か ら ，宿 主 の 感 染 免 疫 シ ス テ ム に 対 し て 様 々 な 影 響 を 及 ぼ し て い る 可 能 性 が あ る ． 本 研 究 で は ， こ の よ う に 複 雑 化 し て い る 感 染 症 の 背 景 を 踏 ま え ， 病 原 真 菌 Aspergillus か ら 菌 体 外 に 放 出 さ れ る 可 溶 性 抗 原 を 調 製 し ，そ の 早 期 診 断 へ の 応 用 の 可 能 性 に つ い て 検 討 し た （ 第 1 章 ）． ま た ， 抗 微 生 物 薬 な ら び に 培 地 成 分 の Aspergillus 菌 体 の 構 造 や 薬 剤 感 受 性 へ の 影 響 を 検 討 し ，薬 物 療 法 の 宿 主 感 染 免 疫 能 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 解 析 し た （ 第 2 章 ）． 【 第 1 章 】 Aspergillus 培 養 上 清 可 溶 性 多 糖 画 分 の 早 期 診 断 へ の 応 用 と 宿 主 機 能 へ の 影 響 第 1 節 Aspergillus 培 養 上 清 可 溶 性 多 糖 成 分 (ASWS) の 調 製 と 早 期 診 断 へ の 応 用 limulus G test は Aspergillosis 患 者 の 早 期
診 断 に 汎 用 さ れ て い る ． Factor G は β-1,3-glucan に よ っ て 活 性 化 さ れ る こ と か ら ，Aspergillosis 患 者 血 中 に は 細 胞 壁 由 来 の β-1,3-glucan が 放 出 さ れ る も の と 推 定 さ れ て い る が 構 造 の 詳 細 は 不 明 で あ る ． そ こ で Aspergillus spp. を 完 全 合 成 培 地 (C-limiting medium) を 用 い て 培 養 し ， Aspergillus 培 養 上 清 可 溶 性 多 糖 画 分 (ASWS) を 調 製 し 解 析 に 用 い た ． A. fumigatus NBRC 30870, 4400, A. niger NBRC 6342 な ら び に A. oryzae NBRC 30103 の 4 株 か ら ASWS を 調 製 し た と こ ろ ， ほ ぼ 同 様 の 収 率 で 得 ら れ た ． NBRC 30870 由 来 の ASWS の 1 H, 1 3C-HSQC NMR を 測 定 し た と こ ろ ，α-1,3-glucan，β-1,3-glucan，galactomannan に 帰 属 さ れ る シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た こ と か ら ， こ れ ら の 多 糖 成 分 を 含 有 す る こ と が 示 唆 さ れ た ． ま た ， ASWS 中 の β-1,3-glucan は limulus G test に 反 応 し ， そ の 濃 度 は Candida の 1/10 程 度 の 濃 度 で あ っ た (Fig. 1)．
第 2 節 Aspergillus 培 養 上 清 可 溶 性 多 糖 成 分 (ASWS) の 抗 原 性
宿 主 免 疫 系 と Aspergillus 菌 体 外 放 出 抗 原 で あ る ASWS と の 相 互 作 用 を 検 討 す る た め に ， ASWS 固 相 化 ELISA 法 に よ り ， ヒ ト 血 清 中 の 抗 ASWS 抗 体 価 を 測 定 し た ．ヒ ト 免 疫 グ ロ ブ リ ン 製 剤 ポ リ グ ロ ビ ン N を 用 い て 抗 ASWS 抗 体 価 を 測 定 し た と こ ろ ，固 相 へ の 吸 着 量 は 濃 度 依 存 的 に 上 昇 し た こ と か ら ，ヒ ト 血 清 中 に 抗 ASWS 抗 体 が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た (Fig. 2)．次 に ，可 溶 性 抗 原 と し て ASWS，ASBG， LPS を 用 い 抗 ASWS 抗 体 の 競 合 ELISA を 行 っ た と こ ろ ， ASWS 添 加 に よ り ， 吸 光 度 は 著 し く 低 下 し ，ASBG で は 低 下 傾 向 を 示 し た ．こ れ ら の 結 果 よ り ，ASWS 中 の β-1,3-glucan， α-1,3-glucan， galactomannan 等 の 多 種 の 成 分 に 対 す る 抗 体 が ヒ ト
Fig. 1. Li mulus activit y of ASWS
血 清 中 に 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た ．
第 3 節 Aspergillus 培 養 上 清 可 溶 性 多 糖 成 分
(ASWS) の 血 中 か ら の 消 失 速 度 の 検 討
ASWS は 感 染 患 者 血 中 に 放 出 さ れ る 抗 原 と 考 え ら れ る こ と か ら ，DBA/2 マ ウ ス に ASWS を i.v. 投 与 し ，limulus G test を 用 い て 血 中 か ら の 消 失 速 度 を 測 定 し た ．そ の 結 果 ，消 失 半 減 期 は 約 15 分 で あ り ， 速 や か に 血 中 か ら 除 去 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た ． こ れ ら の こ と か ら ，ASWS は Aspergillus 症 に お い て ， 血 中 か ら 見 出 さ れ る limulus G test 陽 性 物 質 の 物 性 と 活 性 の 一 端 を 担 っ て い る 成 分 で あ る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た ． 【 第 2 章 】 Aspergillus 症 の 薬 物 治 療 へ の 細 胞 壁 構 成 多 糖 成 分 の 関 与 細 胞 壁 は ， 微 生 物 の 構 造 維 持 な ら び に 生 存 に 極 め て 重 要 な 構 成 要 素 で あ る こ と か ら ， 抗 菌 薬 の タ ー ゲ ッ ト の 一 つ と さ れ て い る ． Aspergillus は 無 性 世 代 に お い て ， 胞 子 ， 分 生 子 ， な ら び に 菌 糸 を 作 る こ と か ら 細 胞 壁 の 構 築 は 複 雑 で あ る ． 菌 糸 の 細 胞 壁 構 成 多 糖 は chitin, α-1,3-glucan な ら び に β-1,3-glucan か ら 主 に 構 成 さ れ て お り ， 分 岐 し な が ら 増 殖 す る こ と か ら ， 各 成 分 の 発 現 は 巧 み に 制 御 さ れ て い る ． 本 章 で は ， 細 胞 壁 の 構 築 な ら び に 成 分 に 影 響 を 与 え る 培 養 環 境 な ら び に 抗 菌 薬 の 影 響 に つ い て 検 討 し た ． 第 1 節 Aspergillus 菌 糸 成 長 に 及 ぼ す 細 胞 壁 構 成 多 糖 添 加 培 養 の 影 響 細 胞 壁 は 剛 体 で あ る が ， 成 長 す る た め に 合 成 と 分 解 を 繰 り 返 し な が ら 増 殖 す る ． そ こ で ， 構 成 多 糖 を 培 地 中 に 添 加 し ， 増 殖 に 影 響 を 与 え る か 否 か を 検 討 し た ．培 地 は C-limiting medium を 用 い ，β-1,3-glucan と し て curdlan ま た は
laminarin を 添 加 し ， A. fumigatus， A. niger， A. oryzae の 増 殖 速 度 の 変 化 に つ い て 検 討 し た ．そ の 結 果 ，curdlan ま た は laminarin の 添 加 に よ り ， 菌 体 の 増 殖 速 度 の 促 進 が 認 め ら れ た (Fig. 3)．こ れ ら の こ と か ら ， 培 地 中 の 多 糖 成 分 ， 特 に β-1,3-glucan は 細 胞 壁 の 構 築 に 著 し く 影 響 す る こ と が 明 ら か と な っ た ．
Fig. 3. Colonies o f A. fumigatus in the presence of β-glucan on agar plate
Fig. 2. Anti-ASWS antibody t iter
第 2 節 Aspergillus の 病 原 性 に 及 ぼ す 抗 微 生 物 薬 の 影 響
深 在 性 真 菌 症 は ， が ん 患 者 等 の 易 感 染 患 者 に 対 し て 発 症 す る こ と が 多 い ． そ の よ う な 状 況 に お い て は 複 合 感 染 も 稀 で は な く ， 抗 ウ イ ル ス 薬 と 抗 真 菌 薬 が 同 時 に 投 与 さ れ る 場 合 が あ る ． 薬 物 相 互 作 用 は 様 々 な ケ ー ス で 起 き て い る こ と か ら ， 抗 ウ イ ル ス 薬 と 抗 真 菌 薬 の 相 互 作 用 に つ い て 検 討 す る こ と と し た ．
培 地 は C-limiting medium を 用 い ， 抗 ウ イ ル ス 薬 存 下 に ， Aspergillus を 培 養 し ， 形 態 変 化 を 検 討 し た ． そ の 結 果 ， 抗 ウ イ ル ス 薬 存 下 に お い て 菌 体 の 増 殖 促 進 が 認 め ら れ た ．次 に ，抗 ウ イ ル ス 薬 を 添 加 し て 培 養 し た A. fumigatus に 抗 真 菌 薬 を 添 加 し ， 菌 体 の 成 長 ， 薬 剤 感 受 性 に つ い て 解 析 し た と こ ろ 、 感 受 性 が 低 下 し た ． 次 に こ れ ら の 菌 体 に 対 す る マ ク ロ フ ァ ー ジ 応 答 の 違 い を マ ウ ス 腹 腔 滲 出 細 胞 を 用 い て 検 討 し た と こ ろ 、 処 理 菌 体 の 活 性 酸 素 種 産 生 能 が 向 上 し た ． こ れ ら の こ と か ら ，抗 ウ イ ル ス 薬 添 加 培 養 に よ っ て ，Aspergillus 菌 体 の 細 胞 壁 構 成 ， 形 態 に 影 響 を 与 え ， そ れ ら が 白 血 球 の 活 性 化 能 に 影 響 し ， 炎 症 応 答 に 違 い を 生 じ る 可 能 性 が あ る こ と が 示 唆 さ れ た ． 【 総 括 】
Aspergillus 菌 体 外 に 放 出 さ れ る limulus G test 陽 性 抗 原 で あ る ASWS は α-1,3-glucan， β-1,3-glucan， な ら び に galactomannan を 主 構 成 多 糖 と す る こ と を 明 ら か に し た ． さ ら に ， ヒ ト 血 清 中 に は ASWS に 対 す る 特 異 抗 体 が 含 ま れ ， 抗 原 性 は β-1,3-glucan 部 分 の み な ら ず 他 の 多 糖 成 分 も 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た ．ま た ， マ ウ ス モ デ ル を 用 い ASWS は 血 中 か ら 速 や か に 消 失 す る こ と が 明 ら か と な っ た ． こ れ ら の こ と か ら ， ASWS は 宿 主 免 疫 系 に 対 し て 作 用 す る 病 原 関 連 分 子 (PAMPs) と し て の 機 能 を 備 え て い る と 考 え ら れ ， Aspergillus に よ る 深 在 性 真 菌 症 に 対 す る 診 断 ， 治 療 を 行 う 上 で 有 力 な 因 子 に な り う る 可 能 性 が あ る ． Aspergillus の 培 養 時 に 抗 ウ イ ル ス 薬 を 共 存 さ せ る と ， 菌 体 の 増 殖 が 促 進 し ， ASWS の 産 生 量 が 高 ま っ た ．さ ら に ，共 存 下 に 得 ら れ た 菌 体 に お い て は マ ク ロ フ ァ ー ジ の 活 性 酸 素 産 生 能 が 上 昇 し た ． ま た ， 抗 ウ イ ル ス 薬 を 共 存 さ せ る と ， 抗 真 菌 薬 に 対 す る 感 受 性 が 低 下 す る こ と を 見 出 し た ． 高 度 医 療 の 進 歩 に 伴 い 感 染 症 も 複 雑 化 し て い る ． 生 体 内 に お け る 複 数 の 医 薬 品 同 士 の 相 互 作 用 は 臨 床 に お い て 非 常 に 重 要 な 問 題 で あ る が ， 本 研 究 に よ っ て ， 複 数 の 抗 微 生 物 薬 が 病 原 真 菌 Aspergillus を 介 し た 相 互 作 用 を 示 し た ． こ れ ら の こ と は ， 臨 床 に お い て ， よ り 安 全 で 適 切 な 医 療 を 提 供 す る う え で 新 た な 重 要 な 点 で あ る と 考 え ら れ る ． 【 研 究 結 果 の 掲 載 誌 】
