プロスタグランジン輸送体 PGT を介した PGE2 調節機構（英文題名）

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(1)プロスタグランジン輸送体PGTを介したPGE2調節機構著者著者別表示雑誌名学位授与番号学位名学位授与年月日 URL. 笠井拓 Kasai Taku 博士論文要旨Abstractおよび要約Outline 13301甲第4076号博士（薬学） 2014‑03‑22 http://hdl.handle.net/2297/39010. Creative Commons : 表示 ‑ 非営利 ‑ 改変禁止 http://creativecommons.org/licenses/by‑nc‑nd/3.0/deed.ja.

(2) 学位論文要旨. 主論文題名. プロスタグランジン輸送体 PGT を介した PGE2 調節機構（英文題名）. Regulatory mechanism of PGT-mediated PGE2 secretion. 生命科学専攻分子作用学講座 1123032310 笠井拓主任指導教員名玉井郁巳. 教授.

(3) 【Abstract】 It has been known that prostaglandin E2 (PGE2) is involved in the initiation and/or progression of inflammation and cancer, especially colorectal cancer. However, it is not clear how secretion of PGE2 out of the cells is regulated. This thesis aimed to investigate expression of prostaglandin transporter (PGT/ SLCO2A1) and to clarify the role of PGT in regulating PGE2 in response to proinflammatory and oxidative stress. In human bronchial epithelial cell line BEAS-2B, PGT was mostly expressed in the plasma membrane. When the cells were exposed to lipopolysaccharide (LPS), mRNA expression of a pro-inflammatory cytokine IL-6 and extracellular concentration of PGE2 in the cells were elevated. Amount of released PGE2 from the cells in response to LPS decreased in the presence of PGT inhibitors such as BCG and BSP, suggesting that PGT mediates PGE2 release from BEAS-2B cells. In colorectal cancer derived cell line, PGT was mostly expressed in the plasma membrane in Caco-2 cells, however, most of PGT was in cytoplasm of CoLo320DM and LoVo cells, and found to be translocated to subapical membranes when treated with SnCl2 or H2O2. As a consequence, secretion of PGE2 from the LoVo cells was increased by H2O2 without significant change in the total amount of PGE2. H2O2-induced secretion of PGE2 was lowered by exocytosis inhibitors such as EGTA and cytochalasin D. Furthermore, mRNA expression of an angiogenic peptide vascular endothelial growth factor (VEGF) was significantly reduced in LoVo cells by knocking down PGT. These results suggest that PGT is involved in the secretion of PGE2 in an exocytotic manner and contributes to controlling tumor progression induced by angiogenic signaling of colon cancer. In conclusion, Pharmacological intervention of PGT function may provide a clinical benefit to treat inflammatory diseases and colorectal cancer. 【背景・目的】プロスタノイドは、生体内の種々の臓器や組織おいて多彩な作用を示す。中でも、PGE2 は生体内の多くの組織で生成され、生理機能および病態の調節に関わっている生理活性物質である。そのため、PGE2 の作用調節は、幅広い疾病の治療に利用できる可能性がある。細胞内で合成された PGE2 は細胞外へ分泌され、オートクラインあるいはパラクラインにより、細胞膜表面にある PGE2 受容体 (EP) に結合し、その作用を発揮する。PGE2 の生理作用は受容体局所での濃度により左右されるが、局所濃度調節機構に関する情報は極めて少なく、作用局所濃度を考慮した生理作用に着目した研究もない。また、PGE2 は生理的 pH では陰性に荷電しているため、単純拡散による膜透過性は低いと想定され、細胞膜の内外への移動を行うためには輸送体の介在が必要である。それゆえに本論文では、作用部位局所における PGE2 濃度の制御因子の一つとして考えられる PGE2 輸送体として、PG 類に選択性の高い輸送体であるプロスタグランジン輸送体 (PGT/SLCO2A1) に焦点を当てた。 PGE2 は炎症や癌の進展に関与することが知られている。PGT は細胞外 PGE2 の細胞内への取り込みだけでなく、細胞内からの PGE2 の分泌にも関与すると考えられる。しかしながら、生理条件下における細胞からの PGE2 分泌への PGT の寄与は未だ明らかとなっていない。そこで、炎症反応により COX-2 が誘導され細胞内の PGE2 の産生量が増大することから、産生された PGE2 が PGT を介して分泌され、PGE2 の炎症シグナル活性化に関与している可能性がある。また、癌の中でも大腸組織に COX-2 の高い発現が見られ、さらに臨床において NSAIDs により大腸癌による死亡率が減少することから、大腸癌の発生や進展に PGE2 が関与していると考えられる。そのため、PGE2 動態制御因.

(4) 子として PGT による PGE2 輸送を明らかにすることにより、PGT 活性調節による炎症および大腸癌進展の制御へ展開できる可能性が考えられた。また、大腸癌の発生には酸化ストレスを起因とする慢性炎症性腸疾患が関連しており、酸化ストレスは大腸癌の危険因子となる。したがって、本論文では炎症および大腸癌における PGE2 動態に対する PGT の役割を解明することを目的とし、炎症時の PGE2 輸送活性評価および大腸癌において酸化ストレスが及ぼす PGT への影響ならびに PGE2 調節との関連について検討を行った。【方法】細胞外および細胞内 PGE2 は ELISA および LC-MS/MS を用いて定量した。PGT および PGE2 は免疫細胞染色により検討した。また、mRNA およびタンパクの発現量は定量的 RT-PCR および Western blotting により検討した。細胞株はヒト気道上皮 BEAS-2B またはヒト大腸癌 CaCo-2、CoLo320DM および LoVo 細胞を用いた。【結果・考察】気道上皮は感染物質、外因性吸引物質および有害物質などの外的刺激に曝露されやすい部位であるため、ヒト気道上皮 BEAS-2B 細胞を用いて LPS を曝露し炎症モデルを作製した。LPS 曝露により細胞外に分泌された PGE2 に対する PGT の寄与を評価しところ、PGT 阻害剤である Bromocresol green (BCC) および Bromosulfophthalein (BSP) によって細胞外 PGE2 濃度が減少し、炎症性サイトカインの IL-6 の発現量も阻害剤により減少した。さらに、細胞外へ分泌された PGE2 の寄与を評価しやすくするためにアラキドン酸を曝露し、BEAS-2B 細胞に発現する PGT をノックダウンしたところ分泌量は 30%程度減少した。したがって、炎症時即ち細胞内 PGE2 産生量が増加した時に PGT が PGE2 の分泌に関与していることが示唆された。ヒト大腸癌細胞における PGT の発現を免疫細胞染色により検討したところ、Caco-2 において PGT は主に細胞膜に発現していたが、CoLo320DM および LoVo 細胞では主に細胞内に発現していた。さらに、CoLo320DM および LoVo 細胞において、炎症および酸化ストレスに関連した刺激として SnCl2 または H2O2 曝露した。その結果、PGT の主たる発現部位は細胞内から細胞膜近傍へと変化し、総 PGT タンパク質発現量は変化しなかった。これまでに、Caco-2 細胞のように細胞膜に発現している PGT については PGE2 の細胞内に取り込みに働き、細胞内での PGE2 の代謝に関与していると考えられている。しかし、細胞内に発現する PGT の機能については明らかにされていない。そこで、酸化ストレスにより細胞内に発現している PGT の局在性が変化したことから、細胞内 PGT も細胞内外の PGE2 量の調節に関与しているのではないかと考え、PGT の発現が高く局在性変化が観察された LoVo 細胞を用いて PGE2 輸送活性に対する酸化ストレスの影響について評価した。細胞内外 PGE2 量を測定したところ、H2O2 曝露による PGT の局在性変化と共に PGE2 量は細胞内では減少し、細胞外では増大した。一方、PGE2 の総量には変化がなかったことから、PGT の局在性変化は PGE2 の細胞外への分泌と関連することが考えられた。また、H2O2 による PGE2 分泌は COX-2 選択的阻害剤である NS398 の影響を受けなかった。さらに、H2O2 は TNF-α 曝露による PGE2 分泌を促進させ、その効果は siRNA による PGT のノックダウンにより抑制された。したがって、PGT を介した PGE2 の細胞外への分泌促進は、PGE2 の生合成とは独立して PGE2 調節に関与している可能性が示唆された。PGT.

(5) と PGE2 の細胞内局在性について、PGT-EGFP 融合タンパク質ならび抗 PGE2 抗体によって調べところ、両者が一部細胞内オルガネラに共局在することが示された。即ち、共局在するオルガネラに PGE2 が PGT を介して貯留される可能性が示唆された。以上より、PGT により PGE2 が貯留された細胞内オルガネラが酸化ストレスにより細胞膜に移行し、PGE2 が細胞外に分泌されると考えられた。そこで膜動輸送阻害作用を有する EGTA および cytochalasin D の影響を検討したところ、H2O2 曝露時の PGT の細胞内局在性と PGE2 量の変化は抑制された。また、血管新生因子である VEGF の mRNA 発現量は、H2O2 および TNF-α 曝露により誘導され、その効果は PGT ノックダウンにより抑制されたことから、膜動輸送により分泌される PGE2 を抑制することで大腸癌の進展を制御できる可能性が示唆された。【結論】 PGT は細胞膜あるいは細胞内に発現し、細胞膜に発現する PGT は PGE2 の細胞内への取り込みだけでなく、炎症時に PGE2 の排出にも関与することが示され、PGT の活性調節により炎症反応を調節できる可能性が示唆された。一方、細胞内に発現する PGT はオルガネラ内に PGE2 を貯留する役割を果していることが示された。貯留された PGE2 は、酸化ストレスによりオルガネラが膜動輸送によって細胞内から細胞膜近傍に移動し、PGE2 分泌を促進することが示唆された。さらに、PGT の活性調節により血管新生因子である VEGF の発現量が抑制され、大腸癌の進展を制御できる可能性が示唆された。したがって、本論文で明らかにされた PGT を介した PGE2 の調節機構は、PGT による PGE2 分泌の新しいメカニズムを提唱するとともに、炎症性疾患および大腸癌治療のために PGT を標的とした新たな薬物療法の創成が期待される。.

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プロスタグランジン輸送体 PGT を介した PGE2 調節機構 （英文題名）

プロスタグランジン輸送体 PGT を介した PGE2 調節機構（英文題名）