博士論文審査報告書

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博士論文審査報告書

論 文 題 目

アフリカツメガエル肝臓における赤血球 前駆細胞の特性と組織局在性に関する研究 Cellular properties and tissue localization

of erythroid progenitors in the liver of Xenopus laevis

申 請 者

奥井 武仁 Takehito OKUI

生命理工学専攻 分子生理学研究

2016 年 10 月

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ヒ ト の 全 細 胞 数 は ， 最 近 の 研 究 （S e n d e r ら ，P L o S B i o l .，2 0 1 6） に よ る と 約 3 0 兆 個 で あ り ， そ の う ち の 8 4％ は 赤 血 球 で あ る 。 赤 血 球 の 寿 命 は 1 2 0 日 で あ り ， 毎 日 全 体 の 1 2 0 分 の 1， す な わ ち 2 0 0 0 億 も の 寿 命 が 尽 き た 赤 血 球 が 破 壊 さ れ ， 同 時 に 新 生 赤 血 球 と 入 れ 替 わ る 。 こ う し て 循 環 赤 血 球 数 が 恒 常 的 に 調 節 さ れ ， 生 命 活 動 に 必 要 と な る 酸 素 が 全 身 へ 運 ば れ る 。 赤 血 球 造 血 の 調 節 ・ 制 御 は 生 命 維 持 の 根 幹 で あ り ， 主 に ヒ ト や マ ウ ス な ど の 哺 乳 類 を 対 象 と し て 研 究 が 進 み ， 知 見 が 集 積 さ れ た 。 血 球 産 生 を 担 う 臓 器 （ 造 血 器 ， 造 血 巣 ） は ， 動 物 種 に よ っ て 差 異 が あ り ， ま た 同 一 動 物 種 で も 個 体 発 生 の 進 展 と と も に 遷 移 す る 。 そ の た め 造 血 器 の 組 織 環 境 と ， 造 血 幹 細 胞 か ら 成 熟 血 球 に 至 る 血 球 系 細 胞 と の 間 の 相 互 作 用 は ， 興 味 深 い 課 題 と な っ て 主 に マ ウ ス モ デ ル で 解 析 さ れ て き た 。 し か し 赤 血 球 造 血 は 脊 椎 動 物 に 共 通 す る 仕 組 み で あ る 。 よ り 広 範 な 生 物 種 を 対 象 に し て 赤 血 球 造 血 制 御 の 普 遍 性 や 多 様 性 を 調 べ る こ と に よ り ， 新 た な 発 見 へ 繋 が る こ と が 期 待 で き る 。 実 際 ， 小 型 魚 類 ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ を モ デ ル に し て 数 多 く の 新 知 見 が 蓄 積 さ れ て き た 。 本 研 究 は ， 両 生 類 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル （X e n o p u s l a e v is） を 対 象 と し た 実 験 血 液 学 的 研 究 で あ る 。 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の 主 た る 赤 血 球 造 血 器 は ， ヒ ト や マ ウ ス の 胎 生 期 と 同 じ く 肝 臓 で あ る 。 幼 生 ， 成 体 と も に 肝 臓 が 赤 血 球 産 生 を 担 い ， 大 規 模 な リ モ デ リ ン グ を 伴 う 変 態 の 前 後 で 不 変 で あ る 。 本 研 究 は ， 幼 生 ， 成 体 の 肝 臓 に あ る 赤 血 球 前 駆 細 胞 の 増 殖 ・ 分 化 を 調 べ ， さ ら に 肝 臓 に お け る 成 熟 赤 血 球 と 赤 血 球 前 駆 細 胞 の 局 在 を 組 織 化 学 的 手 法 に よ り 調 べ た 。 ま た 定 常 状 態 を 逸 し て 急 性 溶 血 性 貧 血 あ る い は 急 性 失 血 性 貧 血 を 発 症 し た 際 の 赤 血 球 造 血 応 答 に お い て ， 赤 血 球 系 細 胞 の 質 的 ・ 量 的 動 態 を 詳 細 に 解 析 し た 。 本 論 文 は 次 の 6 章 で 構 成 さ れ て い る 。

第 1 章 で は ， 関 連 研 究 の 歴 史 ， 血 球 の 形 態 ， 機 能 ， 造 血 の 仕 組 み が 概 説 さ れ て い る 。 ま た ， ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル を 選 択 し た 意 義 や 技 術 的 課 題 な ど が 解 説 さ れ て い る 。 査 読 の 結 果 ， 造 血 発 生 に 関 連 さ せ て ， 最 新 の 議 論 と な る 加 齢 と 造 血 の 連 鎖 に つ い て 記 述 を 追 加 し つ つ ， 両 生 類 造 血 研 究 の 意 義 を 位 置 付 け る こ と を 求 め た 。 ま た ， 先 行 研 究 に よ る 知 見 を 整 理 し ， 本 論 文 に お け る 論 旨 を 明 瞭 に す る こ と を 求 め ， そ れ ら が 反 映 さ れ た 。

第 2 章 で は ，変 態 期 の 両 生 類 の 組 織 構 造 や 発 現 す る 分 子 群 の 変 化 を 概 説 し ， 変 態 前 後 の ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 肝 臓 に お け る 赤 血 球 前 駆 細 胞 の 性 状 を ま と め て い る 。 変 態 初 期 お よ び 後 期 の 肝 臓 細 胞 を ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 赤 血 球 産 生 因 子 エ リ ス ロ ポ エ チ ン （X e n op u s l ae v i s e r y t hr o p o i e t i n：x lE PO） 存 在 下 で 培 養 し ，x lE PO 受 容 体 （x lE P O R），G at a 1，G a t a 2，β - G l o b i n の 遺 伝 子 発 現 変 動 を 調 べ ，赤 血 球 前 駆 細 胞 の x lE P O 応 答 性 を 比 較 し て い る 。組 織 環 境 が 大 き く 変 化 す る 変 態 期 に も 肝 臓 の 赤 血 球 前 駆 細 胞 が 保 持 さ れ た 。g l o b i n 型 の ス ウ ィ ッ チ ン グ な ど ，赤 血 球 性 状 は x lE P O 応 答 性 に 変 化 し た 。査 読 の 結 果 ，肝 発 生 に 関 連 す る 組 織 知 見 を 加 え た 論 述 の 強 化 を 求 め ， こ れ ら が 反 映 さ れ た 。

第 3 章 で は ， 造 血 器 の 組 織 形 態 を 概 説 し ， ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 肝 臓 に

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含 ま れ る 赤 血 球 系 細 胞 の 計 数 結 果 を 示 し た 。 ヘ モ グ ロ ビ ン 染 色 と ，x lE P O R 免 疫 染 色 を 施 し た 肝 臓 由 来 細 胞 中 の 成 熟 赤 血 球 と 赤 血 球 前 駆 細 胞 を 計 数 し ， 全 有 核 細 胞 の 約 2 5 %が x lE PO R 発 現 赤 血 球 前 駆 細 胞 で あ り ，マ ウ ス 骨 髄 の 約 3. 7 倍 で あ る こ と か ら 赤 血 球 造 血 の 規 模 や 動 態 が マ ウ ス と は 大 き く 異 な る こ と が 示 さ れ た 。 査 読 の 結 果 ， 造 血 器 の 組 織 形 態 学 的 特 性 の 記 述 に 際 し ， 比 較 血 液 学 的 視 点 の 強 化 を 求 め ， そ れ ら が 反 映 さ れ た 。

第 4 章 で は ， ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の 貧 血 モ デ ル の 作 出 法 と 性 状 を ま と め て い る 。 フ ェ ニ ル ヒ ド ラ ジ ン 投 与 に よ る 従 来 の 急 性 溶 血 性 貧 血 モ デ ル に 加 え ， 薬 剤 に よ る 組 織 傷 害 回 避 の た め ， 新 た に 瀉 血 に よ る 急 性 失 血 性 貧 血 モ デ ル を 作 出 し た 。 両 モ デ ル の 末 梢 赤 血 球 数 と 肝 臓 内 の 成 熟 赤 血 球 数 お よ び x lE P O R 陽 性 赤 血 球 前 駆 細 胞 数 の 相 関 を 解 析 し ， 貧 血 に 応 答 し て 肝 臓 の 赤 血 球 前 駆 細 胞 数 は 正 常 時 と 比 較 し て 2 倍 以 上 増 加 す る こ と を 明 ら か に し た 。査 読 の 結 果 ， 本 章 の 実 験 経 過 と 結 果 は 仔 細 に 記 載 さ れ て お り ， 申 し 分 な い 。

第 5 章 で は ， 成 体 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 肝 臓 に お け る 赤 血 球 産 生 の 動 態 と 前 駆 細 胞 の 組 織 内 局 在 を ま と め て い る 。5-ブ ロ モ- 2 ’ -デ オ キ シ ウ リ ジ ン（B r d U） 標 識 法 に よ る 生 体 内 細 胞 増 殖 を 解 析 し ， 各 種 の 貧 血 モ デ ル で は 正 常 時 に 比 べ て 細 胞 増 殖 が 約 1 0 倍 亢 進 す る こ と を 明 ら か に し た 。ま た ，x lE P O R 陽 性 細 胞 の う ち 約 8 0 %が 類 洞 内 壁 に 隣 接 し て 局 在 し ， 類 洞 内 皮 細 胞 を 介 し た 接 着 分 子 群 が 足 場 と し て 機 能 す る と 結 論 し た 。 加 え て ， 細 胞 分 裂 能 が 低 下 し た 造 血 前 駆 細 胞 （s l o w c y c l i n g 細 胞 ） が 肝 臓 に 存 在 す る こ と を 示 し た 。 査 読 の 結 果 ， 本 章 の 実 験 経 過 と 結 果 は 仔 細 に 記 載 さ れ て お り ， 申 し 分 な い 。

最 終 章 で は ， 本 研 究 の 総 括 と し て ， 一 連 の 解 析 結 果 を 統 合 し 赤 血 球 造 血 の 規 模 と 動 態 を 示 し ， 将 来 の 展 望 を ま と め て い る 。 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の 成 体 肝 臓 で は 1 日 に 貪 食 細 胞 が 1 細 胞 あ た り 1 . 4 細 胞 の 赤 血 球 を 破 壊 し て 合 計 2

×1 0⁷ 個 の 赤 血 球 が 破 壊 さ れ ， 同 数 の 新 生 赤 血 球 が 血 液 循 環 へ 補 給 さ れ る 。 そ れ ら は S l o w c yc l i n g 細 胞 を 経 て 1 . 3×1 0⁸細 胞 の E P O 応 答 性 前 駆 細 胞 か ら 派 生 す る 。 査 読 の 結 果 ， そ の 他 の 動 物 の 知 見 と の 比 較 を 強 化 し ， 本 研 究 の 科 学 的 な 価 値 を 明 瞭 に す る こ と を 求 め ， そ れ ら が 反 映 さ れ た 。

以 上 を ま と め る と 本 研 究 は ， 両 生 類 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の 赤 血 球 造 血 が 幼 生 か ら 成 体 に 至 る ま で 肝 造 血 を 維 持 さ れ る こ と に 着 目 し ， 赤 血 球 前 駆 細 胞 の E PO 応 答 性 の 増 殖 ・ 分 化 を 指 標 に し た 細 胞 特 性 と ，赤 血 球 造 血 を 支 持 す る 肝 組 織 環 境 を 解 明 し た 。 特 に 赤 血 球 造 血 の 規 模 の 変 動 に つ い て ， 定 常 状 態 お よ び 貧 血 ス ト レ ス 状 態 と で 定 量 解 析 し て 比 較 し た 結 果 は ， 動 物 モ デ ル と し て 先 進 的 で 貴 重 で あ る 。 さ ら に 特 筆 す べ き こ と は ， 哺 乳 類 以 外 の 動 物 で は 初 め て 未 分 化 な 造 血 前 駆 細 胞 候 補 と な る s l o w c y c l i n g 細 胞 を 肝 臓 に 発 見 し ，そ の 組 織 分 布 を 明 ら か に し た こ と で あ る 。 以 上 の 成 果 は 脊 椎 動 物 の 造 血 シ ス テ ム の 多 様 性 や 普 遍 性 を 理 解 す る 上 で 極 め て 重 要 で あ る 。 本 研 究 を 礎 と し て ， 実 験 血 液 学 ， 動 物 学 に お け る 新 視 点 の 研 究 が 切 り 拓 か れ る こ と が 期 待 で き る 。

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よ っ て 本 論 文 は 博 士（ 理 学 ）の 学 位 論 文 と し て 相 応 し い も の で あ る と 認 め る 。

2 0 1 6 年 9 月

審 査 員

（ 主 査 ） 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 理 学 ）（ 早 稲 田 大 学 ） 加 藤 尚 志

早 稲 田 大 学 教 授 理 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ） 筒 井 和 義

早 稲 田 大 学 名 誉 教 授 理 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ） 並 木 秀 男

東 京 大 学 名 誉 教 授 医 学 博 士 （ 東 京 大 学 ） 浅 野 茂 隆 早 稲 田 大 学 名 誉 教 授 ・ 招 聘 研 究 教 授