関 す 実験的研究 離 細胞 単 培養 寒 天培地を用 重

金沢大 学 十全医 学 会碓 誌 第9 7巻 第4 号 8 6 9−^{8 82 く1 9 8 8}ン

二 重寒天 培 地 を用 ^い た シ ^ュ ワ ^ン細 胞 ^の単離培養 に

関 す ^る 実 験 的 研 究

金沢大学 医 学 部 整形外科 学 講 座 は任^こ野村 進 数 授I

浜 岡 寛 士

く昭和^{6 3}年⁸ 月3 1日受 付1

8 6 9

シュ ワ ン細 胞^の単 離 培 養は技 術 的に困 難で． 未だ完 全な も^のは見 当た ら ない． そ の最 大^の原 因は 培 養 系^への線 維 芽 細 胞^の混 入 である^t 本研 究は^二重 寒天培 地を 用^いて線 推 芽 細胞を分 離^し， シュ ワ ン細 胞^の単 離 培 養 系を得ること を目 的と し た^． 方 法は ウイ スタ ^ー 系^のラットの坐 骨神 経を用^いて組織 片培 養 を行^った^． 培 養細 胞^を採 取し単 離 細 胞 浮 遊 液を作成し た^． これ を Hu m a n Tu m o rClo n oge nic A s s ay に

準じ て^二重寒天の上層^に播 種し培 養を行^っ た^． その結 乳 軟寒天内^に形 成さ れ たコ ロ ニ ^ー を採取し， 再 び単 層 培 養 系^へ移 行さ せ る と 小 型で紡 錘 形を 呈 し リ ボ^ン状に連な るシ ^ュワ ン細胞の形 態 学 的 特徴を有し た細胞が観 察さ れ た^． 電子顕微 鏡に て観 察す る と^コ ロ ^{ニ ー} を形 成し た細 胞は ほ ぼ同 ^一 の形 態を 示 し， 胞 体 札 特^に核 周 囲^{に ゴ ル} ジ装置， ミ ト^コ ンド リ ア が多く見ら れ^， 粗 面小胞体， リ ボ ソ^ー ムも散 見さ れ る と言う 過去に報 告さ れ ている培 養^{シュ ワ ン}細 胞の電顕 的特 徴と合 致す る所 見が得ら れ た． 更に特 徴 的な 所 見と し て 1う 細 胞 接 合 部^のデス モゾ^ー ム様 構 造． 21 胞 体 内^に豊 富^{に か}つ集 簾 性に存 在す る中 間 径

フ ィラメ ント が挙げ ら れ た． しかし， 基 底 膜は存 在し な かった^． S⁻1 0 0 蛋 白を 用^いた免疫 蛍 光 抗 体 法に て， コ ロ ^{ニ ー} よ り採 取し再び単 離 培 養 系^へ移 行さ せ た細 胞は す^べて陽性を示 し た^． 以 上 の所 見よ り^{コ ロ}

ニ ^ー を形 成し た細 胞は^シュ ワ ン細 胞^である と結 論し た^． 以 上 よ り本 法は線 推 芽 細 胞を全く含ん で^いな^い シ^ュワ ン細 胞^の単 離 培 蓑 系を得ること が可 能な方 法^である と考え ら れ た^．

K ey W ords S chw a n n c ell， C ultiv atio n_，p^{u r}ific atio n _，d o uble s oft ag^{a r}

シュワ ン細胞は末梢 神経の支 持 組 織^{と し て}働く重 要な細胞で あ る．in viv o での シュ ワ ン細 胞^の形 態^お よ び機 能に関し て は数 多く^の報 告が あ る ^佃Iが，in Vitr o での報 告は少な^{い7 川} ． その大き な 理由は神 経 線維^の培 養^では^， その構 成 細 胞^であ るシ ュ ワ ン細 胞

の みな ら ず線椎 芽細 胞が 混合し て増 殖す る た めシ ュ

ワ ン細 胞の単離 培 養を行う^こと が困 難であ る点^にあ る． これ まで に線 維 芽 細 胞^の混 入 を防止 す る目 的^で 種々 の試みが な さ れて釆た． 即 ち， Cy tO Sin e a r ab ト

n o side，flu o r ode o xyu rid in e 等^の代 謝 指 抗 剤を作周 さ せ線 鰊 芽細 胞を 選択 的^に除 去す る試み^{1 0 ，}， 線 推芽 細 胞の表 面抗 体を 用 心て線 維 芽細 胞を除 去す る試^{み11 I}，

無血清 培地_{を 用}い て線 維 芽細 胞の発 育^を抑 制^{す る}試

A b br e viatio n s こ C M R L⁻1 0 6 6， C onn a ugh ^t

み¹²等で あ る^． しかし， これ らの方法^では完全^には線 推 芽 細 胞を除 去でき ない こと や， 使用 す る薬 剤が シュ ワ ン細 胞 自 体^に対し て も細 胞 毒 性が あ る等^の問 題 点を有し ていた^．

他 方， 現 在， 抗 癌 剤感 受 性 検査法の ^一 つ と し て脚 光を浴 び て^い る Hu m a n T u mo r C lo n og^{e n}ic

As s ay^{1 3 1} では， 二重寒天培 地を 用^いて腰 瘍 細 胞の単

離培 養を行^っ て^いる^． 即ち， 腰 瘍 細 胞^の中 心で あ る

Ste m C ells は軟 寒天内で分 裂， 増殖を繰り 返 しコ ロ ニ ^ー を形 成す る が， 線 維 芽 細 胞は軟 寒天内^{に お いて} 増 殖せず， コ ロ ニ ^ー形成^には関 与し な^{い1 心}こと が明ら かになって^いる． そこ で シ ュワ ン細 胞は腫 瘍 細 胞と 異る が^， 本 法を応用 す ることによ り線 推 芽 細 胞を除

M ed ic al R e s erch Labo r ato ry M ed ia⁻10 6 6_i D E A E⁻dextr a n_，dieth_yla min o eth_yl⁻de xtr a n三E D T A，eh_yle n ed ia m in etetr a a c etic a cid_三F C S，

fetal c alf s eru 町 F I T C，flu ore s c ein is othio cy^{a n a}te三 H E， he m ato x ylin e a nd e o sin e 三H I，

8 7 0

去し て^{シ ュワ ン}細 胞の単 離 培 養^が得ら れ な^{い か}を実 験 的^に確か め た^．

材 料^およ び 方 法 I ^． 材 料^の採 取

実 験 材 料と し て生 後3 ^へノ5 日日の ウ イ^ス タ ^ー 系 ラッ ト の坐 骨 神 経を使用 し た^． ラッ ト を腹 臥 位^に固 定し無 菌 的^に皮 切 後， 大腿 四頭 筋^およ び大腿 ^二頭 筋 の間よ り侵入 し， 坐 骨神 経^を展 開^{し た． その上で坐} 骨 結 節 部よ り腰 骨 神経分岐 部までく約¹．5c mI を採 取 し，10 0単 位ノ^ml の^{ペニ シ}リ^ン， 1 0伸gノ^ml の スト^レ プ トマ イ ^{シ ン} くp^{e n}icillin str ep t^{o m}y^cin s olutio n，

G ibc o， Gr a nd Isla nd，N ^． Y^．1 を含む培 養 液 亡^Mc− Coy

，

s 5 A くG ibc oI w a shコ^の中^に静 置し た．

I工． 組織片培 養 く^{e x}pla nt cdtu r eコ 採 取し た 坐骨 神 経 片を M cCoy

，

s 5 A w a sh 液 く^＋

1 ％P Sう 内^{で で}き る だ け す み や^{か に}無 菌 的^{に ハ}サミ で細 切し組織 片を作 成し た^． これ を プ ラ^スチ ックフ ラスコ く井2 5 1 0 0，Co r ning G la s s W o rks， Co rning，

N ^． Y^．1 内で 1 5％he at⁻in a ctiv atedくH Il fetal c al f

S e r u m tF C Sl を含 む Ro s e w ell Pa rk M e m o rial In stitute M ed ia⁻1 6 4 0くR P M I^．1 64 01 培 養 液を 用^いて 3 7 でのも と^で培養し， 3 日日 毎^に培 養 液の交 換を行^っ

た． ま た， Lab⁻Tek チャ ン バ ^ー スラ イ ド 揮4 8 0 1 く三 光 純 薬， 東 京フ 内^で同様^に培 養を行^い中 性 緩 衝 液^ホ

ル マリ^ンで固 定し， he m ato xylin e a nd e o sin くH El 染 色を行った く囲 い^．

HI^． 単 離 細 胞浮 遊 液^の作 成

組 織 片 培 養を約2 週 間行^いプ ラ^ス チック^フラ^スコ が^{コン フ ルエ ン}ト と な^った^こと を確 認し て単 離 細 胞 浮遊 液を作 成し た^． 即ち， pho sphate buffe r s alin e

くP B Sl で洗浄 後，0 ．0 2 5％^try psin ＋0．0 2％ethyle n e

d ia min etetr a a c etic a ci dくE D T Aト液に て3 7⁰C ，3 0分 間 処理 し た^．

N ^{． ニ}重寒天培地^の作 成 1 ^． Ba s elay^{e r} の作 成 M cCoy

，

s 5 A 培 養 液5 0 0ml に H I^．F C S 5 0ml， H I 馬血清 くG ibc oI 25ml， ピ^ルビン酸ナ ト リ ウ^ム く2^．2

％1 5ml_， L⁻セリ^ン く2 1^m gl mり¹ml， し グ^ル タミ ン

く2 00m M1 5ml と P S 5ml を加 え て ^{e n r}iched M cCoy^，s5 A 培 養 液を作 製し た^． さ らに こ の4 0ml に

try p tic s oy br othく3％， D ifc o， Detr oit_， M Il l Oml，

L⁻ア^{ス パ}ラ ギ^ン く6^．6m gl ^mlJ O^．6ml，diethyl⁻ami n o⁻

he at^．in a ctiv ated _三P B S

， pho sphate buffer

eth_yl のE A El −^{デ キストラ ン く5 0m} gl ml，P ha r m⁻ a cia， U_{p p}s ala， Sw ede可 ^0．3ml を 加え plating

m ed iu m を作 成 し た^{． こ}れ に 3 ％ ba cto aga r

くD ifc ol を 混合し て最 終 濃 度0．5％^の軟 寒天 と な る よ

う に調 整し， そ の 1ml を ba s e laye r と して

3 5^{m m} 6穴^マルチ ウ^エルデ ィッ シ^ュ 丼3 046 C Falc o n

Pla stic s，Ox n a rd，C^．AJ． の各デイ シ ^ュに分注し た^．

ll ^{Sciat ic n er v e fr o m 3−5 da}ys r ats

阜

2j ^Expla nt c ul tu r e

壬＋

31 ^{S in}gle c el l s u sp^{e n s}io n

ヲ■

41 ^{Do ub le a ga r c ul tu r e}

1

51 Colo ny f o r ming

l

61 ^{S in}gl ^{e c e}l l s u sp^{e n s}io n

二■

71 Se c o nda ry c ul tu r e

F i_g．1． Flo w diagr a m of steps in pu rific atio n Of S^ch w a n n c ells． 1J Sciatic n e r v e s w e r e Obtain ed fr o m −3−^{5 da}y^s old r ats． T he e xpla⁻ nts w e r e pr epa r ed b_y c ut ting ^{s c}iatic n e r v e s^．21 T he e xpla nts w e r e c ultu r ed in R P M I⁻164 0

m ed iu m with 1 5％fetal c alf s e r u m くF C Slfo r7 days． 31 T he single c ell s u spe n sio n w a s

ha rv e Sted by try psin e a nd E D T A ^．41 T he c ells W e r e plat_ed iⁿ 3 5m m Petri dishe s． T he d i^she s W e r ein c ubated at 3 7⁰C in 7−^{7．5％C O2}−^{humi −}

d ified air fo r 5，^{6 w e eks． 5}J T he c olo nie s w e r e fo rm ed．61 T he c olo nie s w e r e obtain ed fr o m aga r by u sing Pa ste u r pipet te u nd^{e r} in v e rt_ed ^mic r o s c ope． T he c olo nyfo rmi ng ^{c e}lls W e r e ha r v e sted a s a sl ngle c e11 s u spe n sio n by try p^sin a nd E D T A ^．71 ^{T h}e c ells w e r e c ultu r ed

a s s e c o nda ry ^{c u}ltu r e in R P M I⁻16 4 0 wi th 15 ％ F C S ^．

s alin eニP S

， p^{e n}icillin⁻Str ep t^{O m} y^Cin三R P M I⁻1640，

Ro s w ell P a rk M e m o rial In sti_tute M edia⁻16 4 0．

二重 寒天培 地を 伺^い たシュ ワ ン細 胞の単 離 培 養

2 ^． P latiⁿg laye r の作 成

培 養 液C M R L l O 6 6くG ibc oJ 5 0 0^ml に H I 馬血清 75ml， 塩 化カル シウム く1 0 0m M1 2 0ml， イ^{ン ス}リ^ン く¹0 0 Ul^mり1 0ml， ビ タミ ンCく3 0m MJ5ml，L⁻グ^ルタ ミ ン く2 0 0m M l ^lOml， P S 5ml を加え て ehriched C M R L l O 6 6 培 養 液を作 成し た^． さ らに この 4 0ml に つき L^一ア^{ス パ}ラ ギ^ン く6．6m gノmり0．6ml，D E A E ザ キ スト ラ^ン く5 0^m gノm り0^．3ml， 2 ⁻ メル カ プ ト^エ タ ノ ^ー ル 川^．5 X l O−³MI O．4ml を加え^て do ub le e n riched C M R L l O 6 6 培 養 液を作 成し た^． 次^いでこ のdo uble e n riched C M R L l O 66 培 養 液^{5．4ml に} 3％ba cto aga r O．6ml を加え0^．3％^の軟 寒天 を作 成 し た^． そ して上述し た単 離細 胞 浮 遊 液が軟 寒天中^に 5^Xl O咽ノ^ml の細 胞 密 度と な る様^に調 整し た^． これ を 先^に作成し て お^いた ba s e laye r の 上^に重層さ せ て platinglaye r と し た く囲²l．

V ． ニ重寒天培地^の培 養

以 上の如く作 製し た^二重 寒天培地を 3 7⁰C水 蒸 気 飽 和状態で7．0 ^へ7■5％C O2 を含ん だ培 養 器で培 養し，

以後経 時 的に倒 立 顕 微 鏡に て観 察を行っ た．

V I． コ ロニ ^ー 形 成 細 胞 の単 層培養 系 ^へ の移行 くSe c o nda ry c ultu r el

二重 寒天培 地で培 養 後5 ^ノー 6週^で軟 寒天内にコ ロ ニ ー の形成が 認 め ら れ た^． そ^こで^{コ ロ ニ ー} を倒 立 顕 微 鏡 視 下^{に パ ス ツ ー ル} ピペ _ッ ト を用い て 採 取し Try p^sin⁻E D T A 液^にて 3 7⁰C 3 0 分間 処理 し た^． こう し て得ら れ た単 離 細 胞を プ ラスチッ クフ ラ ス コ 内で R P M I⁻1 6 4 0培 養 液 く15％H I⁻F C S ＋1 0％P SI を 用^い てs e c o nda ry c ultu r e と して培 養し， 以後^これ を倒 立

C

妄

^コ

寧^{a s e}＋^{L ay e r 二}く^1．O ^mり

8 7 1

顕 微 鏡に て経 時 的^に観察し た^． ま た，

一 部^の細 胞は

チャ ン^{バ ー} スラ イ ド内で同 様^に培 養を行い 10％ 中 性 緩 衝 液^{ホ ル} マリ^ンで固定し， H E 染色を施し た^．

用^． コ ロ ニ ^ー 形成 細 胞の電子 顕微 鏡 観 察

コ ロ ニ ー

を軟 寒天 ご と鋭利な カ ミ ソ リ^にて切 離し 取り出し た^． これ を2^．5％ グ^ルタ^{ー ル}アルデヒド は

コディ ル酸旗 衝 液^にてpH 7．4 に調 掛 ^にて前 固定し た後2 0％4酸 化オスミ ウム くカコ アィ ル酸 緩 衝 液^に

て pH 7^．4 に調 整つにて後 固定を行った^． 次^いで^エタ ノ ^ー ル上昇 系 列に て脱水 後， 酸 化プロ ピレ ン に て置 換し^エボン樹 脂^にて包 埋し た． 包 埋さ れ た試 料は ダ イ ヤモ ンド ナ イ^フを 用^い L K B^．U ltr ato me で超 薄 切 片を作 成し， 酢 酸ウ ラ^{ニ ー ル}， ク^エ ン酸 鉛^{の 二}重 染 色を行った後， 日 立電子顕 微 鏡を 用^いて観 察し た^．

用^一Se e o mda 町 e山tu r e の S^．1 0 0 茸白 を 用^い た免 疫 組 織 学 的 観 察

チャ ン バ ^ー スラ イ ド上 の s e c o nda ry ^{c u}ltu r e の細 胞を P B S で3 回洗 浄し た後， 1％^パラ ホル ム ア^ルデ ヒド で室 温， 2 0分 間 固定し た^． P B S で洗 浄 後ア^セト ンで 4 ⁰C， 7 分 間 固定し た^． 次^いで間接 蛍 光 抗 体 法 を行った^． 非 特 異 的反応を抑 制す る た めに 10％^に稀 釈し た 正常ヤギ 血 清 くDako^．im m u n oglobulin s als，

De n ma rkl を2 0⁰C ， 2時 間作 用さ せ た^， P B S で3 回

洗 浄 後，

−一次 抗 体と し て抗S^tl OO 蛋 白ウ サ ギ 工gG くDako Co rpo r atio n，Sa nta Ba rba r a，C Al を加え3 7

OC， l時 間 作用 さ せ た． P B S で3 回洗 浄 後F I T C 標 識 抗ウ サ ギ IgG ヤ ギ I_gG くCap p^el Labo r ato rie s

In c．，Co chr a n ville，P Al を加え3 7^OC ， 1 時 間作用 さ せ た． P B S で 3 回洗 浄し た後，9 0％ グリ^セリンで封

P tating L ay ^{e r} こく^{1 ．}O^mり

5 ^X l O ^{5 c e11s} in

d o ub^le e n riched C M R L

with O．3 ％ ^a_g^{a r}

−■ ■■

−

■ ■■ ^書J J

■ ■■ ．

D o ubl^{e s o}ft ag^{a r} E n riched M cC oy

，

s w a sh

With O．5 ％ ag ^{a r}

Fig^■2^． Co mpo n e nts of do ub le s oft aga r fo r c olo ny fo rmi ng ^of the

Schw a n n c ells．