ß-aminopropionitrile 投与による鶏胚骨格異常の解析

ß -aminopropionitrile

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

久保田 桜

(指導： 磯川 桂太郎 教授，山崎 洋介 助教)

目 次

概 要

……… 2

緒 言

……… 5

材料および方法

……… 7

成 績

………10

考 察

………13

結 論

………16

謝 辞

………18

文 献

………19

図 表

………22

基幹論文

Kubota S, Yuguchi M, Yamazaki Y, Kanazawa H, Isokawa K.

Highly reproducible skeletal deformities induced by administration of ß -aminopropionitrile to developing chick embryos.

Journal of Oral Science, in press

概 要

胚組織の骨格要素は，発生の進行に応じて種々の形態変化を遂げる軟骨や 骨であり，その主要な構成成分は細胞外のコラーゲン線維である。コラーゲン 性の骨格原基は，将来の生体各部の骨性骨格の雛形をなすが，その物性や性状 にはコラーゲンの分子内および分子間の架橋が大きく関わっている。これらの 架橋形成を担うのがリシルオキシダーゼであり，一方，この酵素の活性を選択 的に阻害するのが

ß -aminopropionitrile (BAPN)である。BAPNは，スイートピ

ラチリズムlathyrismとよばれる諸症状が現れることが知られている。BAPNは，

こうしたラチリズムの原因物質であると判明しており，その投与によって，コ ラーゲン原線維内で分子間凝集が攪乱され，骨性ラチリズムが生じることが明 らかになっている。

本研究では，鶏胚を実験動物として用い，卵殻に開窓して卵内で発生中の 発生日齢(ED)3-9日目の鶏胚にBAPNを投与した。その後，発生を一定期間継続 させ，ED5-10となった鶏胚を取り出して固定し，薄切法を用いず胚全体として の骨と軟骨の二重染色および骨・軟骨以外の組織については透明化処理を施す という方法を用いて，BAPNの投与で骨格要素に生じる異常の特徴，異常形態の 再現性，出現経緯を精査した。さらに，注目すべき変形が高い再現性をもって 観察された骨をアルカリ法によって胚組織から取り出し，その微細構造的な変 化について，走査型電子顕微鏡による観察を行った。

まず，有精卵へのBAPN投与量の妥当性を，鶏胚の生存率と骨格系異常の出 現状況から検討した。その結果，卵内で発生中のED4の鶏胚に350 µg/eggの

BAPNを投与した場合，ED10での生存率は約50％であり，骨および軟骨で構成さ

観察で，胚内の複数箇所の骨格要素に変形が認められ，それらには部位特異性 があることが判明した。すなわち，外篩骨，下顎，椎骨，椎肋骨あるいは後肢 の骨格要素(脛足根骨および足根中足骨)などで骨変形がみられ，前肢の骨格要 素，骨盤，大腿骨などでは変形はみられなかった。これら多数の変形の中で，

骨幹中央部が伸筋側に突出する特徴的な屈曲変形が高い再現性をもって出現す る後肢の脛足根骨tibiotarsusに，以後の解析の焦点をあてることにした。

脛足根骨の屈曲変形は，ED4でのBAPN投与後，経日的にED10までその屈曲度 が増大した。ED5-8に至るどの日齢での投与によっても屈曲変形は惹起された が，ED8での投与では，脛足根骨の近遠心にある骨幹端２箇所に屈曲が生じた。

これは非常に特異な所見であり，ED7以前に投与されたBAPNが惹起した屈曲変 形とは形態的に明らかな差異がある。本研究の知見からは，ED8は骨幹中央部 での屈曲変形が生じる条件が既に終了した時期だと考えられた。実際，ED9で

BAPN投与を受けた鶏胚では，ED8でみられた骨幹端2箇所も含めて，脛足根骨の

脛足根骨の屈曲変形についての走査電顕的な観察では，屈曲変形の凹部(屈 筋側)に線維層板骨fibrolamellar boneの過形成が認められ，同部には活発な 骨基質形成を行う骨芽細胞の存在を示唆する多数の骨小窩が観察された。線維 層板骨は，BAPN非投与の屈曲変形のない脛足根骨では骨幹周囲を均等に覆って いるが，BAPN投与によって屈曲変形をきたした脛足根骨ではその分布に偏りが あり，とくに屈曲変形の凹部では過形成状態にあることが特徴的であった。一 方，屈曲変形の凸部(伸筋側)の骨面は平滑で線維層板骨がみられず，骨小窩も 乏しかった。また，BAPN投与胚の脛足根骨の内面(骨髄腔側)には，破骨細胞性 の明瞭な吸収窩が多数みられたが，非投与胚での屈曲をみない脛足根骨の内面 では，破骨細胞性吸収窩は不明瞭で数もわずかであった。

以上の結果は，BAPNの投与による骨格要素の変形異常とくに脛足根骨でみ られる屈曲変形は，高い形態的再現性をもって出現し，発生段階や部位的にも

格原基の強度減弱には，骨改造におけるバランスの異常も影響している可能性 があると示唆された。

な お ， 本 論 文 は ，

Kubota S, Yuguchi M, Yamazaki Y, Kanazawa H, Isokawa K. Highly reproducible skeletal deformities induced by administration of ß -aminopropionitrile to developing chick embryos.

Journal of Oral Science, in press

ß -

aminopropionitrileの投与量と鶏胚生存率との関係についての新たなデータを

緒 言

胚組織の骨格要素は，発生の進行に応じて種々の形態変化を来す軟骨や骨 であり，その主要な構成成分は細胞外のコラーゲン線維系である。これらのコ ラーゲン性の骨格原基は，個体発生の過程で直接あるいは軟骨を介しての骨化 を遂げて，将来の生体各部の骨性骨格構造に移行する(1,2)。部位によって は，軟骨性原基の一部が骨化することなく，例えば関節軟骨などとして成体の 骨格構造の一部となる場合もある。したがって，成体の骨格構造の雛形をなす コラーゲン性原基の質的不良やそれを惹起する形成不全は，充分な強度をもつ 骨格構造が将来形成される上での深刻な障害となる。雛形となるコラーゲン性 の骨格原基に求められる物性や性状には，コラーゲンの分子内および分子間の 架橋が大きく関わっている(3-5)。この架橋構造の形成には，アミンオキシダ ーゼの一種であるリシルオキシダーゼ(LOX, EC1.4.3.13)が関わる。すなわ ち，コラーゲンのペプチド鎖中のリシン残基を

LOX

2

一方，スイートピーLathyrus odoratus の種子を摂取させた家畜で，骨の 形態異常，解離性大動脈瘤，皮膚の弛緩などが生じることは古くから知られて おり，それらの諸症状はラチリズム

lathyrism

ß -aminopropionitrile (BAPN)がラチリズムの

lathyrogen

BAPN

ニワトリおよびその胚ではどちらのタイプのラチリズムもスイートピー摂取で 生じるが，マウスやラットでは骨性ラチリズムが生じないとの報告がある

(12)。また，当初，諸説が入り乱れた BAPN

てコラーゲン原線維内でコラーゲンの分子間凝集が攪乱されることを明らかに した。

本研究では，卵内で発生を継続させることができる鶏胚を実験動物とし，

薄切法を用いず胚全体として骨と軟骨の二重染色をし，同時に他の胚組織を透 明化することで(14, 15)，骨格要素の可視化と出現する形態異常の

3

足根骨

tibiotarsus

BAPN

の投与時期，作用期間の観点から経日的に精査した。さらに，特徴的な骨変形 が生じる脛足根骨の微細構造的な変化を走査型電子顕微鏡(SEM)で検討した。

材料および方法

1. 鶏卵の開窓とインキュベート

白色レグホン

Gallus gallus の有精卵(約 70 g, 大畑シェーバー孵化場)を

39℃でインキュベートし

3-9

10 × 15 mm

100 µl

BAPN

Hamburger

Hamilton (17)の形態的基準によれば発生ステージ 24-36

2. BAPN

有精卵一つあたりの

BAPN

BAPN

0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 12.5, 25.0

50.0 mg/ml

BAPN

溶液

100 µl

ED10

3. BAPN

前項に記載の検討で得られた結果から，一卵あたりの

BAPN

350 µg

(3.5 mg/ml

100µl

3

第

1

BAPN

ED10

whole mount

SEM

第

2

BAPN

ED10

whole mount

の形態異常の観察を行った。

第

3

BAPN

続させて

ED5-10

whole mount

の形態異常の観察を行った。

4. whole mount

全胚まるごとの骨・軟骨二重染色は，Kellyと

Bryden (14)によるプロトコ

Yamazaki

7.35; PBS)で調製した 4％パラフォルムアルデヒドに 2

定 を 行 っ た 。 続 い て ， 固 定 液 を

PBS

(AB;

alcian blue 8GX, C.I.74240; 和光純薬)の染色液に一晩浸漬して軟骨の染色

80 ml

99.7％酢酸 20 ml

た溶液に

AB

10 mg

1％水

酸化カリウム(KOH)-70％エタノール溶液に移し，そのまま一晩浸漬して，AB 染 色によって胚内に生じていた低

pH

0.002

(w/v)

(AR; alizarin red S,

C.I.58005; 和光純薬)の染色液に 24

後の鶏胚は, 2％KOH溶液に室温下で

4

0.5％KOH

3:1, 1:1

1:3

8-24

5. 変形骨の単離と SEM

第

1

BAPN

PBS

2.5％グルタールアルデヒドに 2

37℃に加温した 4N KOH

1-3

20

1S;

)

(S-4300;

Hitachi)を用いて，加速電圧 15 kV

成 績

有精卵への

BAPN

BAPN

100 µl)では骨格系異常が出現せず，400 µg/egg

100 µl)ではほぼ全例が致死になると判明した。一方， 250-350 µg/egg の投与(2.5-3.5 mg/ml

100 µl)を受けた鶏胚は，生存率が 50％以上で，骨格系の異常も高い頻度で観察された。このため，以降の本研究

BAPN

350 µg

ED4

BAPN

ED10

AR

zeugopodial segment

fibula

tarsometatarsals

femur

phalanges

観察された後肢骨格要素，下顎部およびその他の部位における変形を

BAPN

14

ectoethmoid (Fig. 4E, F)および椎肋骨 vertebral ribs (Fig.

4G, H)においては，特徴的な変形が観察されたが，これらの出現頻度は 40-

50％程度であった。

次に

BAPN

ED3-9

ED10

Fig. 5

BAPN

BAPN

BAPN

BAPN

BAPN

ED4

BAPN

ED5-10

率を

Fig. 7

では，軟骨性骨格原基の存在を示す

AB

6A)の状態に至ることが

ED4

BAPN

ED10

6A

BAPN

bone

collar

その全表面に，脛足根骨では中央

2/3

1/3

腓骨では観察されなかった。BAPN 非投与群と比べて投与群で特異であった点 は，脛足根骨と足根中足骨の屈曲変形と，これらの屈曲変形で生じた屈筋側凹 部での綿毛状構造の集積であった。光学顕微鏡下では白く不透明にみえる綿毛 状構造は，脛足根骨の屈曲変形の凹部に豊富で，足根中足骨の屈曲変形の凹部 では量的なばらつきはみられるが少量であった。単離された腓骨の形態は，

の腓骨とは異なっていた。この差異は，BAPN 投与群での腓骨形成が，投与群よ りもやや遷延していることを示す。

脛足根骨の屈曲変形凹部の綿毛状構造は，SEM 観察の結果，BAPN 非投与群 の 脛 足 根 骨 等 で も そ の 表 面 を 覆 っ て い る 綿 毛 状 構 造 と 同 様 な 線 維 層 板 骨

fibrolamellar bone

)では，骨面は比較的平滑であり，

BAPN

BAPN

考 察

本研究で得られた知見は，BAPN の投与による骨格要素の変形が発生段階や 部位的に特異な様式で生じることを示している。BAPN を投与された鶏胚では，

屈曲あるいは捻じれなどの変形が，外篩骨，下顎，椎骨，肋骨あるいは後肢骨 格などの特定の骨格要素において生じたが，前肢を含むその他の骨格要素では 異常はとくに観察されなかった。観察された骨格系の変形の中で，メッケル軟 骨の変形は形態的に独特で甚だしかった。しかし，下顎骨については，メッケ ル軟骨とは独立に膜内骨発生で生じることが知られ，その異常や経日的変化が 本研究で扱った発生期間内では顕著でなかった。一方，脛足根骨でみられた屈 曲変形は，それが発生段階や部位的に特異な変形であることが捉え易い状況で あった。部位的な特異性は，２つの点から明瞭であった。まずは，屈曲変形 が，体幹から趾骨へ至る後肢近遠心軸に沿う一連の骨格要素の中で，軛脚部の 骨格(とくに脛足根骨)と足根中足骨に特異的に生じた点である。もうひとつ は，屈曲変形が軛脚部の骨格および足根中足骨それぞれの骨幹中央部で特異的 に生じた点である。これらの変形の部位的出現パターンは，明らかにこれらの 骨格要素の形成時期に関わる時間的出現パターンと関連している。

後肢の骨格系は，体幹部の骨盤から後肢遠位端に位置する趾骨へ，発生プ ログラムが規定する順に従って連続的に形成が進行する(1, 2, 18)。このた め，脛足根骨に特異的に出現した屈曲変形は，この異常が比較的狭い時間的な ウィンドウの中で生じることを示唆している。ウィンドウ枠の開始点は，軟骨 性原基の可視化を本研究では

AB

ED6

AB

(19-21)，発生プログラムが間葉中で脛足根骨の原基を規定するのはそれより

ED8

BAPN

生じる屈曲変形については植松による研究報告(22)にも記載を認めるが，その 解釈はなされていない。本研究の知見からは，ED8 は骨幹中央部での屈曲変形 が生じる条件が終了した時期だと考えることができる。実際，ED9で

BAPN

2

本研究の結果に関しての前段までの解釈や説明は，BAPN 投与によるコラー ゲン分子の架橋構造の減少が骨格要素の強度(硬さ

stiffness)を 25％以上減弱

骨性骨格要素では，骨の改造現象がその機械的強度に影響を及ぼす可能性 も高い。本研究では，BAPN を投与した鶏胚の脛足根骨の内面(髄腔面)に，非投 与の対照群よりも境界明瞭で多くのハウシップ窩が分布することを認めた。こ れは，破骨細胞数やその活性が増大していることを示している。一方，発生中 の骨殻の外表面には多数の骨小窩が観察され，骨基質形成中の骨芽細胞が石灰 化した骨表面に埋入されようとしている状態と考えられた。そうした骨小窩の 数は，屈曲変形の凸面(伸筋側)で乏しく，凹部(屈筋側)で豊富であった。こう

した所見は，凹部を覆う骨膜の骨芽細胞では基質形成が活発なために凹部の線 維層板骨が過形成状態に至っていること，また，凹部骨面に豊富な骨小窩は，

急速で多量の基質産生を担った骨芽細胞が基質に埋入されて骨細胞へ移行する 像だと考えられる。

本研究では，発生中の筋が生む力が骨の変形を増悪させる可能性について 実験的な検証せず考察もしていない。しかし，外界から遮断された静穏な卵内 においては，発生中の微小な筋であっても，BAPN によって機械的強度が低下し た骨の変形を惹起する可能性はある。鶏胚における筋発生と成長の時期(26)，

卵内の筋における収縮活動の亢進時期(27)などが，本研究で観察された骨変形 の出現タイミングと一定の整合性を示す可能性がある。

結 論

卵内の鶏胚にBAPNを投与した後に発生を一定期間継続させ，骨格要素に生 じる異常の特徴，異常形態の再現性，出現経緯，微細構造を精査したところ，

以下の結果と結論を得た。

1.

2.

3.

4.

5. BAPN投与胚の脛足根骨内面には，破骨細胞性の明瞭な吸収窩が多数みられ

以上の結果は，BAPN の投与による骨格要素の変形異常とくに脛足根骨でみ られる屈曲変形は，高い形態的再現性をもって出現し，発生段階や部位的にも 特異性がみられることを示している。また，骨変形の基盤である

BAPN

骨格原基の強度減弱には，骨改造におけるバランスの異常も影響している可能 性が示唆された。

謝 辞

本研究の遂行にあたり，数々のご協力とご助言を賜りました本学部解剖学 第Ⅱ講座 磯川桂太郎教授および同講座の皆さまに謹んで心より感謝申し上げ ます。

文 献

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3

ß-aminopropionitrile

1-16

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Table 1. The observed skeletal deformities induced by BAPN

stylopod

femur fibula tibiotarsus tarso- metatarsals phalanges

1 ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ －

2 － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ －

3 ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ －

4 － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ －

5 － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ －

6 － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ －

7 － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ －

8 ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ －

9 ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ －

10 ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ －

11 ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ －

12 － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ －

13 － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ －

14 ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ －

total 7 14 14 6 0 0 14 14 14 0

** Hindlimb skeleton distal to girdle consists sequentially of 3 segments; stylopodium (femur), zygopodia (fibula and tibiotarsus) and autopodia (3 tarsometatarsals and more distal phalanges).

Em br yo e xa m ine d*

* Embryos were treated by BAPN as in Fig.1A

zeugopod autopod

ectoethmoid cartilage Meckel cartilage cervical vertebra vertebral ribs

Fig. 1

Dosage schedule of BAPN. Three sets of experiments (A, B, C) were performed in this study. The day of BAPN administration is denoted by a closed circle or

‘Ad’ plus ‘embryonic day’, and the day of evaluation (based on specimens stained doubly with AB and AR) is by an open square or ‘Ev’ plus ‘embryonic day’. Therefore, ‘Ad4-Ev10’ stands for a schedule in which BAPN was administered at ED4 and the embryo evaluated at ED10. Please note that ‘Ad4- Ev10’ in parenthesis in B) and C) is basically the same schedule with A).

3 4 5 6 7 8 9 10

Embryonic Days Ad4-Ev10

Ad4-Ev5 Ad4-Ev6 Ad4-Ev7 Ad4-Ev8 Ad4-Ev9 Ad3-Ev10 (Ad4-Ev10)

Ad5-Ev10 Ad6-Ev10 Ad7-Ev10 Ad8-Ev10 Ad9-Ev10

(Ad4-Ev10) Ａ）

Ｂ）

Ｃ）

Fig. 2

Survival rates of BAPN-treated embryos. A hundred µl of BAPN at noted concentration was administered at ED4 and evaluated at ED10. n = 62

Fig. 3

Whole mount preparation of embryo treated with BAPN at ED4 (A) and control untreated embryo (B). Both specimens are doubly stained with AB for cartilage in blue and AR for bone in red at ED10. An arrowhead and double arrowheads in (A) indicate deformities in Meckel cartilage and in tibiotarsus, respectively.

Abbreviations: mc; Meckel cartilage, g; girdle, fe; femur, tt; tibiotarsus, tmt;

tarsometatarsals, pha; phalanges. A scale bar represents 5 mm.

Fig. 4

Representative deformities observed in embryos treated with BAPN at ED4 (A, C, E, G) and control untreated embryo (B, D, F, H). (A, B) Lateral view of hindlimb. Double arrowhead indicates distinct bending of the mid-diaphysis in the bone collar of tibiotarsus. An arrowhead indicates fibula, which is overlapped with tt in (B). fe; femur, tt; tibiotarsus, tmt; tarsometatarsals, pha; phalanges. (C, D) Lateral view of mandibular region in the head. Large dark organ in the top is eye. An arrowhead indicates distorted Meckel cartilage (mc). (E, F) Frontal view of the head. Arrowheads indicate bilaterally- distorted Meckel cartilage (mc), and double arrowheads indicate abnormally curved ectoethomoid cartilage (ee). (G, H) Lateral view of thoracic region.

Arrowheads indicate bending deformities of bone in the vertebral ribs (vr). sp;

scapula, sr; sternal ribs, fe; femur, fi; fibula, tt; tibiotarsus. Scale bars

represents 5 mm.

Fig. 5

Survival rates of BAPN-treated embryos. A hundred µl of BAPN (3.5 mg/ml) was administered at noted day of development and evaluated at ED10. n = 155

Fig. 6

Skeletal deformity of tibiotarsus in BAPN-treated embryos. In ovo administration

(Ad) of BAPN was performed at ED4, 5, 6, 7, 8 and 9 (A, B, C, D, E and F,

respectively), and morphology of skeletal anomaly was observed at ED10 after AB-

and AR-whole mount staining. Arrowheads in Ad4-7 indicate an arced bending

morphology towards the flexor side of the affected tibiotarsus. Arrowheads in

Ad8 indicate two independent bendings at metaphyseal regions. Tibiotarsal

skeleton in Ad9 was straight and appeared unaffected. (closed circle). A scale

bar represents 5 mm.

Fig. 7

Survival rates of BAPN-treated embryos. A hundred µl of BAPN (3.5 mg/ml) was administered at ED4 and evaluated after noted days of development. n = 214

Fig. 8

Skeletal deformity of tibiotarsus in BAPN-treated embryos. In ovo administration

of BAPN was performed at ED4, and morphology of skeletal anomaly was evaluated

(Ev) at ED6, 7, 8 and 9 (A, B, C and D, respectively) after AB- and AR-whole

mount staining. Arrowheads in Ev6 to 9 indicate progressive enhancement of the

arced bending morphology in deformed tibiotarsal skeleton. A scale bar

represents 5 mm.

Fig. 9

Stereomicroscopic images of developing hindlimb bony skeletons isolated from a BAPN-treated embryo (A; Ad4-Ev10) and a comparable untreated embryo at ED10 (B).

Abbreviations: fe; femur, fi; fibula, tt; tibiotarsus, tmt; three yet unfused

tarsometatarsals. A scale bar represents 1 mm.

Fig. 10

Scanning electron micrographs of developing tibiotarsal bone collar isolated

from a BAPN-treated embryo (A, B; Ad4-Ev10) and from a comparable untreated

embryo at ED10 (C). Porous fibrolamellar bone was hyperplastic in the concave

side (B) and lacked in the convex side (A) of tibiotarsal bone, while porous

fibrolamellar bone covers the bone collar of tibiotarsus evenly (C). Arrowheads

indicate lacunae implicating partially embedded osteoblasts in the developing

bone surface. The numbers of lacunae appear more in the concave side including

its trabeculae. Asterisks represent electron-conductive paste for observation

in SEM. Scale bars represent 500 µm.

Fig. 11

Scanning electron micrographs of inner (or medullary) surface of developing

tibiotarsal bone collar from a BAPN-treated embryo (A, C; Ad4-Ev10) and from a

comparable untreated embryo at ED10 (B, D). Compared to control observation (B,

D), abundance of Howship lacunae by osteoclasts (A) and the well demarcated

resorption surface (C) are evident in BAPN-affected bone. Scale bars represent

50 µm (in A, B), 10 µm (in C, D).