼 育 した マウ ス のnrおよ び 肺の 細胞 質 画分を解毒酵 素源とした。これら 酵素およびサルモ ネラ菌TA98 抹をグルタチオンの存在下、非存在下で2，5 LLM B[a]Pとゴヒに処ロ．｜！した。EGCG非投与のマウスの細胞 質画 分を用いたときの 復帰変異コ口ニー 数を100%とし、EGCG投与．の影響を評 価した。0．005% EGCG、 0．0536 EGCGを投与し たマウスのIITおよび肺細胞質両分を角〒毒酵素源として用いたときに対｜畷に比べ て復 帰変異コロニー散 が約80％に減少したことより、GSTが誘導されグルタチオン抱合能が増カ‖したこと が明 らかとなった。ま た、EGCGはJlT臓および肺でNQO｜のmRNAを最大約1．6f密に亅二昇させた。また、

0.005?6のEGCGを 投 与 し た マ ウ ス の 肝 臓 でUGTIA7のmRNAが 約2倍 に 、 肺 でUGTIA6のmRNAが 約3倍に｜曽加した。

  以 上、EGCGが マウ ス肝 お よび 肺に お いて 解毒 酵 素の 発現 を 誘導 し、 変 異原 ・が ん原物 質の解毒能 を亢進させることを明らかにした。

川， DNA修 復関 連 遺伝 子の 発 現におよ ぼす緑茶カテキン 類の影響

  DNA arrayを 用 い 、EGCGがDNA修 復 関 連 遺 伝 子 のmRNA発 現 履 に お よ ば す 影 響 を 検 討 し た 。7 週 令の 雛性C57BL/6．｜マウス にBGCGを含む溶液を 与，えJ週‖n飼育 し、〃Tお よび肺RNAを調製した。

ClontechのAtlasMouseSt「ess/ToxicoIOgy八rrayを用いてmIミN八量を解析し た。このDNAar「ayには 140の遺伝子I折片がブロッ トされている。各遺 伝予のスボットのシグナル弧度を、ハウスキービング遺伝 予のスポ ットのシグナル強 度で補正後、対照とEGCG股与群におけ る各遺伝・7 のmRN八量を比較した。

EGCG投 与に よ りXerodermapigmentSumCOmplemenLationgrOLtp八 （XPA）、Xerodermal）igmenLS川11 complemenLationg「ulpC（XPC）、mIlR23八およびmIIR23Bの発現凧がJ曽加1した。さらに、これら遺伝子 のmRNA量 をRTーPCR法 に て 定 量 し た 。EGCGを 与 え た マ ウ ス の 肝 で 、XPCお よ びmlrIR23BのmRNA 発現最がJ質加1することが 確認された。X卩CとmIR23Bは後合f木を形成し、ヌクレオチド除去修復の初j引 段階であ るDNA損傷 の認織に関与する ことが報告されて いる。これら遺伝予 の発現が増加1することによ り、DNA損傷の修復 が亢進する可能性 が示唆された。

IV.緑 茶 カテ キン 類 の抗 変異 原 性の 加VIVOにお ける 検証

  B[alPによる発がんイ ニシエーションにEGCGがおよぼす景彡響を/′  wvoにて検証した。方法として、

遺伝子突然変 異をめI′ ′ VOで 解忻できるI・IITECマウスを用いた。IIITECマウスには大腸菌出来のrpsL 遺 伝 予 が 遺 伝 子 突 然 変 異 の モ ニ タ ー 遺 伝 予 と し て 導入 さ れて いる 。7週 令 の雛 性‑llTECマ ウス に EGCGを 含 む 溶 液 を 与 え 飼 育 し 、EGCG投 与 開 々 ム11から1週間 後500 mg/kgのB[a]Pを 腹 腔内 に単 回 投与 し た。B[a]Pの投 与 から2週間 後に肺を回収 し、モニター遺伝 了・であるipsL遺伝 予に起きた遺伝 了・ 変 異の 頻度を解 析した。B[a]Pのみを投与し た時、IIITF.Cマウス肺のu,s遺伝子に おける変異の頻 度は、対照の 約4倍に上 昇した。また、B[a]l）が誘発する変晃の頻度が高い塩基（ホットス；Jごット）は AGG、CGT、CGG配 列 巾 の グア ニン 塩 基で あっ た 。こ れら は 喫煙 青の 肺 がん にお け るp53遺伝 予変 異 のホットスポットであるコドン157 (｜56CGC̲'57GTC−｜S'CGC). 2´18（21 八AC―2仙CGG−21tJ八GG）、273

（mGTG―mCGT−271G11T）と同じ配列を含んでおり、｜lI′「nじマウスが発がんイニシエーションの丁刪系と して有用であ ると考えられた。n（朋rが綉発する変異の頻度はL：卜が約｜O抔の緑茶を飲んだ場合にf日当 するO．005鷺EGCG投与群で、EGCGを与えなかった群 に勢ルァて約40％ に減少した。また 、それぞれのホ ットスポット における変異頻度 が、EGCGの投与によ り減少した。以上、」GCGがB［a］Pによる発がんイニ シエーションを抑制することを明らかにした。

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学位論文審査の要旨

主 査

  教 授   鎌 滝 哲 也

副 査

  教 授   長 澤 滋 治

副 査

  

助 教 授

  有 吉 範 高

副 査

  

助 教 授

  高 橋 和 彦

学 位 論 文 題 名

緑茶カテキン類の抗変異原性に関する研究

  r11〓肖 者は 緑茶に 含まれ るカテ キン類 によ る発が ん予防 のメカ ニズ ムの解 明を口 「nとし、 世界「n な研究成果を得た。すなわち、木研究では緑茶カテキンをぬが、変巽原・がん原物質の代i叫l´｜′、J活t′It 化 、 解 毒 化 、DNA損 傷 の 修 復 に お よ ば す 影 響 を 検 討 し た 。 さ ら に 、 緑 茶 カ テ キ ン 類 の 航 変 巽 原 性 をni、′ 、 ′ 〇 で検 証した 。本 研究は がんの 予防研 究に有Jnな慨 念を提 供する もの であり 、以下 に 詳述するように極めて優れた研究成果であると評f111iされる。

I

．変異原・がん原物 質の代謝的活性化に関与する酵素の活性におよぼす緑茶カテキン類の影響

  

ヒ卜CYPによる変異原・がん原物質の代i鮒的活

P

｜イじにおよばす緑茶カテキン類の影響を検許t した 。ら 幸索 源と し て

CYP

と

NADPH

・CYP還 元酢 素 （

OR

）を

r

司 時に発現するサル モネラ菌の膜 画 分 を 使 用 し た 。 緑 茶 カ テ キ ン 類 は

B

［

a

］

P

、

PhIP

およ び八

FBl

のCYPlAl、

CYPl

八2およ び

CYP3

八4に よ る代訥j的活 性化を阻害した。緑茶カテキ ン矧の：ト成分であるcDigallocatechin

gallaLe

（

EGCG

）による阻 害カミ最も強かった。例え ば、CYPl八1による10いMB［

a1P

の代i射的 活 性 化 に 対 す る 阻 害 の

ICs

。 値 は 約

15uM

で あ っ た 。 ま た 、

EGCG

は 瓊 数 の

CYP

によ る 葉物 の 酸化 反応 を非 特異 的 に阻 害し た。 例え ば、

CYPlA1

に よる7・エトキシレゾルフィ ン〇脱工チル 化に 対す る阻 害の ′

fI

値 は約

1511M

で あっ た。 さ らに 、緑 茶カ テキン類によるヒ 卜CYPの非特 異 的 阻 害 の 一 因 と し て 、

OR

へ の 緑 茶 カ テ キ ン 類 の 影 響 を 検 討 し た と こ ろ、

EGCG

が

OR

を 擶 値約

2

．5いMで阻害した。

  

以．l二、緑茶カテキン類 の主成分であるEGCGが、CYPによる変異原・がん原物質の 代i射的活 性 化 を 阻 害 す る こ と 、 ま た

OR

の 阻 害 が 一 囚 で あ る こ と を

f

リ

j

ら か に し た 。

II

．変異原・が ん原物質の解毒酵素の発現量におよぽす緑茶カテキン類の影響

  B

［ alPの解毒化に関与するglLItat11ione SLransferasc (C;ST). LJDP glucmて）losylLransf erase

(UGT)

お よび

NADPFI: cluinone oxiclorecIuctaseI cNooi

） の発 現に およ ぼす

EGCG

の 影響を 検 討 し た 。

7

週 令 の 雄 性

C57BL/6J

マ ウ ス に

EGCG

を 含 む 溶 液 を 与 え

1

週 間 飼 育し 、肝 およ び 肺 の

GST

、

UGT

お よ び

NQOi

の

mRNA

量 と 酵 素 活 州 ： を 測 定 し た 。

EGCG

の 投 り によ り、

n1

こ で

GSTA1

の

I11RNA

は 約

3

倍 、

0

巾 で は

GSTA1

と

GSTA3

の

111RN

八 が そ れ ぞ れ 約

2f

倍 、 約

3

倍 に1曽ん‖した。CDNBに対するGST浙t生は0．05％EGCGのj殳りにより何意にl智ん‖し、Jlrで対f蝋

‑ 594 ‑

群 の 約1．2f舟 、niliでは約1．4f藷であ った。また、FJGCGは‖1こおよび肺でN(QOiの1111くN八 を最人 約1．6倍に．I：昇させた。メナ ジオンに対する単竹蛋I，l質景当たりのNooi活tMま肝でx、t！！a｜洋の約

｜ ．4倍 に 、 肺 で 対 照 群 の 約1．3倍 に 上 昇 し た 。 さ ら に 、O．005％ のF.GCGを 投与 し たマ ウス の 肝 でUGTIA7のmRNAが約2倍に、肺でUGTIA6のmRNAが約3倍に亅曽 加した。

  以 」 ニ 、EGCGが マ ウ ス ‖rお よ び 肺 に お い て 解 毒 酢 素 の 発 現 を 誘 導 し 、 変 異 原 ・ がん 原物 質 の 解毒 能を亢進させるこ とを明らかにした。

III. DNA修 復 関 連 遺 伝 子 の 発 現 に お よ ぼ す 緑 茶 カ テキ ン 類の 影響

  DNA arrayを 用 い 、EGCGがDNA修 復 関 連 遺 伝 子 のinRN八 発 現 量 に お よ ぼ す 影 響 を 検 ミ ；t し た 。7週 令 の 雄 性C57BL/6Jマ ウ ス にEGCGを 含 む 溶 液 を 与 え1週 間 飼 育 し 、JJTお よ び ‖ 巾 RNAを 調 製 し た 。ClonLechのAtlas Mouse SLress/Toxicology Arrayを ′nい てmRNA量 を 解 析 し た 。EGCGの 投 与 に よ り1lTに お い てxercxlernla piginentsLlm comDlementacion grouD A (XPA)、xeroclerma pigfnentsum coinplemenlaLion grouDC(XPC)、nll‑IR23八 お よ び inl‑IR23Bの 発 現 量 が 増llIIし た 。 さ ら に 、 こ れ ら 遺 伝 子 のmRNA量 をRT‑PCR法 に て 定 量 し た 。 EGCGを 与 え た マ ウ ス の 肝 で 、XPCお よ びmI‑IR23Bの1111ミNA発 現 量 が 増 加Jす る こ と が 確 認 さ れ た 。XPCとmHR23Bは 後 合 休 を 形 成 し 、 ヌ ク レ オ チ ド 除 去 修 復 の 糾 期 段 階 で あ るDNA損 傷 の 認 識 に 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 こ れ ら 遺 伝 予 の 発 現 が 増 加 ｜ す る こと に より 、DNA 損 傷 の 修 復 が 亢 進 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

IV.緑 茶 カ テ キ ン 類 の 抗 変 異 原 性 の 加vivoに お け る 検 証

  d a]Pに よ る 発 が ん イ ニ シ エ ー シ ョ ン に お よ ぼ すEGCGの 影 響 を 遺 伝 子 突 然 変 異 を 宀JVI voで 解 析 で き るI・IITECマ ウ ス を 用 い て 検 証 し た 。HITF.Cマ ウ ス に は 火 腸 苗 山 来 の/DsL遺 伝 子 が 遺 伝 子 突 然 変 異 の モ ニ タ ー 遺 伝 子 と し て 導 入 さ れ て い る 。7迎 令 の 雄 性HITFCマ ウ ス にEGCGを 含 む 溶 液 を 与 え 飼 育 し 、EGCG投 与 開 始 か ら1週 間 後500 mg/kgのB[a]Pを 腹 腔 内 に 単 回 投 与 し た 。B［ alPの 投 与 か ら2週 間 後 に 肺 を 回 収 し 、 ′DsL遺 伝 予 に 起 き た 遺 伝 予 変 異の 頻 度を 解 析 し た 。B[a]Pの み を 投 与 し た 時 、HITECマ ウ ス 肺 のrpsL遺 伝 予 に お け る 変 異 の 頻 度 は 、 対 照 の 約4倍 に 上 昇 し た 。 ま た 、B[alPが 誘 発 す る 変 異 の 頻 度 が高 い塩 基 （ホ ット ス ポッ ト） は 喫煙 者 の 肺 が ん に お け るp53遺 伝 予 変 異 の ホ ッ ト ス ポ ッ ト と 同 じ 配 列 を 含 ん で お り 、 トIITECマ ウ ス が 発 が ん イ ニ シ ェ ー シ ョ ン の 予 測 系 と し て 有 用 で あ る と 考 え ら れ た 。B[a]Pが 誘 発 す る変 異 の頻 度 は ヒ ト が 約10杯 の 緑 茶 を 飲 ん だ 場 合 に 相 当 す る0.005％EGCG投 与 群 で 、EGCGを 与 え な か っ た 群 に 対 し て 約40％ に 減 少 し た 。 ま た 、 そ れ ぞ れ の ホ ッ ト ス ポ ッ 卜 に お け る 変 巽 頻 度 は 、EGCG の 投 与 に よ り 減 少 し た 。 以 上 、EGCGがB[a]Pに よ る 発 が ん イ ニ シ ェ ー シ ョ ン を 捫J制 す る こ と を 明 ら か に し た 。

以上、木研究は緑茶 カテキン類ががん 原・変異原物質の代i,qll′Iり活州三fヒをI弧害すること、およびが ん 原 ・ 変 巽 原 物 質 の 解 毒 化 を 亢 進 す る こ と をI川 ら か に し た 。 ま た 、 緑 茶 カ テ キ ン頬 がDN八 修復 機榊を亢進する 可能性を示唆した 。さらに、新規のjぬ tk予突然変5｜き検川系 をJr亅い、緑茶)Jテ キン 類の 抗変 異 原性 をin vivoで検ミ 正し、t止 界rI勺にもユニー クtcり『究を展BHした。本論文「緑茶 カテ キ ン 類 の 抗 変 異 原 性 に 関 す る 研 究」 に 含ま れる 研 究成 果は 薬 学に おけ る 基礎 およ び 応用 のい ず ォ1 に お い て も 優 れ て お り 、f専 士 （ 薬 学 ） の 学 位 を 受 け る に 充 分 値 す る も の と 認 め た 。

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