活性酸素によるRB タンパクの酸化を介した細胞周期停止

岡 山 医 学 会 雑 誌 第117巻January2006,PP.187-191

平成16年度岡山医学会賞(林 原賞)受 賞論文

活 性酸 素 に よるRBタ

ンパ クの酸化 を介 した細胞 周期 停 止

寳 迫 睦 美*,荻 野 哲 也,岡 田 茂 岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 病態探究医学 キ ー ワ ー ド:細 胞 周 期,RBタ ンパ ク,活 性 酸 素,モ ノ ク ロ ラ ミン,酸 化 ス トレ ス は じ め に 正 常 の 体 細 胞 の 細 胞 周 期 は 厳 密 に 制 御 さ れ て お り, 多 くの 細 胞 は 休 止 期 に あ る.し か し,炎 症 や 創 傷 治 癒 の 際 に は,種 々 の 細 胞 が 分 裂,増 殖 を 開 始 し,組 織 修 復 に 関 わ る.こ の 反 応 は,サ イ トカ イ ン や 増 殖 因 子 に よ っ て 調 節 さ れ て い る.一 方,炎 症 の 際 に は 活 性 化 好 中 球 や マ ク ロ フ ァ ー ジ か ら活 性 酸 素 が 産 生 さ れ,こ れ ら の 活 性 酸 素 は,細 胞 周 期 に 影 響 を 与 え,炎 症 反 応 や 組 織 修 復 を修 飾 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る. 私 た ち は,活 性 化 好 中 球 に 由 来 し て 生 理 的 に 産 生 さ れ る オ キ シ ダ ン トで あ る モ ノ ク ロ ラ ミン(NH2Cl)が, T細 胞 性 白 血 病 細 胞 株Jurkat細 胞 に 対 してG1arrest を 誘 起 す る こ と を観 察 し,そ の 細 胞 周 期 の 機 構 解 析 を 行 っ て い る.そ こ で,今 回 は こ のNH2Clが 血 液 の ガ ン で あ る 白 血 病 細 胞 に ど の よ う に 影 響 を 与 え る の か, 活 性 酸 素 が 細 胞 周 期 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 概 説 す る. モ ノ ク ロ ラ ミ ン(NH2CI)と は 私 た ち は 炎 症 の 際 に 産 生 さ れ る オ キ シ ダ ン ト,中 で も ク ロ ラ ミ ン に 注 目 し て 研 究 を続 け て い る.グ ロ ラ ミ ン の 中 で も細 胞 膜 透 過 性 の モ ノ ク ロ ラ ミン(NH2Cl) は 好 中 球 由 来 の オ キ シ ダ ン トで,サ イ トカ イ ン な ど に よ る 細 胞 接 着 分 子 や レ セ プ ター の 発 現,細 胞 周 期,ア ポ トー シ ス な ど を修 飾 す る こ と が で き る.こ の 研 究 に 用 い て い るNH2Clの 作 用 機 序 に つ い て は,当 教 室 の 荻 野 講 師 が 意 欲 的 に 研 究 を 続 け て こ ら れ,現 在 も そ の 機 能 を研 究 中 の オ キ シ ダ ン トで あ る1). と こ ろ で ク ロ ラ ミ ン とい う も の に あ ま り耳 慣 れ な い 方 も 多 い と思 わ れ る が,こ れ は 好 中 球 の ス ー パ ー オ キ サ イ ドに 由 来 し て 生 理 的 に 産 生 さ れ る オ キ シ ダ ン トの 一 つ で あ る(図1) _{.ス ー パ ー オ キ サ イ ドは 不 均 化 反 応} に よ っ て 過 酸 化 水 素 を 作 り,こ れ は ミエ ロ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ に よ っ て 次 亜 塩 素 酸 へ と代 謝 さ れ る.次 亜 塩 素 酸 は 周 囲 の ア ミ ノ化 合 物 と反 応 し,ク ロ ラ ミン を 形 成 す る. 表1は ク ロ ラ ミン の 性 質 を ま と め た も の で あ る が, ク ロ ラ ミ ン は オ キ シ ダ ン ト と し て 作 用 し,チ オ ー ル 基, チ オ エ ー テ ル 基 を好 ん で 酸 化 し,細 胞 膜 透 過 性 の もの が 存 在 し,生 体 内 で 比 較 的 高 い 濃 度 に 産 生 さ れ る こ と が 考 え ら れ る(活 性 化 好 中球 は 短 時 間 で100μM程 度 の ク ロ ラ ミ ン を産 生 す る).ま た,DNA修 復 の 抑 制,サ イ トカ イ ン産 生 抑 制,PKC活 性 化 抑 制 な ど の 生 物 学 的 活 性 を持 つ こ と も認 め られ て お り2-4),近年 で はH.pylori 感 染 に 伴 う ク ロ ラ ミ ン 産 生 と細 胞 障 害 が 注 目 さ れ て い る5).従 っ て,ク ロ ラ ミ ン は 炎 症 の 場 で 情 報 修 飾 分 子 と 平 成17年8月 受 理 *〒700-8558岡 山 市 鹿 田 町2-5-1 電 話:086-235-7147FAX:086-235-7148 E-mail:[email protected] ◆ プ ロ フ ィ ー ル ◆ 寳迫 睦 美 平成16年3月 岡 山大 学 大学 院 医 学研 究 科修 了後,同 年6月 よ り岡 山大 学大 学 院 医歯 学 総 合研 究 科(現 医歯 薬 学 総 合 研 究 科)病 態 探 究 医学 教 室 の助 手 とな り,現 在 に至 る.今 回の 受 賞論 文 は,博 士 課 程 在籍 中の4年 間 に病 態 探 究 医 学(旧 第 一 病理)教 室 で行 っ た研 究成 果 を ま とめ た もの で,博 士号 を取 得 した学 位 論文 であ る.こ の 研 究 内容 で,2003年12月,International joint meeting on food factors and free radica-s in health and diseasesに お いて,Poster Award(Young Investigator Award)を 受 賞 し,2004年11月,日 本 白血 病 研 究基 金 よ りKYO特 別 研 究 賞 を 受賞 した.こ の 研 究 を行 うに あ た り,当 教 室 の 岡 田茂 名 誉教 授(今 年 の春 に退 官 され ま した)に は, 何 度 も励 ま してい た だ き ま した.岡 田 先 生の 何 事 に対 して も熱 意 を もっ て前 向 きな姿 勢 に は心 を打 た れ感 銘 を う

け ま した.ま た,荻 野 哲 也 講 師 に 直接 ご指 導 いた だ きま した おか げ で今 回の 受 賞論 文 を ま とめ る こ とが 出来 ま し た.そ して,病 態探 究 医学 教 室の 皆 様 に は お世 話 に な りま した.心 よ りお礼 申 し上 げ ます.

し て 作 用 し,免 疫 反 応,組 織 の 修 復,細 胞 増 殖,発 癌 な ど に 影 響 を与 え る可 能 性 が 示 唆 さ れ る. 今 回 は,細 胞 膜 透 過 性 で あ る ア ン モ ニ ア モ ノ ク ロ ラ ミン の こ と を モ ノ ク ロ ラ ミ ン(NH2Cl)と す る.本 研 究 で は,こ のNH2C1を 用 い て 細 胞 周 期 に 及 ぼ す 影 響, 及 び そ の 機 序 に つ い て 検 討 を行 っ た. NH2Clよ る 細 胞 周 期 の 制 御 細 胞 周 期 は 細 胞 増 殖 の 制 御 に お け る シ グ ナ ル 伝 達 の 最 終 段 階 を担 う も の で,そ の 異 常 は 癌 を は じめ と し た 多 くの 疾 患 の 発 症 に 関 わ る.細 胞 が 増 殖 し て い る 際 に は 細 胞 周 期 も進 行 し て い る た め,細 胞 周 期 の 変 化 は 正 常 の 細 胞 回 転 の み な らず,炎 症 の 修 復 反 応 や あ る 種 の 抗 癌 剤 の 効 果 に も影 響 を 与 え る.従 っ て,細 胞 周 期 の 制 御 が ど の よ う に な っ て い る か 知 る こ と は,そ の 成 因 や 治 療 法 を考 え る上 で 重 要 で あ る. 最 近,私 た ち は 炎 症 由 来 の 活 性 酸 素 で あ るNH2Clが, Jurkat細 胞 の 細 胞 周 期 をG1期 で 停 止 させ る こ と を 見 出 し た6).さ ら に,こ のNH2Clに よ る細 胞 周 期 の 停 止 が 普 遍 的 な 現 象 で あ る の か 検 討 を行 っ た 結 果,T細 胞 性 白血 病 細 胞 株JurkatT細 胞,前 骨 髄 球 性 白血 病 細 胞 株HL-60細 胞,肝 癌 細 胞 株JHH5細 胞 の い ず れ も NH2C1投 与(70μM,10分)24時 間 後 に は 細 胞 周 期 に 影 響 が 見 ら れ た が,そ の 効 果 は 一 様 で は な く,Jurkat, HL-60細 胞 で はG1arrestが 主 体 と考 え ら れ た の に 対 し,JHH5細 胞 で は,よ り高 濃 度 のNH2ClでG2arrest と思 わ れ る変 化 が 見 られ た.こ の こ とか ら,NH2C1に よ る細 胞 周 期 の 停 止 は 普 遍 的 な 現 象 で は な く,細 胞 株 に よ っ て 感 受 性 が 異 な っ て い る こ とが 示 唆 さ れ た. 表1  ク ロ ラ ミン(R-NHCI)の 性 質 NH2Clに よ るpRBの リ ン 酸 化 の 抑 制 細 胞 周 期 をG1期 で 抑 制 的 に 制 御 して い る有 名 な 癌 抑 制 遺 伝 子 産 物 の 一 つ で あ るRetinoblastoma protein (pRB)は,細 胞 周 期 のG1期 か らS期 へ の 移 行 を抑 制 的 に 制 御 して い る7).pRBの 働 き を簡 単 に 説 明 す る と,こ の 蛋 白 は い ろ い ろ な リ ン 酸 化 状 態 を 取 る こ と で 機 能 を調 節 して い る.活 性 なpRBは 転 写 因 子E2Fを 結 合 し,E2Fに よ っ て 転 写 が 促 進 さ れ るS期 に 必 要 な 蛋 白 合 成 を 抑 制 し て い る(図2).Cyclin-dependent kinase(Cdk)に よ っ てpRBが リ ン 酸 化 を受 け る と, pRBはE2Fを 遊 離 し,細 胞 はS期 へ と進 行 す る.つ ま り,リ ン 酸 化 を あ ま り受 け て い な い状 態 で は 転 写 因 子E2Fと 結 合 し こ の 機 能 を抑 制 す る た め,転 写 は 起 こ ら な い.と こ ろ がpRBが 強 く リン 酸 化 を受 け る とE2F を遊 離 し て 転 写 が 開 始,細 胞 はS期 へ と進 行 す る.こ の よ う に,pRBは 正 常 細 胞 に お い て 細 胞 周 期 の 制 御 に 不 可 欠 な 役 割 を 果 た し て い る.白 血 病 の 細 胞 株 で あ る Jurkat細 胞 で は,通 常pRBは 強 く リ ン 酸 化 を受 け て お り,そ の た め 細 胞 は ど ん ど ん 増 殖 して い る状 態 に あ る. そ こ で,G1arrestが 示 唆 され たJurkat細 胞 を用 い て さ ら に 解 析 を行 っ た.G1チ ェ ッ ク ポ イ ン トを制 御 し て い るpRBの 量 と そ の リン 酸 化 状 態 を検 討 す る と, NH2Clを70μM投 与 後1.5時 間 か ら3時 間 目 でpRB は 高 リン 酸 化 型 が 減 少 し,低 リ ン 酸 化 型 が 増 加 し た. さ ら に そ の リ ン 酸 化 の 状 態 をpRBの リ ン 酸 化 抗 体 で 検 討 す る と,特 にSer780,Ser795の 部 位 の 脱 リ ン酸 化 が 顕 著 に 見 ら れ,Ser807/811の 脱 リ ン 酸 化 は 明 ら か で な か っ た. ま た 図3の よ う に,こ の メ カ ニ ズ ム に 関 与 し て い る と 思 わ れ る サ イ ク リ ン(Cyclin),Cdkタ ン パ ク の 発 現 の 有 無 を 確 認 す る と,細 胞 周 期 関 連 蛋 白 で は,CyclinA, B,D3,Cdk1,2,6,及 びp27KiP1が 検 出 さ れ た が, 発 現 レ ベ ル に 著 変 は 見 ら れ ず,Cyclin D1,D2,及 び Cdk4,p16INK4a,p21ciP1は 検 出 さ れ な か っ た. 特 別 な タ ン パ ク 質 へ の リン 酸 基 の 付 加 や 除 去 は,細 胞 に 特 定 の 状 態 変 化 を 引 き起 こ す シ グ ナ ル に 対 応 し て 起 き る こ とが 多 い た め,pRBを リ ン 酸 化,脱 リ ン 酸 化 す る酵 素 活 性 の 変 化 に つ い て さ ら に検 討 を行 っ た.pRB に リ ン酸 基 を付 加 す る リ ン酸 化 反 応 を 触 媒 す る の は タ ン パ ク キ ナ ー ゼ(protein kinase)で,逆 に リ ン 酸 基 を 取 り除 く脱 リン 酸 化 反 応 を触 媒 す る の は タ ン パ ク ホ ス

活性 酸素 に よ る細 胞周 期停 止機構 の解 析:寳 迫睦 美,他2名

図1  活 性 化 好 中 球 に よ る オ キ シ ダ ン トの 産 生

図2  Retinoblastoma protein(pRB)に よ る 細 胞 周 期 の 調 節

図3  細 胞周期 の 調節機 構

フ ァ タ ー ゼ(protein phosphatase)で あ る が(図2), 結 果 と し て,phosphatase活 性 に 軽 度 の 上 昇 が 見 られ る ほ か は 有 意 な 変 化 は 認 め られ な か っ た. NH2Clに よ るpRBの 直 接 的 な 酸 化 一 方 ,Recombinant pRBを 試 験 管 内 に お い て NH2Clで 酸 化 し た 後,細 胞 の 溶 解 液 で リ ン 酸 化 させ る と,酸 化 し たpRBで は 特 にSer780とSer795の リ ン 酸 化 が 起 こ りに く くな っ て い た(Ser807/811の リン 酸 化 に は 著 変 は な か っ た).こ の 結 果 か ら,NH2Clに よ るpRBの 直 接 的 な 酸 化 がpRBの 脱 リ ン 酸 化 と細 胞 周 期 停 止 の 主 要 な 原 因 で あ る こ とが 示 唆 さ れ,さ ら に 酸 化 し たpRBの ア ミ ノ酸 分 析 を 行 う と,メ チ オ ニ ン が メ チ オ ニ ン ス ル ホ キ シ ドへ 酸 化 さ れ て い た.NH2Cl 処 理 し たJurkat細 胞 の 蛋 白 で も メ チ オ ニ ン の 減 少 が 見 ら れ,一 方SH基 に も有 意 な 変 化 が 見 ら れ ず,メ チ オ ニ ン の 酸 化 がpRBの 機 能 修 飾 に 重 要 と考 え られ た. メ チ オ ニ ン の 酸 化 は 加 齢 や 炎 症 性 疾 患 な ど で 報 告 さ れ て い る の で8),pRBの 酸 化 的 修 飾 に伴 う 細 胞 周 期 の 変 化 が こ れ ら の 病 態 で 生 じ て い る 可 能 性 が あ る. 活1生化 好 中 球 が 細 胞 周 期 に 与 え る 影 響 NH2Clは,過 酸 化 水 素-MPO-ハ ラ イ ド系 で 産 生 さ れ る 次 亜 塩 素 酸(HOCI)と ア ン モ ニ ウ ム イ オ ン(NH4+) が 反 応 し て 生 成 さ れ る オ キ シ ダ ン トで あ る.し か し, HOCIは ア ミ ノ化 合 物 の み な らず,核 酸 や 脂 質 を含 む 種 々 の 物 質 と反 応 す る.生 体 内 で はNH4+の 他 にHOCl と反 応 す る分 子 が 多 数 存 在 す る た め,正 常 血 清 レベ ル のNH4+で はNH2Clの 産 生 量 は 必 ず し も多 くな い と 考 え る.表2は,NH2ClとHOCIの 反 応 性 の 違 い を 表2  モ ノ ク ロ ラ ミ ン(NH2C1)と 次 亜 塩 素 酸(HOCI)の 反 応 性 示 し た も の で あ る が,こ の よ う に,NH2ClはHOC1に 比 べ て 反 応 す る分 子 に 選 択 性 が あ る こ とが 伺 え る. そ こ で,HOCI及 び 活 性 化 好 中 球 に 由 来 す る 活 性 酸 素 が,Jurkat細 胞 の 細 胞 周 期 に 与 え る影 響 と,こ れ に 対 す るNH4+の 効 果 を 検 討 し た.す る と,HOCl (200μM,10分)で は 細 胞 周 期 に 影 響 を 与 え な か っ た が,こ こ に1∼2mMのNH4+を 共 存 して お く と, NH2Clで 見 られ たG1期 で の 細 胞 周 期 停 止 が 実 際 に 観 、 察 さ れ た. 生 体 内 で は 唾 液9),Helioobacter pylori感 染 の あ る 胃 液10),大 腸 内 容11)な ど に 数 ∼ 数 十mMレ ベ ル のNH4+ が 存 在 し て い る.特 にH.pylori胃 炎 や 炎 症 性 腸 疾 患 で は 好 中 球 浸 潤 が 目立 つ の で,こ れ ら の 疾 患 の 際 に は NH2Clが 局 所 で 産 生 さ れ て い る と考 え られ る. ま と め 活 性 化 好 中 球 が 産 生 す る生 理 的 オ キ シ ダ ン トで あ る NH2Clが 細 胞 周 期 に 与 え る影 響 及 びG1期 で の 細 胞 周 期 停 止 の 機 構 に つ い て 検 討 した 結 果,NH2ClはJurkat 細 胞 でG1期 で の 細 胞 周 期 停 止 を もた ら し,こ れ はpRB の 脱 リ ン酸 化 に よ る もの と考 え ら れ た.さ らに,NH2C1 で 酸 化 し たRecombinant pRBは リン 酸 化 を 受 け に く く な っ て お り,ア ミ ノ 酸 分 析 の 結 果,メ チ オ ニ ン の 酸 化 が 確 認 さ れ た.以 上 の こ と よ り,pRBの 直 接 的 な 酸 化 がNH2C1に よ るpRBの 脱 リン 酸 化 と細 胞 周 期 停 止 の 主 要 な 原 因 で あ る こ と が 示 唆 さ れ る.今 後 は 活 性 酸 素 に よ っ て 酸 化 修 飾 さ れ たpRBの 生 理 機 能 ・機 能 変 化 に つ い て さ ら に解 析 を行 い,そ の 作 用 機 序 の 解 明 に努 め た い. 今 後 の 展 望 pRBお よ び 複 合 体 の リン 酸 化 修 飾 を介 し た 細 胞 周 期 の 制 御 つ い て は 数 多 く報 告 さ れ て い るが12),こ のpRB の 酸 化 機 構 に つ い て は私 た ち の 報 告(Hosakoe tal, FRBM,2004)以 外 に 報 告 は な く,独 創 性 に 富 ん で い る.今 後 さ ら にpRBの 酸 化 修 飾 機 構 を解 析 し て い き, 新 し い 創 薬 の ター ゲ ッ トの 発 見 お よ び 疾 患 発 症 の 病 態 機 構 の 解 明 へ とつ な げ た い. 私 は 大 学 院 を ま だ 卒 業 し た ば か りで,研 究 者 と して は ま だ ス タ ー ト ラ イ ン に 立 っ て い る状 態 だ が,こ れ ま で に 大 学 院 で 得 た 知 見 及 び 取 得 し た 技 術 を も っ て,頑 張 っ て い き た い.研 究 は 実 際 に 実 験 を行 っ て い る現 場 に こ そ,新 た な発 見 が あ る.長 時 間 に わ た る実 験,試

活 性酸 素 に よる細胞 周期停 止機 構 の解析:寳 迫 睦美,他2名 行 錯 誤 な ど,研 究 に は 忍 耐 力 が 必 要 と さ れ る が,一 つ で も 多 くの 新 し い 発 見 が 出 来 る よ う に,ま た 一 つ で も 多 くの 病 気 の 原 因 を解 明 す る こ と が 出 来 る よ う に,基 礎 医 学 的 な 研 究 の 観 点 か ら 貢 献 し て い き た い. 謝 辞 この研 究 を行 うに あた り,病 態探究 医学 教室 の ス タ ッフの皆 様,岡 山大 学 医学部 共 同実験 室 の皆様 に は大変 お世 話 に な りま した.御 礼 申 し上 げ ます. また この研 究 内容 は,平 成16年 度公 益信 託 日本 白血病 研究 基 金 よ り研 究助 成 を受 け た.本 年度 は,現 在 までに(財)岡山医学 振 興会,(財)川崎医 学 ・医療福 祉 学振 興会 よ り,平 成17年 度研 究 助 成 を受 けて い る. 文 献

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