Title ウマの骨および関節軟骨に対する生体組織工学を用いた再生医療の応用に関する研究( 本文(Fulltext) ) Author(s) 都築, 直 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 甲第402号 Issue Date 2013-09-24 Type 博士論文 Version ETD URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/47366 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
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GM Gelatin hydrogel Microsphere HE Hematoxylin Eosin
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PDGF Platelet Derived Growth Factor PRP Platelet Rich Plasma
PTHrP Parathyroid Hormone-related Protein ROI Region of Interest
RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction TGF-ß1 Transforming Growth Factor-ß1
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12 ࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢆ100 mM ࡢࢢࣜࢩࣥỈ⁐ᾮ 37 °C ࡛ 1 㛫ᾐₕࡉࡏ㸪ṧᏑࡋ࡚ ࠸ࡿࣝࢹࣄࢻᇶ࡞ࡽࡧࢢࣝࢱࣝࣝࢹࣄࢻࢆάࡋࡓࠋࡑࡢᚋ㸪㉸⣧Ỉ࡛Ὑί ࡋ㸪⤖⇱ࢆᐇࡋࡓࠋస〇ࡉࢀࡓ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪࡣ㟁Ꮚ㢧ᚤ㙾ࢆ⏝࠸࡚ほᐹࡋ㸪 Ꮝ㝽⋡ࡢ⟬ฟࢆ⾜ࡗࡓ㸦106㸧ࠋ௨ୖࡢ᧯స࡛㸪ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪ 㸦IEP 9.0㸪ྵỈ⋡ 97.8 %㸪 β-TCP ྵ᭷⋡ 50 %㸪Ꮝ㝽⋡ 95.9 %㸪Ꮝᚄ 179.1 ± 27.8 μm㸪10.0 mm × 10.0 mm × 20.0 mm㸧 ࢆస〇ࡋࡓ㸦Figure 1-1㸧ࠋ 㸲㸧BMP-2 ⏝ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺࡢస〇 ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺࡢస〇ࡣ㸪Tabata ࡽࡢ᪉ἲ‽ࡌ࡚ᐇࡋࡓ㸦103㸧ࠋ BMP-2 ࡣ IEP 9.0 ࡢࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࡀ㐺ࡋ࡚࠸ࡿሗ࿌㸦122㸧ࡉࢀ࡚࠸ࡿࡓ ࡵ㸪BMP-2/ࢩ࣮ࢺ⏝ࡢࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺࡣ∵㦵⏤᮶ࣝ࢝ࣜฎ⌮ࢮࣛࢳࣥ 㸦IEP 9.0㸪᪂⏣ࢮࣛࢳࣥ㸧ࢆ⏝࠸࡚స〇ࡋࡓࠋࡲࡎ㸪ࢮࣛࢳࣥࢆ㉸⣧Ỉ⁐ゎࡋ㸪37 °C ຍ ࡋ࡞ࡀࡽᨩᢾࡍࡿࡇ࡛3 wt %ࢮࣛࢳࣥỈ⁐ᾮࢆస〇ࡋࡓࠋࡇࡢࢮࣛࢳࣥỈ⁐ ᾮ800 μl ࢆ࣏ࣜࣉࣟࣆࣞࣥ〇ࢺ࣮ࣞὶࡋ㸪4 °C ࡛ 12 㛫ࡅ࡚ᅛࡉࡏࡿࡇ࡛ ᮍᯫᶫࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢆᚓࡓࠋࡇࡢᮍᯫᶫࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢆ0.16 wt % ࢢࣝࢱࣝࣝࢹࣄࢻỈ⁐ᾮᾐₕࡉࡏ㸪4 °C ࡛ 12 㛫ᯫᶫࡍࡿࡇ࡛ྵỈ⋡ࢆ 97.8 % ࡋࡓࠋᯫᶫᛂ⤊ᚋ㸪100 mM ࡢࢢࣜࢩࣥỈ⁐ᾮᐊ ࡛ 1 㛫ᾐₕࡉࡏ㸪ṧᏑ ࡋ࡚࠸ࡿࣝࢹࣄࢻᇶ࡞ࡽࡧࢢࣝࢱࣝࣝࢹࣄࢻࡢάࢆᐇࡋࡓࠋࡇࡢࢮࣛࢳ ࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺࢆᐊ ࡛㸯㛫㸪㉸⣧Ỉ࡛ὙίࡋࡓࠋࡇࡢὙίసᴗࡣ2 ᅇ⧞ࡾ ㏉ࡋᐇࡋࡓࠋὙίᚋ㸪ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺࡣᾮయ❅⣲୰࡛⤖⇱ࡋࡓࠋ ௨ୖࡢ᧯సࡼࡾ㸪BMP-2 ྵᾐ⏝ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺ㸦IEP 9.0㸪ྵỈ⋡ 97.8 %㸪 10.0 mm × 10.0 mm × 1.0 mm㸧ࢆస〇ࡋࡓ㸦Figure1-1㸧ࠋ 㸳㸧bFGF ⏝ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺࡢస〇
13 bFGF ⏝ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺࡶࡲࡓ㸪Tabata ࡽࡢ᪉ἲ‽ࡌ࡚స〇ࡋࡓ 㸦103㸧ࠋbFGF ࡣ IEP 5.0 ࡢࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࡀ㐺ࡋ࡚࠸ࡿሗ࿌㸦121㸧ࡉࢀ ࡚࠸ࡿࡓࡵ㸪ᮏ◊✲࡛ࡣbFGF/ࢩ࣮ࢺ⏝ࡢࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺࡣ∵㦵⏤᮶ ࣝ࢝ࣜฎ⌮ࢮࣛࢳࣥ㸦IEP 5.0㸪᪂⏣ࢮࣛࢳࣥ㸧ࢆ⏝࠸࡚స〇ࡋࡓࠋࡲࡎ㸪BMP-2 ྵᾐ ⏝ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺస〇ྠᵝࡢ᧯సࡼࡾ10 wt %ࢮࣛࢳࣥỈ⁐ᾮࢆᅛ ࡍࡿࡇ࡛㸪ᮍᯫᶫࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢆᚓࡓࠋࡇࡢᮍᯫᶫࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤ ࣝࢆࢢࣝࢱࣝࣝࢹࣄࢻỈ⁐ᾮ㸦12.4 μg/ml㸧ᾐₕࡉࡏ㸪4 °C ࡛ 24 㛫ᯫᶫࡍࡿࡇ ࡛ྵỈ⋡ࢆ97.8 %ࡋࡓࠋᯫᶫᛂ⤊ᚋ㸪BMP-2 ྵᾐ⏝ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ ࣮ࢺస〇ྠᵝࡢ᧯సࡼࡾ㸪Ὑί࠾ࡼࡧ⤖⇱ࢆ⾜ࡗࡓࠋ௨ୖࡢ᧯స࡛㸪bFGF ྵᾐ⏝ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺ㸦IEP 5.0㸪ྵỈ⋡ 97.8 %㸪10.0 mm × 10.0 mm × 1.0 mm㸧ࢆస〇ࡋࡓࠋ 㸴㸧BMP-2 ⁐ᾮ࡞ࡽࡧ bFGF ⁐ᾮࡢㄪᩚ ࡇࢀࡽ2 ✀ࡢᡂ㛗ᅉᏊ⁐ᾮࡢㄪᩚࡣ㸪Sasaki ࡽࡢ᪉ἲ‽ࡌ࡚ᐇࡋࡓ㸦90㸧ࠋBMP-2 ࡣࣄࢺ⤌ࡳ᭰࠼BMP-2㸦Recombinant human BMP-2㸪PEPROTECH INC㸪USA㸧ࢆ㸪 bFGF ࡣࣄࢺ⤌ࡳ᭰࠼ bFGF㸦ࣇࣈࣛࢫࢺ®ࢫࣉ࣮ࣞ250㸪⛉◊〇⸆㸪᪥ᮏ㸧ࢆ⏝࠸ࡓࠋ ᭱ึ㸪⁛⳦ࡋࡓࣇࣝࢱ࣮ࢳ࣮ࣗࣈ㸦ULTRAFREE®-0.5㸪MILLPORE㸪USA㸧ࡢࣇ ࣝࢱ࣮⁛⳦⏕⌮㣗ሷᾮ500 μl ࢆຍ࠼㐲ᚰ㸦12,000 × g㸪4 °C㸪10 min㸧ࡋ㸪ℐ㐣ࡉ ࢀࡓᾮయ࠾ࡼࡧࣇࣝࢱ࣮ࢳ࣮ࣗࣈෆࡢᾮయࢆࣆ࣌ࢵࢺࡼࡾ㝖ཤࡍࡿࡇ࡛㸪ࣇ ࣝࢱ࣮ࢳ࣮ࣗࣈࡢὙίࢆᐇࡋࡓࠋࡑࡢᚋ㸪BMP-2 ࡞ࡽࡧ bFGF ࢆ⁐ゎࡉࡏ ࡿࡓࡵ㸪ࡑࢀࡒࢀࢆ300 μl ࡢ⁛⳦⏕⌮ⓗ㣗ሷᾮ⁐ゎࡋࡓࠋࡇࡢ⁐ᾮࢆ 500 μl ࡲ࡛ ࣓ࢫࢵࣉࡋࡓᚋ㸪ඛ㏙ࡢὙί῭ࡳࣇࣝࢱ࣮ࢳ࣮ࣗࣈ⛣ࡋ㸪12,000 × g㸪4 °C ࡛ 50 μl ⃰⦰ࡉࢀࡿࡲ࡛㐲ᚰࢆᐇࡋࡓࠋ௨ୖࡢ᧯సࡼࡾ㸪0.2 μg/μl ࡢ BMP-2 ⁐ᾮ 㸦60㸧࡞ࡽࡧ 5 μg/μl ࡢ bFGF ⁐ᾮ㸦90㸧ࢆస〇ࡋࡓࠋ
14 㸵㸧BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ࡞ࡽࡧ BMP-2/ࢩ࣮ࢺࡢస〇 㸴㸧࡛స〇ࡋࡓBMP-2 ⁐ᾮࡽ 15 μl ࡎࡘࢆ 3 ಶࡢ᪂つ࢚ࢵ࣌ࣥࢳ࣮ࣗࣈྲྀࡾฟ ࡋ㸪ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪྵᾐࡉࡏࡿ BMP-2 ⁐ᾮࡣ 150 μl 㸪ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ ࣮ࢺྵᾐࡉࡏࡿBMP-2 ⁐ᾮࡣ 200 μl ࡑࢀࡒࢀ⏕⌮㣗ሷᾮࢆ⏝࠸࡚࣓ࢫࢵࣉࡋ ࡓࠋࡑࡢᚋ㸪࣓ࢫࢵࣉࡋࡓ⁐ᾮࢆß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪ㸪ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺ ୗࡍࡿࡇ࡛㸪BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ㸪BMP-2/ࢩ࣮ࢺࢆస〇ࡋࡓࠋ⏝ࡲ࡛ࡑࢀࡒࢀࢆ 1 㛫௨ୖᐊ ࡛㟼⨨ࡍࡿࡇࡼࡾ㸪ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝ BMP-2 ࡢ࣏ࣜ࢜ࣥ ⤖ྜࡢᙧᡂࢆᐇࡋࡓࠋ 㸶㸧bFGF/ࢩ࣮ࢺࡢస〇 㸴㸧࡛స〇ࡋࡓbFGF ⁐ᾮࡽ 20 μl ࢆ᥇ྲྀࡋ㸪⁛⳦⏕⌮㣗ሷᾮ 1 ml ࢆຍ࠼ࡓࠋࡑ ࡢᚋ㸪๓㏙ࡢࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺୗࢆ⾜࠺ࡇ࡛bFGF/ࢩ࣮ࢺࡢస〇ࢆ ᐇࡋࡓࠋࡇࢀࡼࡾ⏝ࡲ࡛ 1 㛫௨ୖᐊ ࡛㟼⨨ࡍࡿࡇ࡛ bFGF ࢆྵᾐࡉࡏ㸪 bFGF/ࢩ࣮ࢺࢆస〇ࡋࡓࠋ 㸷㸧➨୕୰ᡭ㦵㦵Ḟᦆࡢస〇 ౪ヨ㤿ࢆሷ㓟࣓ࢹࢺ࣑ࢪࣥ㸦ࢻ࣑ࢺ࣮ࣝ®㸪᪥ᮏ⸆ᕤᴗ㸪᪥ᮏ㸧4 μg/kg 㟼⬦ෆᢞ ࡼࡿ㙠㟼ฎ⨨ᚋ㸪ࢪࢮࣃ࣒㸦࣍ࣜࢰࣥ10 mg ὀ®㸪ࢫࢸࣛࢫ〇⸆㸪᪥ᮏ㸧30 μg/kg 㟼⬦ෆᢞ࠾ࡼࡧࢧ࣑࣮ࣛࣝࢼࢺ࣒ࣜ࢘㸦ࢯࢰ࣮ࣝ®㸪᪥་ᕤ㸪᪥ᮏ㸧4 mg/kg 㟼⬦ෆᢞࡼࡾಽ㤿ࡋ㸪5 %ࣈࢻ࢘⢾ᾮ㸦ሯ⢾ᾮ 5 %®㸪ሯ〇⸆㸪᪥ᮏ㸧500 ml
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15 ᪥ᮏఫ〇⸆㸪᪥ᮏ㸧࠾ࡼࡧ㓟⣲ࡢΰྜ྾ධ㯞㓉ࡼࡗ࡚⥔ᣢࢆ⾜ࡗࡓࠋ⾡୰ࡣᚲせ ᛂࡌ࡚ሷ㓟ࢻࣈࢱ࣑ࣥ㸦ࣞࢱ࣓ࢵࢡࢫ®㸪୕ඹ࢚࣮ࣝ⸆ရ㸪᪥ᮏ㸧ࢆ㟼⬦ෆ1-5 μg/kg ࡢ㏿ᗘ࡛ᢞࡋࡓࠋ ᕥྑ๓⫥ࡢ⭎⠇ࡼࡾୖ㒊Ṇ⾑ᖏࢆᕳࡁ㸪⭎⠇ࡽ⧅ࡅ๋࡚ẟ㸪ᾘẘ࠾ࡼࡧࢻ ࣮ࣞࣆࣥࢢࢆ⾜ࡗࡓࠋ୧๓⫥ࡶ㸪➨୕୰ᡭ㦵㏆➃ࡽ5 cm 1 ࣨᡤ㸪ࡉࡽ 3 cm 㛫㝸࡛ 2 ࣨᡤ㸦ྛ⫥ 3 ࣨᡤࡎࡘ㸪ィ 6 ࣨᡤ㸧ࢆษ㛤ࡋ㸪㦵⭷ࢆṧࡋ࡚➨୕୰ᡭ㦵 ࢆ㟢ฟࡋࡓࠋྠ㒊ᚄ4.5 mm ࢻࣜࣝ㸦COMPACTTM AIR DRIVEII®㸪ࢩࣥࢭࢫ㸪᪥ ᮏ㸧ࢆ⏝࠸㸪῝ࡉ27.0 mm ࡢ㦵Ḟᦆࢆస〇ࡋࡓ㸦Figure 1-2㸧ࠋྛḞᦆ㒊 BMP-2/ ࢫ࣏ࣥࢪ㸪BMP-2/ࢩ࣮ࢺ㸪BMP-2 ⁐ᾮ㸪ࢫ࣏ࣥࢪ㸪ࢩ࣮ࢺ࠾ࡼࡧ bFGF/ࢩ࣮ࢺࢆࣛࣥ ࢲ࣒╔ࡋࡓࠋࡑࡢᚋ㸪⓶ෆࢆ྾⣒㸦2-0 Vicryl®㸪ࢪࣙࣥࢯ࢚ࣥࣥࢻࢪࣙࣥࢯࣥ㸪 ᪥ᮏ㸧ࢆ⏝࠸࡚༢⤖⠇⦭ྜࡋࡓࠋᡭ⾡୰ࡣ㐺ᐅ࣏࣮ࢱࣈࣝX ⥺ᙳ⨨㸦࣮࣭࢟ࣕࣜ ࣞ FPX-W㸪ࣇࣛࢵࢺ㸪᪥ᮏ㸧ࢆ⏝࠸࡚㦵Ḟᦆࡢ☜ㄆࢆ⾜ࡗࡓࠋ୧๓⫥ࡢ➨୕୰ᡭ 㦵ࡣയ⿕そᮦ㸦Melolin®㸪Smith and Nephew㸪USA㸧㸪⁛⳦ఙ⦰ໟᖏ㸪ࢥࢵࢺࣥࣂࣥ ࢸ࣮ࢪࡼࡿᅽᐃໟᖏࢆ⾜ࡗࡓࠋぬ㓰ᐊ⛣ືᚋ㸪ሷ㓟࣓ࢹࢺ࣑ࢪࣥ2 μg/kg 㟼⬦ෆ ᢞࡼࡿ㙠㟼ฎ⨨ࢆ⾜࠸㸪ぬ㓰ࡣ⿵ຓ㉳❧ࡋࡓࠋ㤿ᡣᡠࡋࡓᚋ㸪㓑㓟ࣜࣥࢤ ࣝᾮ㸦VFK-1000®㸪ᕝᓮ୕㮚〇⸆㸪᪥ᮏ㸧ࢆ3 ml/kg/h ࡢ㏿ᗘ࡛㸪ᣢ⥆Ⅼࢆ⾜ࡗࡓࠋ ษ⓶30 ศ๓ࡲ࡛ࢭࣇࣟࢳࣥࢼࢺ࣒ࣜ࢘㸦ὀᑕ⏝ࢥ࢟ࢩࣥ®㸪ᮾ⳻⸆ရᕤᴗ㸪᪥ ᮏ㸧20 mg/kg ࡢ㟼⬦ෆᢞࢆ⾜ࡗࡓࠋぬ㓰ᚋ㸪ࣇࣝࢽ࢟ࢩ࣓ࣥࢢ࣑ࣝࣥ㸦ࣂࢼ࣑ࣥ® ὀᑕᾮ 5 %㸪᪥ᮏఫ〇⸆㸧1.1 mg/kg ࡢ㟼⬦ෆᢞ࡞ࡽࡧࣇ࢙ࢽࣝࣈࢱࢰࣥ 㸦BUTE TABS®㸪VEDCO㸪USA㸧2 mg/kg ࡢ⤒ཱྀᢞࢆ⾜ࡗࡓࠋ
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17
ࢳࢫࣛࢫCT ീࡼࡾᚓࡽࢀࡓീࢹ࣮ࢱࡣ 3 ḟඖ㧗⢭⣽⏬ീฎ⌮ࢯࣇࢺ㸦Virtual Place Advance®㸪AZE㸪᪥ᮏ㸧ࡼࡾ⏬ീฎ⌮ࡋࡓࠋ⏬ീࡣゎᯒࢯࣇࢺࢆ⏝࠸࡚ 0.5 mm ᖜ࡛ 3 ᯛࣜࢫࣛࢫࢆᐇࡋࡓࠋCT ್ࡢ ᐃ⠊ᅖࡣ㸪⓶㉁㦵Ḟᦆ㒊ࡢ୰ᚰ㧗ࡉ 4.0 mm×ᖜ 5.0 mm ࡛స〇ࡋࡓ㛗᪉ᙧࡢ㛵ᚰ㡿ᇦ㸦Region of Interest㸪௨ୗ ROI㸧ࢆタ ᐃࡋ㸪CT ್㸦Hounsfield Unit㸪௨ୗ HU㸧ࢆ ᐃࡋࡓ㸦Figure 1-3㸧ࠋ ᐃࡣ 3 ᅇᐇ ࡋ㸪 ᐃࡉࢀࡓᩘ್ࡢᖹᆒ್ࢆࡑࡢ㒊࠾ࡅࡿCT ್ࡋࡓࠋ 㸯㸱㸧⤌⧊Ꮫⓗ᳨ᰝ᪉ἲ CT ീᚋ㸪㦵Ḟᦆ㒊ࢆ୰ᚰ 1.0 cm × 1.0 cm × 3.0 cm ࡢࣈࣟࢵࢡࢆ᥇ྲྀࡋࡓࠋࣈ ࣟࢵࢡࡣ15 %୰ᛶ⦆⾪࣐࣍ࣝࣜࣥ⁐ᾮࢆ⏝࠸࡚ᅛᐃࡋ㸪⬺⅊࡞ࡽࡧ⬺⬡ᚋࣃࣛ ࣇࣥໟᇙࡋࡓࠋ➨୕୰ᡭ㦵㦵Ḟᦆ㒊ࢆྵࡴ▮≧᩿㠃࡛㸪4 μm ⷧษᚋ㸪࣐࣊ࢺ࢟ ࢩ࢚ࣜࣥ࢜ࢪࣥᰁⰍ㸦௨ୗ HE ᰁⰍ㸧ࢆᐇࡋ㸪⤌⧊Ꮫⓗ᳨ᰝ౪ࡋࡓࠋ୰ᡭ㦵㦵 Ḟᦆ㒊ࡢ▮≧᩿㠃⤌⧊ษ∦ࡼࡾ㸪㦵⏕ࡢ≧ែࢆ㸴ẁ㝵ࡢࢫࢥࡼࡗ࡚ホ౯ࡋࡓ 㸦0㸸Ḟᦆ㒊ࡢ 20 %ᮍ‶ࡀ㦵ᱱ㦵࡞ࡿ㸪1㸸Ḟᦆ㒊ࡢ 20 %௨ୖ 40 %ᮍ‶ࡀ㦵ᱱ㦵 ࡞ࡿ㸪2㸸Ḟᦆ㒊ࡢ 40 %௨ୖ 60 %ᮍ‶ࡀ㦵ᱱ㦵࡞ࡿ㸪3㸸Ḟᦆ㒊ࡢ 60 %௨ୖ 80 % ᮍ‶ࡀ㦵ᱱ㦵࡞ࡿ㸪4㸸Ḟᦆ㒊ࡢ 80 %௨ୖ 100 %ᮍ‶ࡀ㦵ᱱ㦵࡞ࡿ㸪5㸸Ḟᦆ㒊 ࡀ㦵ᱱ㦵࡛‶ࡓࡉࢀࡿ㸧ࠋࢹ࣮ࢱࡶྠ୍ࡢホ౯⪅ࡀホ౯ࢆᐇࡋ㸪ホ౯⪅ ┣᳨ୗ࠾࠸࡚ホ౯ࢆᐇࡋࡓࠋ 㸯㸲㸧⤫ィゎᯒ᪉ἲ ࡚ࡢ ᐃ㡯┠ࡣ୰ኸ್㸦᭱ᑠ್–್᭱㸧࡛♧ࡋࡓࠋࡲࡎ㸪ྛ㡯┠ࡶࢡࣛࢫ࢝ ࢛ࣝ࢘ࣜࢫ᳨ᐃࢆ⏝࠸᭷ពᛶࡢ᭷↓ࢆㄪࡓࠋࢡࣛࢫ࢛࢝ࣝ࢘ࣜࢫ᳨ᐃࡼࡾ᭷ពᛶ ࡀ☜ㄆࡉࢀࡓሙྜࡣ㸪࢘ࣝࢥࢡࢯࣥ➢ྕ㡰᳨ᐃࢆ⏝࠸࡚ྛ⩌㛫ࡢ⤫ィᏛⓗẚ㍑ࢆ ᐇࡋࡓࠋᮏ◊✲࡛ࡣ㸪࠸ࡎࢀࡶ༴㝤⋡5 %ᮍ‶ࢆ᭷ពᕪ࠶ࡾࡳ࡞ࡋࡓࠋ
18 㸱㸬ᡂ⦼ 㸯㸧㌟యᡤぢ ⾡㒊࿘ᅖ࠾ࡅࡿ㸪㍍ᗘࡢ⇕ឤ⭘⬽ࡀ⩌࠾࠸࡚⾡ᚋ 1 㐌㛫ࡲ࡛ほᐹࡉࢀࡓࠋ ࡇࢀࡽࡣḟ➨ῶ㏥ࡀ☜ㄆࡉࢀ㸪⇕ឤ⭘⬽ࡣ3 㐌ࡲ࡛ࡣᾘኻࡀ☜ㄆࡉࢀࡓࠋ⩌ 㛫࠾࠸࡚㸪࡚ࡢᡤぢᕪࡣ☜ㄆࡉࢀࡎ㸪㊤⾜ࡸ␗ᖖ࡞⾑ᾮ᳨ᰝᡤぢ࡞ࡣ◊✲ ᮇ㛫ࢆ㏻ࡋ࡚☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࠋ 㸰㸧X ⥺ホ౯ X ⥺ࢫࢥࡢ⥅ⓗ࡞ኚࢆ Table 1-2 㸪X ⥺ᡤぢࡢ୍ࢆ Figure 1-4 ♧ࡋࡓࠋ BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ࠾ࡅࡿ X ⥺ࢫࢥࡣ㸪BMP-2 ⁐ᾮ㸪ࢫ࣏ࣥࢪ࡞ࡽࡧࢩ࣮ࢺࡼࡾ ࡶ⾡ᚋ8 㐌㸪12 㐌࡞ࡽࡧ 16 㐌࠾࠸࡚᭷ព㸦p <0.05㸧㧗್ࢆ♧ࡋࡓࠋࡲࡓ㸪BMP-2/ ࢫ࣏ࣥࢪࡣBMP-2/ࢩ࣮ࢺࡼࡾࡶ 12 㐌࡞ࡽࡧ 16 㐌࠾࠸࡚᭷ព㸦p <0.05㸧㧗್ ࢆ♧ࡋ㸪bFGF/ࢩ࣮ࢺࡼࡾࡶ 8 㐌㸪12 㐌࡞ࡽࡧ 16 㐌࠾࠸࡚᭷ព㸦p <0.05㸧㧗 ್ࢆ♧ࡋࡓࠋBMP-2/ࢩ࣮ࢺࡣ㸪ࢩ࣮ࢺࡼࡾࡶ 8 㐌࡞ࡽࡧ 12 㐌᭷ព㸦p <0.05㸧 㧗್ࢆ♧ࡋ㸪bFGF/ࢩ࣮ࢺࡣࢩ࣮ࢺࡼࡾࡶ 16 㐌࠾࠸࡚᭷ព㸦p <0.05㸧㧗್ࢆ♧ࡋ ࡓࠋࡣ࠸ࡎࢀࡢ⩌㛫ࡶ᭷ពᕪࡣ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࠋ 㸱㸧CT ホ౯ ᐃࡉࢀࡓCT ್ࢆ Table 1-3 ♧ࡋࡓࠋCT ್ࡣࢡࣛࢫ࢛࢝ࣝ࢘ࣜࢫ᳨ᐃ࠾࠸࡚ ᭷ពᛶ㸦p = 0.88㸧ࡀ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࠋࡋࡋ࡞ࡀࡽ㸪BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ࠾ࡅࡿ CT ್ࡣ㸪No.4 ࠾ࡅࡿ bFGF/ࢩ࣮ࢺࡢ CT ್ࢆ㝖ࡁ㸪ࡢ࡚ࡢ CT ್ᑐࡋ࡚㧗್ࢆ ♧ࡍࡇࡀほᐹࡉࢀࡓࠋ 㸲㸧⤌⧊Ꮫⓗホ౯
19 ⤌⧊ᡤぢࡢ୍ࢆFigure 1-5 ♧ࡋࡓࠋ࠸ࡎࢀࡢ⩌࠾࠸࡚ࡶᢞ≀ࡢṧᏑࡣ☜ㄆ ࡉࢀࡎ㸪␗ᖖ࡞⅖ᛂࡣ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࠋBMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ࡛ࡣ㸪㦵Ḟᦆ㒊࿘ ᅖࡢ㦵ࡢቃ⏺ࡀ᫂░࡛࠶ࡾ㸪ᗈ⠊⦓ᐦ㦵ࡢᙧᡂࡀ☜ㄆࡉࢀࡓ㸦Figure 1-5 A㸧ࠋ BMP-2/ࢩ࣮ࢺ࡞ࡽࡧ bFGF/ࢩ࣮ࢺ࠾࠸࡚ࡶ⦓ᐦ㦵ࡢᙧᡂࡣᗈ⠊☜ㄆࡉࢀࡓ 㸦Figure 1-5 B㸪D㸧ࠋBMP-2 ⁐ᾮ㸪ࢫ࣏ࣥࢪ࡞ࡽࡧࢩ࣮ࢺ࡛ࡣ௬㦵࡞ࡽࡧ⥺⥔ᛶ ⤌⧊ࡀᗈ⠊☜ㄆࡉࢀ㸪⦓ᐦ㦵ࡢᙧᡂࡣ㝈ࡽࢀࡓ㡿ᇦ࡛ࡢࡳ☜ㄆࡉࢀࡓ㸦Figure 1-5 C㸪 E㸪F㸧ࠋ⤌⧊ࢫࢥࢆ Table 1-4 ♧ࡋࡓࠋBMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ㸪BMP-2/ࢩ࣮ࢺ࡞ࡽࡧ bFGF/ࢩ࣮ࢺ࠾࠸࡚᭷ព㸦p <0.05㸧ࢩ࣮ࢺࡼࡾࡶ㧗್ࢆ♧ࡍࡇࡀ☜ㄆࡉࢀࡓࠋ
20
Table 1-1. Formulation of gelatin hydrogels.
Group Growth factor Geratin hydrogel Form Dimensions (mm) Pore size (μm) Porosity (%) Water content (%) IEP1) BMP-2/sponge BMP-2 sponge 10×10×20 179.1±27.8 95.9 97.8 9.0 BMP-2/sheet BMP-2 sheet 10×10×01 ― ― 97.8 9.0 free BMP-2 BMP-2 none ― ― ― ― ― sponge none sponge 10×10×20 179.1±27.8 95.9 97.8 9.0 sheet none sheet 10×10×01 ― ― 97.8 9.0 bFGF/sheet bFGF sheet 10×10×01 ― ― 97.8 5.0 1) IEP: Isoelectronic point
21
Figure 1-1. Gelatin hydrogel sheet and gelatin ß-TCP sponge.
Gelatin hydrogel sheet can act as DDS. However, it can not act as scaffold. Gelatin ß-TCP sponge can act as not only DDS but also scaffold necessary for cell differentiation and proliferation. Scale bar: 10.0 mm.
22
Figure 1-2. Illusration of bone defects of the third metacepal bone.
Three third metacarpal bone defects were prepared each forelimb by using drill (diameter: 4.5 mm, depth: 27.0 mm). The first drill hole was 5 cm distal to the proximal aspect of the third metacarpal bone, the second drill hole was 3 cm distal to the first incision, and the third drill hole was 3 cm distal to the second drill hole.
3 cm 5 cm
3 cm
Bone defect
23
Figure 1-3. Measurement of CT value at the bone defect site.
For each defect, a CT value (Hounsfield Unit: HU) was measured from a region of interest (ROI) set as a rectangle (4.0 mm × 1.5 mm) in the middle of the bone defect. This measurement was conducted three times, and the mean CT value was used in subsequent analyses.
4.0 mm
5.0 mm
1.5 mm (0.5 mm × 3)
24 Table 1-2. Radiographic score of the bone defect site.
Group
Weeks after the operation
1 2 3 4 8 12 16 BMP-2/sponge M1) R2) 0 (0–2) 1 (0–2) 3 (1–3) 3 (1–3) 4#$ (3–4) 5†#$ (4–5) 5†$ (5–6) BMP-2/sheet M R 0 (0–2) 1 (0–2) 3 (1–3) 3 (1–3) 3* (3–4) 4* (4–5) 4 (4–6) free BMP-2 M R 0 (0–1) 0 (0–1) 1 (1–2) 1 (1–2) 3 (2–3) 4 (3–4) 4 (3–5) sponge M R 0 (0–1) 0 (0–1) 1 (0–2) 2 (1–2) 2 (2–4) 3 (3–5) 4 (3–5) sheet M R 0 (0–0) 0 (0–1) 1 (0–1) 1 (0–1) 2 (1–3) 3 (2–4) 3 (2–5) bFGF/sheet M R 0 (0–2) 1 (0–2) 2 (0–2) 2 (1–3) 3 (2–3) 4 (3–5) 5* (4–5) *: p <0.05 versus sheet, †: p <0.05 versus BMP-2/sheet
#: p <0.05 versus bFGF/sheet, $: p <0.05 versus free BMP-2, sponge and sheet 1) M: Median, 2) R: Range
25
Figure 1-4. Example of radiographic images of bone defect sites treated with BMP-2/sponge and sheet (horse No.1).
Images are shown for 1 day post-operation, when all treatments were scored at 0, and for 16 weeks post-operation, when the BMP-2/sponge treatment was scored 5 and the sheet treatment was scored 3.
sheet
1 day
16 weeks
26 Table 1-3. CT value of the bone defect site.
Horse BMP-2 /sponge BMP-2 /sheet free BMP-2 sponge sheet bFGF /sheet 1 1282.2 1121.8 1267.5 945.4 984.6 1032.8 2 1719.7 1245.2 1536.9 1289.5 1589.9 1386.6 3 829.2 619.4 696.4 794.4 656.3 757.9 4 894.0 563.0 886.9 679.9 741.6 1345.0 5 401.3 325.6 290.3 340.6 250.3 272.0 Median 894.0 619.4 886.9 794.4 741.6 1032.8 unit: Hounsfield Unit
27
Figure 1-5. An example of histological findings 16 weeks post-operation (horse No.2).
The letter (a) indicates compact bone, (b) indicates fibrous tissue, and (c) indicates callus areas. Scale bar: 500 μm. A) The BMP-2/sponge treatment showed the widest area of compact bone (a). B) In the BMP-2/sheet treatment, compact bone (a) was observed over a wide area. C) In the free BMP-2 treatment, fibrous tissue (b) was observed over a wide area. D) In the bFGF/sheet treatment, compact bone (a) was observed over a wide area. E) In the sponge treatment, the greater portion of bone defect sites were callus (c). F) In the sheet treatment, fibrous tissue (b) was observed over a wide area.
A
B
C
D
F
a
b
b
c
a
a
E
28
Table 1-4. Histological score of the regenerated tissue.
Group Histological score Median Range BMP-2/sponge 4* 2–5 BMP-2/sheet 4* 1–5 free BMP-2 㻌 3 1–5 sponge 㻌 2 1–4 sheet 㻌 0.5 0–2 bFGF/sheet 㻌 3* 2–4 *: p <0.05 versus sheet
29 㸲㸬⪃ᐹ ᮏ❶ࡣ㸪㦵⏕ᑐࡍࡿ⏕య⤌⧊ᕤᏛࡢ᭷ຠᛶࢆ᳨ウࡍࡿࡓࡵ㸪࣐࢘ࡢ➨୕୰ᡭ 㦵㦵ḞᦆᑐࡍࡿBMP-2 ࡞ࡽࡧ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪࡢᙳ㡪ࢆ᳨ウࡋࡓࠋ ➨୕୰ᡭ㦵ࢆࡣࡌࡵࡍࡿ㛗㦵ࡣ➇㉮㤿࠾ࡅࡿ㦵ᢡࡢዲⓎ㒊࡛࠶ࡾ㸦82㸧㸪㦵 Ḟᦆࡀ㧗㢖ᗘⓎ⏕ࡍࡿ㒊࡛࠶ࡿࠋࡋࡓࡀࡗ࡚㸪ᮏ᳨ウ࡛ࡣ➨୕୰ᡭ㦵ࢆ⏝࠸࡚㸪 BMP-2 ࡞ࡽࡧ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪࡀ㦵⏕ᑐࡍࡿᙳ㡪ࢆ᳨ウࡋࡓࠋࡲࡓ㸪ᮏ᳨ウ࡛ ⏝࠸ࡓX ⥺ࢫࢥ࡞ࡽࡧ⤌⧊Ꮫⓗࢫࢥࡣ㸪⫗║ⓗศ㢮ࡀྍ⬟࡞ẁ㝵࡛タᐃࡋࡓࠋ 16 㐌࠾ࡅࡿ X ⥺ࢫࢥ⤌⧊Ꮫⓗࢫࢥࡣ㸪ࡍ࡛㦵⏕ࡢホ౯᭷ຠ࡛࠶ࡿࡇ ࡀ♧ࡉࢀ࡚࠸ࡿCT ್ྠᵝࡢഴྥࢆ♧ࡋࡓࡓࡵ㸦90㸪113㸧㸪ᮏ᳨ウ࡛⏝࠸ࡓࢫࢥ ࡢศ㢮ࡣጇᙜ࡛࠶ࡗࡓ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋ ᮏ◊✲࠾࠸࡚㸪⾡㒊࿘ᅖࡢ⇕ឤ㸪⭘⬽࠾ࡼࡧ⑊③࡞ࡣ࠸ࡎࢀࡢ⩌ࡶᕪࡀ࡞ࡃ㸪 ࠸ࡎࢀࡢ㤿࠾࠸࡚ࡶ3 㐌ࡲ࡛࡞ᾘኻࡀ☜ㄆࡉࢀࡓࠋࡲࡓ㸪㊤⾜ࡸ␗ᖖ࡞⾑ᾮ ᳨ᰝᡤぢࡶ◊✲ᮇ㛫ࢆ㏻ࡋ࡚☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࡓࡵ㸪ᮏ◊✲࡛⏝࠸ࡓྛ✀≀㉁ࡢ㐺 ⏝ࡼࡿస⏝ࡣᮏ◊✲࡛ࡣ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࠋࡲࡓ㸪⾡ᚋ⏕ࡌࡿ⅖ᛂ࡞ࡽࡧ ⑊③ࡣ㸪⾡ᚋ⟶⌮㠀ࢫࢸࣟࢻᛶᢠ⅖⸆㸦Non-Steroidal Anti Inflammatory Drugs㸪 ௨ୗ NSAIDs㸧ࢆ㐺⏝ࡍࡿࡇࡼࡾᢚไࡀྍ⬟࡛࠶ࡿ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋNSAIDs ࡢ㐺 ⏝ࡣ㦵⏕ࢆ㐜ᘏࡉࡏࡿࡀ㸪ࡇࡢ㐜ᘏຠᯝࡣ7 ᪥௨ෆࡢᢞ࡛࠶ࢀࡤྍ㏫࡛࠶ࡾ㸪▷ ᮇࡢᢞ࡛ࡣ㐜ᘏຠᯝࡢᙳ㡪ࡣ࡞࠸ࡇࡀ♧ࡉࢀ࡚࠸ࡿ㸦19㸪72㸧ࠋᮏ◊✲࡛ࡣ NSAIDs ࡣ⾡ᚋ4 ᪥ࡲ࡛ࡋ㐺⏝ࡋ࡚࠸࡞࠸ࡇࡽ㸪ᮏ◊✲࡛⏝࠸ࡓ NSAIDs ࡀ㦵⏕ ࠼ࡓᙳ㡪ࡣࢃࡎ࡛࠶ࡗࡓ᥎ᐹࡉࢀࡓࠋ BMP-2/ࢩ࣮ࢺࡣ 8 㐌࠾ࡼࡧ 12 㐌㸪bFGF/ࢩ࣮ࢺࡣ 16 㐌࠾࠸࡚ࢩ࣮ࢺẚ㍑ࡋ ࡚ X ⥺ࢫࢥࡢ᭷ព࡞㧗್ࢆ♧ࡋࡓࠋࡇࢀࡽࡢࡇࡽ BMP-2 ࡞ࡽࡧ bFGF ࡣ ࡶ㦵⏕ࢆಁ㐍ࡋࡓ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋBMP-2 ࡣ MSC ࡢㄏᑟ࡞ࡽࡧ㦵ⱆ⣽⬊⣔ࡢ ศࢆಁ㐍ࡍࡿࡇ࡛㸪bFGF ࡣ⥺⥔ⱆ⣽⬊ࡢቑṪࢆಁ㐍ࡍࡿࡇ࡛ࡑࢀࡒࢀ㦵⏕
30 ࢆಁ㐍ࡍࡿ㸦59㸪82㸪90㸧ࠋᮏ◊✲࡛ᚓࡽࢀࡓ⤖ᯝࡣࡇࢀࡽࡢ⤖ᯝ୍⮴ࡍࡿࡶࡢ࡛ ࠶ࡾ㸪୧⪅ࡶ㦵⏕ࢆಁ㐍ࡍࡿࡇࡀ☜ㄆࡉࢀࡓࠋ୍᪉㸪BMP-2 ⁐ᾮ࠾࠸࡚ࡣ ࢩ࣮ࢺẚ㍑ࡋ࡚㸪᭷ព࡞㦵⏕ࡣ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࠋBMP-2 ࢆࡣࡌࡵࡍࡿྛ✀ᡂ 㛗ᅉᏊࡣ⏕యෆ༙ῶᮇࡀ▷ࡃ㸪༢ᅇࡢᒁᡤᢞ࡛ࡣࡑࡢ᭷ຠᛶࡀ࡞࠸ࡇࡀ♧ࡉࢀ࡚ ࠸ࡿ㸦59㸪101㸧ࠋࡇࢀࡽࡢᡤぢᅇ BMP-2 ⁐ᾮ࡛᭷ពᛶࡀ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࡇ ࡣ୍⮴ࡋ࡚࠾ࡾ㸪ᡂ㛗ᅉᏊࡢ㐺⏝ࡣ㐺ษ࡞ DDS ࡢᵓ⠏ࡀᚲせྍḞ࡛࠶ࡿ⪃࠼ ࡽࢀࡓࠋ๓㏙ࡢ㏻ࡾ㸪BMP-2 bFGF ࡣ␗࡞ࡿస⏝ᶵᗎࡼࡾ㦵⏕ࢆಁ㐍ࡍࡿ⪃ ࠼ࡽࢀ࡚࠸ࡿࠋ㏆ᖺ㸪␗࡞ࡿస⏝ᶵᗎࢆ᭷ࡍࡿᡂ㛗ᅉᏊࡢే⏝ࡀ⤌⧊⏕ᑐࡋ࡚᭷ ຠ࡛࠶ࡿྍ⬟ᛶࡀ♧ࡉࢀ࡚࠸ࡿ㸦48㸧ࠋࡋࡓࡀࡗ࡚㸪BMP-2 bFGF ࡢే⏝ࡼࡾ㦵 ⏕ࡀࡉࡽಁ㐍ࡉࢀࡿ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋᡂ㛗ᅉᏊࡢే⏝ࡣ㸪⏝㔞㸪ᢞࡢࢱ࣑ࣥ ࢢ࡞ࡽࡧᚎᨺᮇ㛫ࡢ᳨ウ࡞ࡀᚲせ࡛࠶ࡿࡉࢀ࡚࠾ࡾ㸪ᚋࡣే⏝ࡢᙳ㡪ࢆྵࡵ ࡓࡇࢀࡽࡢ᳨ウࡀᚲせ࡛࠶ࡿ㸦48㸧ࠋ BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ࠾ࡅࡿ X ⥺ࢫࢥࡣ BMP-2/ࢩ࣮ࢺࡼࡾࡶ 12 㐌࡞ࡽࡧ 16 㐌 ࠾࠸࡚᭷ព㧗್ࢆ♧ࡋࡓࠋࡋࡓࡀࡗ࡚㸪ᮏ◊✲࠾࠸࡚ BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪࡢ㐺⏝ࡣ BMP-2/ࢩ࣮ࢺࡼࡾࡶຠᯝⓗ㦵⏕ࢆᘬࡁ㉳ࡇࡋࡓ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋMSC ࡢᾐ₶࡞ࡽ ࡧ⏕╔㸪⏕╔ࡋࡓ⣽⬊ࡢᰤ㣴౪⤥࡞ࡽࡧ⪁ᗫ≀ࡢฟࡢࡓࡵࡣ150 nm ࡽ 300 nm ࡢᏍ࡛ᵓᡂࡉࢀࡿከᏍᵓ㐀ࡀᚲせ࡛࠶ࡿ㸦106㸪107㸧ࠋß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪࡣከᏍ ᵓ㐀ࢆ᭷ࡋ㸪ࡑࡢᏍᚄࡀ179.1 ± 27.8 μm ࡛࠶ࡿࡇࡀ♧ࡉࢀ࡚࠾ࡾ㸪㊊ሙᮦࡋ࡚ࡢ ᭷ຠᛶࡀ♧ࡉࢀ࡚࠸ࡿ㸦107㸧ࠋBMP-2 ࡣ MSC ࢆㄏᑟࡍࡿࡇࡀ♧ࡉࢀ࡚࠸ࡿࡓࡵ㸪 ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪࡽᨺฟࡉࢀࡿ BMP-2 ࡼࡾ㦵Ḟᦆ㒊࿘㎶Ꮡᅾࡍࡿ MSC ࡀ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪෆ㐟㉮ࡋࡓ⪃࠼ࡽࢀࡓ㸦46㸧ࠋࡑࡋ࡚ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪෆ㐟㉮ ࡋࡓMSC ࡣ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪࡢᏍෆ⏕╔ࡋ㸪ࡑࡢሙ࡛ศቑṪࡀ⏕ࡌࡓ⪃࠼ࡽࢀ ࡓࠋࡉࡽ㸪BMP-2 ࡣ MSC ᑐࡍࡿ㦵ⱆ⣽⬊⣔ࡢศಁ㐍స⏝ࢆ᭷ࡍࡿࡇࡀ♧ ࡉࢀ࡚࠸ࡿࡓࡵ㸪⏕╔ࡋࡓMSC ࡣ BMP-2 ࡢస⏝ࡼࡾ㦵ⱆ⣽⬊⣔ࡢศࡀಁ㐍ࡉ
31 ࢀࡓࡢࡔ⪃࠼ࡽࢀࡓ㸦59㸪104㸧ࠋ୍᪉㸪ࢩ࣮ࢺ࡞ࡽࡧࢫ࣏ࣥࢪࡢ㛫 X ⥺ࢫࢥ ࠾ࡅࡿ᭷ពᛶࡣᏑᅾࡋ࡞ࡗࡓࠋࡇࡢࡇࡽ㸪ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪࡢࡳ࡛ࡣ㊊ሙᮦ ࡋ࡚ࡢຠᯝࡣప࠸⪃࠼ࡽࢀࡓࠋࡇࡢ⤖ᯝࡼࡾ㸪ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪෆࡢ MSC ࡢධ ࡞ࡽࡧ⏕╔ࡣᡂ㛗ᅉᏊࡼࡿ࿘㎶⤌⧊ࡽࡢ MSC ࡢㄏᑟࡀᚲせ࡛࠶ࡿ⪃࠼ࡽ ࢀࡓࠋ CT ᳨ᰝࡼࡾᚓࡽࢀࡓ CT ್᭷ពᛶࡣ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࠋࡋࡋ࡞ࡀࡽ㸪BMP-2/ ࢫ࣏ࣥࢪ࠾ࡅࡿCT ್ࡣ㸪౪ヨ㤿 No.4 ࠾ࡅࡿ bFGF/ࢩ࣮ࢺࡢ ᐃ್௨እᑐࡋ࡚ 㧗್ࢆ♧ࡍࡇࡀほᐹࡉࢀࡓࠋCT ್ࡣỈࢆ 0㸪✵Ẽࢆ-1,000㸪ࣄࢺࡢ⦓ᐦ㦵ࢆ 1,000 つᐃࡍࡿ┦ᑐ್࡛࠶ࡾ㸪㦵ᐦᗘ࠾ࡼࡧ㦵ࡢ⏕ࡢ┦㛵ࡀ࠶ࡿࡉࢀࡿ㸦90㸪113㸧ࠋ 㧗CT ್ࡣ㧗㦵ᐦᗘ࡛࠶ࡿ◳ᛶ⤌⧊࡛࠶ࡿࡇࢆពࡋ࡚࠸ࡿࠋࡇࡢࡇࡽ㸪ᮏ◊ ✲࠾࠸࡚ BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ࡛ࡢ⏕⤌⧊ࡣࡢ⩌ẚ㍑ࡋ࡚㧗㦵ᐦᗘࡢ⤌⧊࡛࠶ࡿ ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋࡇࡢᡤぢࡣ X ⥺ࢫࢥࡢ⤖ᯝࡶ୍⮴ࡋ࡚࠾ࡾ㸪ࡇࡢࡇࡽࡶ BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪࡢ㦵⏕ᑐࡍࡿ᭷ຠᛶࡀ♧ࡉࢀࡓࠋ ⤌⧊Ꮫⓗࢫࢥ࠾࠸࡚㸪BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ㸪BMP-2/ࢩ࣮ࢺ࡞ࡽࡧ bFGF/ࢩ࣮ࢺ ࡣࢩ࣮ࢺẚ㍑ࡋ࡚᭷ព㧗್ࢆ♧ࡋࡓࠋࡇࡢ⤖ᯝࡣ๓㏙ࡢX ⥺ࢫࢥ࡞ࡽࡧ CT ್ࡶ୍⮴ࡋ࡚࠾ࡾ㸪ࡇࢀࡽࡢ㐺⏝ࡼࡿⰋዲ࡞㦵ࡢ⏕ࡀ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋࡉࡽ㸪⤌ ⧊Ꮫⓗᡤぢ࠾࠸࡚㸪࠸ࡎࢀࡢ⩌࠾࠸࡚ࡶᢞ≀ࡢṧᏑ࡞ࡽࡧ␗ᖖ࡞⅖ᛂࡀ ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࡓࡵ㸪ᮏ◊✲࡛ᢞࡋࡓྛ✀ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࡣ 16 㐌ࡢ㛫 Ⰻዲศゎ྾ࡉࢀ㸪⤌⧊ࡼࡾ⨨ࡉࢀࡓ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋ㊊ሙᮦࡣ㸪᪂⏕㦵⤌⧊ ࡢቑຍకࡗ࡚⏕యศゎࡉࢀࡿࡇࡀồࡵࡽࢀࡿ㸦64㸧ࠋࡋࡓࡀࡗ࡚㸪16 㐌࠾࠸࡚ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪࡢṧᏑ࡞ࡽࡧ␗ᖖ࡞⅖ᛂࡀ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࡇࡣ㸪㊊ሙᮦ ồࡵࡽࢀࡿ⏕యศゎᛶ࡞ࡽࡧ⏕య㐺ྜᛶࢆ♧ࡋ࡚࠸ࡿ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋ ᮏ᳨ウ࠾࠸࡚㸪BMP-2 ࡞ࡽࡧ bFGF ࡣ⛣᳜ࡢ 1 㛫௨ୖ๓ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪ࠾ ࡼࡧࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࢩ࣮ࢺୗࢆ⾜࠸㸪ᐊ ࡛㟼⨨ࡋࡓࠋࡇࢀࡣ BMP-2
32 ࡞ࡽࡧbFGF ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࡢ㛫ࡢ࣏ࣜ࢜ࣥ⤖ྜࡢᙧᡂࡣ㛫ࢆᚲ せࡍࡿࡓࡵ࡛࠶ࡿ㸦102㸧ࠋࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤ࣏ࣝࣜ࢜ࣥ⤖ྜࢆᙧᡂࡋࡓᡂ㛗 ᅉᏊࡣ⏕యෆ࠾࠸࡚┤ࡕศゎࡉࢀࡿࡇ࡞ࡃᏳᐃࡍࡿࠋᏳᐃࡋࡓᡂ㛗ᅉᏊࡣ ⏕యෆ࠾࠸࡚ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࡢຍỈศゎక࠸㸪ᚎᨺࡉࢀ࡚⏕⌮άᛶࢆ♧ࡍࠋ ࡇࡢࡇࡼࡾ DDS ࡀᵓ⠏ࡉࢀ㸪ᡂ㛗ᅉᏊࡣ⏕యෆ࡛㛗ᮇ㛫ࢃࡓࡾ୍ᐃ⃰ᗘࢆస ⏝ࡉࡏࡿࡇࡀྍ⬟࡞ࡿࠋᮏ᳨ウ࠾࠸࡚ࢮࣛࢳࣥࣁࢻࣟࢤࣝࡼࡾ DDS ࢆᵓ ⠏ࡋࡓBMP-2/ࢩ࣮ࢺ㸪BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪࡣࡶ㦵⏕ࢆಁ㐍ࡋ࡚࠸ࡿࠋ୍᪉㸪BMP-2 ⁐ᾮ࡛ࡣ㦵⏕ࡀ☜ㄆࡉࢀ࡞ࡗࡓࡇࡽ㸪ᡂ㛗ᅉᏊࡢຠᯝⓗ࡞㐺⏝ࡣ DDS ࡢ ᵓ⠏ࡀᚲせྍḞ࡛࠶ࡿࡇࡀ♧ࡉࢀࡓࠋ ᮏ◊✲ࡼࡾ㸪BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪࡢ㦵⏕ಁ㐍ຠᯝࡀ♧ࡉࢀ㸪ᡂ㛗ᅉᏊ࡞ࡽࡧ㊊ሙ ᮦࡢే⏝ࡢ᭷ຠᛶࡀ♧ࡉࢀࡓࠋࡇࡢᡭἲࡢ㦵ᢡ⒪ᑐࡍࡿ᭷ຠᛶࡀᮇᚅࡉࢀࡓࡀ㸪 ࡑࡢࡓࡵࡣᐇ㝿ࡢ⮫ᗋ࠾ࡅࡿᙳ㡪ࡢ᳨ウࡀᚲせ࡛࠶ࡿ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋࡲࡓ㏆ᖺ㸪 BMP-2㸪ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪ࡞ࡽࡧ⣽⬊ࡢ୍✀࡛࠶ࡿ MSC ࡢే⏝ࡼࡿ㦵⏕ࡢ᭷ຠ ᛶࡀᐇ㦂ⓗ♧ࡉࢀ࡚࠸ࡿࡓࡵ㸪ࡉࡽ㦵⏕ࢆಁ㐍ࡍࡿࡓࡵࡣ MSC ࡢే⏝ࡀ᭷ ຠ࡛࠶ࡿ⪃࠼ࡽࢀࡓ㸦104㸧ࠋᚋ㸪MSC ࡢ㏣ຍࡼࡿᙳ㡪ࡢ᳨ウࡀࡉࡽ࡞ࡿ㦵 ⏕ಁ㐍ࡢࡓࡵᚲせ࡛࠶ࡿ⪃࠼ࡽࢀࡓࠋ
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34 ➨㸰❶
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36 ࢆస〇ࡋ㸪ࡑࡢḞᦆ㒊MSC ✀ BMP-2 ྵᾐ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪ㸦MSC–BMP-2/ࢫ࣏ࣥ ࢪ㸧ࢆ⛣᳜ࡋ㸪㦵⏕࠼ࡿᙳ㡪ࢆ᳨ウࡍࡿࡇࢆ┠ⓗࡋࡓࠋࡲࡓ㸪ᮏ᳨ウ࠾ ࠸࡚㸪࣐࢘࠾ࡅࡿMSC ࡢ㦵⏕࠼ࡿᙳ㡪ࢆ᳨ウࡍࡿࡓࡵ㸪MSC ✀ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪ㸦MSC/ࢫ࣏ࣥࢪ㸧⏕⌮㣗ሷᾮྵᾐ ß-TCP ࢫ࣏ࣥࢪ㸦ࢫ࣏ࣥࢪ㸧ࡢẚ㍑᳨ ウࢆ⾜ࡗࡓࠋࡲࡓ㸪MSC BMP-2 ࡢే⏝ࡀ㦵⏕࠼ࡿᙳ㡪ࢆ᳨ウࡍࡿࡓࡵ㸪 BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪ࡞ࡽࡧ MSC/ࢫ࣏ࣥࢪ MSC–BMP-2/ࢫ࣏ࣥࢪࡢẚ㍑᳨ウࢆ⾜ࡗࡓࠋ
37 㸰㸬ᮦᩱ᪉ἲ 㸯㸧౪ヨື≀ ᮏ◊✲ࡣᗣ࡛࠶ࡾ㐠ືჾᝈࢆ᭷ࡉ࡞࠸ࢧࣛࣈࣞࢵࢻ✀ᡂ㤿6 㢌ࢆ⏝࠸ࡓ㹙∷ 4 㢌㸪∻ 1 㢌㸪㦖 1 㢌㸪ᖺ㱋㸸3.2 ± 2.5㸦ᖹᆒ ± ᶆ‽೫ᕪ㸧ṓ㸪య㔜㸸422.7 ± 127.3 kg㹛ࠋ ⤥㣵࡞ࡽࡧ㣫⫱ἲࡣ➨㸯❶ࠕ㸰㸬ᮦᩱ᪉ἲ 㸯㸧౪ヨື≀ࠖ‽ࡌ࡚ᐇࡋࡓࠋ 㸰㸧MSC ࡢᇵ㣴 㦵㧊ᾮࡢ᥇ྲྀࡣ Smith ࡽࡢ᪉ἲ‽ࡌᐇࡋࡓ㸦95㸧ࠋᯟሙෆ㤿ࢆಖᐃᚋ㸪㉸㡢 Ἴデ᩿⨨ࡼࡾ➨5㸪➨ 6 ⬚㦵㦵㧊⭍ࢆ☜ㄆࡋࡓࠋ☜ㄆࡋࡓ㦵㧊⭍ࡢ⾲ᒙࢆࣜࢻ࢝ ࣥ㸦࢟ࢩࣟ࢝ࣥὀᑕᾮ 2 %㸪ࢫࢺࣛࢮࢿ࢝㸪᪥ᮏ㸧ࡼࡾᒁᡤ㯞㓉ࢆᐇࡋ㸪 ࡑࡢᚋ☜ㄆࡋࡓ⬚㦵㦵㧊⭍8G ࢪ࣒ࣕࢩࢹ⏕᳨㔪㸦ࢹࢫ࣏࣮ࢨࣈࣝࢪ࣒ࣕࢩࢹ 㦵㧊⏕᳨㔪8 G × 10 cm㸪Cardinal Health㸪USA㸧ࢆ่ධࡋ࡚྾ᘬࡋࡓ㸦Figure 2-1㸧ࠋ 㦵㧊ᾮࡣ1.0 ml ࢆ࣊ࣃࣜࣥࢥ࣮ࢺࡋࡓࢩࣜࣥࢪ᥇ྲྀࡋࡓࠋ ࡑࡢᚋ㸪᥇ྲྀࡋࡓ㦵㧊ᾮࢆ⏝࠸㸪Takahashi ࡽࡢ᪉ἲ‽ࡌ MSC ࡢᇵ㣴ࢆᐇࡋࡓ 㸦106㸧ࠋᇵ㣴⏝ᇵᆅࡣ㸪ᇵᆅ㸦Dulbecco’s Modifide Eagles Medium-high glucose㸪ࢩࢢ ࣐ࣝࢻࣜࢵࢳࢪࣕࣃࣥ㸪᪥ᮏ㸧ᑐࡋ㸪∵⫾ඣ⾑Ύ㸦Serum㸪Fetal Bovine㸪BioWest㸪 France㸧ࡀ 15 %㸪ᢠ⏕≀㉁㸦Penicillin-Streptomycin solution㸪ࢩࢢ࣐ࣝࢻࣜࢵࢳࢪࣕ ࣃࣥ㸧ࡀ1 %࡞ࡿࡼ࠺㸪ᇵ㣴㛤ጞ┤๓ΰࡋ࡚స〇ࡋࡓࠋࣆ࣌ࢵࢸࣥࢢࡼ ࡿ㦵㧊ᾮࡢ༑ศ࡞ΰᚋ㸪10 ᯛࡢᇵ㣴─㸦Dishes NunclonTM 90 mm㸪Thermo Fisher Scientific Inc㸪USA㸧㦵㧊ᾮࢆ 0.1 ml ࡎࡘศὀࡋࡓࠋࡑࡇᇵ㣴⏝ᇵᆅࢆࡑࢀࡒࢀ 12 ml ῧຍࡋ㸪㦵㧊ᾮࡀᆒ୍࡞ࡿࡼ࠺༑ศ᧠ᢾࡋࡓࠋࡇࡢᚋ㸪37 °C㸪5 % CO2ࡢ
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38 ᇵᆅࡢࡣ 2 ᪥ẖᐇࡋ㸪ィ 14 ᪥㛫ᇵ㣴ࡋࡓࠋᇵ㣴─ࡢὙί㸪ᇵᆅࡢῧຍ࡞ࡽ ࡧࡑࡢᚋࡢᇵ㣴ࡣ3 ᪥࠾ࡅࡿ᧯సྠᵝᐇࡋࡓࠋ 㸱㸧MSC ᠱ⃮ᾮࡢㄪᩚ ᮏ◊✲࡛ࡣ㸪MSC ࡢᅇࡣ㦵Ḟᦆస〇ᡭ⾡ࡢ 5 㛫๓㸪௨ୗࡢᡭ㡰࡛ᐇࡋࡓࠋ ࡣࡌࡵᇵ㣴─ࡽᇵ㣴⏝ᇵᆅࢆ㝖ཤࡋ㸪PBS ࡼࡿὙίࢆᐇࡋࡓࠋὙί⏝࠸ࡓ PBS ࡢ㝖ཤᚋ㸪ᇵ㣴─ 5 ml ࡢࢺࣜࣉࢩࣥ㸦0.25 % Trypsin/ 2.21 mM EDTA-4Na㸪 Mediatech㸪USA㸧ࢆῧຍࡋ㸪37 °C ࡛ 2 ศ㛫ຍ ࡋ࡚㸪ᇵ㣴─ࡽ MSC ࢆ㞳ࡉࡏ ࡓࠋගᏛ㢧ᚤ㙾ୗ࡛ᇵ㣴─ࡽࡢMSC ࡢ㞳ࢆ☜ㄆᚋ㸪MSC ᠱ⃮ࢺࣜࣉࢩࣥᾮࢆ㐲 ᚰ⏝ࢳ࣮ࣗࣈᅇࡋࡓࠋࢺࣜࣉࢩࣥࡢస⏝ࡼࡿ MSC ࡢṚ⁛ࢆ㜵ࡄࡓࡵ㸪㐲ᚰ⏝ ࢳ࣮ࣗࣈMSC ᠱ⃮ࢺࣜࣉࢩࣥᾮࢆᅇᚋ㸪ࢺࣜࣉࢩࣥάࡢࡓࡵ 5 mL ࡢᇵ㣴 ⏝ᇵᆅࢆ┤ࡕῧຍࡋࡓࠋࡑࡢᚋ1,500 rpm㸪4 °C ࡢ᮲௳࡛ 10 ศ㛫㐲ᚰࡋࡓࠋ㐲ᚰᚋ㸪 ୖΎࢆ㝖ཤࡋ㸪ṧࡗࡓ⣽⬊ሢDulbecco’s Modifide Eagles Medium - high glucose ᇵᆅ 1,010 μl ࢆຍ࠼㸪ࣆ࣌ࢵࢸࣥࢢࢆ༑ศᐇࡍࡿࡇ࡛㸪MSC ᠱ⃮ᾮࢆస〇ࡋࡓࠋ ࡇࡢMSC ᠱ⃮ᾮࡽ 10 μl ࢆศὀࡋ㸪⾑⌫ィ⟬┙ࢆ⏝࠸࡚ᅇࡉࢀࡓ MSC ᩘࢆィ ࡋࡓࠋ
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39
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