総 説
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東 女 医 大 誌 第 時 第6号 ) 頁 166~172 平 成26年12月l
移植と最先端医療
最先端医療 (
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)
組織
食道再生細胞シートの臨床応用
東京女子医科大学消化器外科 東京女子医科大学先端生命医科学研究所大 木 岳 志
( 受 理 平 成26年9月19日)Transplantation and the Most Advanced Medical Treatment The Most Advanced Medical Treatment (1) Tissues Application of Cell Sheets for Esophageal Regeneration Takeshi OHKI Department of Surgery， Institute of Gastroenterology， Tokyo Women's Medical University Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science， Tokyo Women's Medical University Endoscopic submucosal dissection (ESD) has become a standard endoscopic treatment technique for early gastrointestinal cancer. At our hospital， we conducted a clinical study on regenerative medicine in 10 patients with early esophageal cancer， by using oral mucosal epithelial cell sheets to prevent stricture. Epithelial cells ob -tained from the patients' isolated oral mucosal tissue were seeded on temperature-responsive culture dishes and cultured for 16 days. The sheets were then transplanted onto the esophageal ulceration site after esophageal ESD. This regenerative medical treatment， which aims to achieve early suppression of inflammation and preven四 tion of esophageal stricture， has already been shown to have exceptional outcome in terms of reconstruction of the esophageal epithelium. In the present study， we focused on the regenerative medicine aspect of gastroen -terology， and to our knowledge， this is the first study of the application of cell sheets in a clinical setting (at Tokyo Women's Medical University). In this study， we noted that this technique exhibited promising results， and we be -lieve that it will eventually become an essential procedure for cancer treatment.
Key W ords: ESD， esophageal carcinoma， esophageal stricture， regenerative medicine， oral mucosal epithelial cell sheet はじめに 再生医療技術を用いた先端医療として，早期食道 癌の内視鏡治療患者に対し細胞シート技術を応用し た再生医療の臨床研究を進めてきた.本研究は束京 女子医科大学病院において初めて細胞シート技術を 用いた臨床研究である.本稿では前臨床的な大動物 実験からその臨床研究に至る道程について概説す る.
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食道 ESDと食道狭窄 早期食道癌とは粘膜内病変でリンパ節転移のない ものとされ，内視鏡的粘膜切除術 (endoscopi cmu-cosal resection : EMR) や内視鏡的粘膜下層剥離術 (endoscopic submucosal dissection : ESD)といった 内視鏡治療が広く行われている.それに対し，食道 癌の外科手術は内視鏡治療と比べて侵襲性が高く， 医学の進歩による低侵襲性治療への期待から食道 ESDの拡大適応が望まれている. ESDの手技は腫-166-11 Fig. 1 Esophagealendoscopicsubmucosal dissection (ESD) (A)Esophageal carcinoma(white light). (B) Esophagealcarcinoma(iodine staining). (C) Dissection of the esophageal submucosa using clip traction. (D) Esophagealulceration after ESD. 蕩の広さに関係なく切除可能なため，広範囲な病変 でも積極的に行われてきた
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1)1)2). ところが，広 範囲の食道ESD
ではESD
後に生じる人工潰蕩が 自然治癒する際に疲痕化を来たし 食道内腔が狭く なってしまう.もともと食道は解剖学的に狭いため， 容易に狭窄を来たし 食物通過障害や摂食障害を引 き起こす(
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一旦狭窄を来たすとそれを解 除するために，通常，内視鏡的バルーン拡張術を頻 回受ける(
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D)ことになり，拡張時の廃 痛や拡張による潜在的な穿孔のリスクが存在する4) そのために.2
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月発行の日本食道学会食道診 断・治療ガイドライン5)では内視鏡的粘膜切除術の 適応基準として絶対適応においては周在性2
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以下 という大きさの制限因子を加え，周在性3
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以上の 切除は高頻度の食道狭窄のために相対的適応となっ ていた.2
.
口腔粘膜上皮細胞シートの内視鏡的移植術の 開発 前述のような食道ESD
後に生じる食道狭窄を予 防するため， 自己口腔粘膜組織から作製した培養口 腔粘膜上皮細胞シートを用いて，新たな再生医療的 治療法を開発し，その臨床応用に向け研究を進めて きた. 本学先端生命医科学研究所の岡野光夫教授ら勺ま，p
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という温度応答性高分 子を培養皿表面に共有結合させた“温度応答性培養" を開発したこの温度応答性培養皿の表面は，一般 的に細胞培養に用いられる温度の3
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で疎水性と なり.3
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以下に低温処理すると親水性に変化す る.親水性に変化した培養皿表面が水和するため， 細胞 で で、l
枚の細胞シ-トとして回収することがでで、きる(
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.細胞シートの底面には，培養中に沈着した フイブロネクチンやラミ ニンなどの接着タンパク質 を含む細胞外マトリックスが存在する7)8)ために，細 胞シ一 トは様々な組織や臓器に移植することが可能 でで、ある9川)ωi川ω0)2
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年頃から細胞シ一ト技術を応応、用した食道ESD
後狭窄に対‘する新たな治療法の開発を目的に 基礎研究を開始したた. まずず、始めに 食道再生の細胞 -167-Fig. 2 Esophageal stricture (A) Esophageal stricture 2 weeks after endoscopic submucosal dissection without trans -plantation of cell sheets. (B) Endoscopic balloon dilation for esophageal stricture. (C) Crush wound after endoscopic balloon dilation. (D) The stricture ceased after performing the endoscopic balloon dilation procedures 10 times (in 11 weeks).
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Fig. 3 Cell sheet technology (A) At 370 C， the cell sheet is attached to the surface of the dish. (B)Because the surface of the dish becomes hydrophilic at temperatureslowerthan 320 C， the cell sheet can be detached from itand harvested in one piece. ソースとして食道粘膜と同じ扇平上皮細胞からなる 口腔粘膜組織を選択した特に口腔粘膜(頬粘膜)は 創傷治癒が早く，組織採取時の穿孔のリスクがない 点から臨床応用に有利と考えた.次に，口腔粘膜上 皮細胞シート(扇平上皮細胞シート)を食道ESD
後の潰蕩面に移植することで，熱傷における植皮の ように粘膜欠損部を治癒させることができないかと 仮説を立て大動物実験を開始した.イヌモデルを用 いて，口腔粘膜上皮細胞シートを経内視鏡的に移植 することに成功し 創傷治癒の促進と色素を用いた 細胞シート生着の証明を行った11)3
.
食道再生細胞シートの臨床応用に向けて 前臨床実験は終了したものの，この大動物実験で は，通常，上皮系細胞培養に使用するマウス由来線 F LO維芽細胞である
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細胞フィーダーレイヤーとウ シ胎児血清 (fetalbovine serum :F
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を使用して いたしかし“「異種移植の実施に伴う公衆衛生上の Fig. 4 An oralmucosalepithelial cell sheetforesoph -agealregeneration ina temperature-responsivecell culture(insert) (A) 13 感染症問題に関する指針」に基づく3
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株をフィーダー細胞として利用する上皮系 の再生医療への指針"ロ)の規制があるため，3
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細胞 の使用は臨床応用に際しては患者のコンブライアン スを低下させてしまう懸念が生じた.またFBS
の使 用には牛海綿状脳症 (bovinespongiform encephalo司 pathy :B
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のリスクを完全に排除することがで きないために，臨床応用するためには，3
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細胞もFBS
も使用しない新たな口腔粘膜上皮細胞シ一ト の作製条件が必要でで、あつたた.筆者らはj温昆度応答性カ ルチヤ一インサ一トを作製し これを用いることでで、3
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細胞もFBS
も 使 用 し な い 口 腔 粘 膜 上 皮 細 胞 シ一ト(
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心)の作製条件を見出した4
1ω3)ω 前臨床大動物実験の成果に基づき，2
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年にすで に東京女子医科大学倫理委員会によりヒト臨床研究 が承認されたた.その後，I
ヒト幹細胞を用いる臨床研 究に関する指針J
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ラインに準拠してGMP(Good Manufacturing
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比ceω)対応応、の細胞培養セン夕一の設備を新たに整え ~日}唱ー}へ弔司 (c) Fig. 5 Treatment of esophagealulcerationafter endoscopic submucosaldissection (ESD) usingoralmucosalepithelial cell sheets (A)Collectionof oral mucosaltissue from thepatient. (B)Culturefor 16 days ontemperature-responsive culturedishes. (C)Harvestingthe oralmucosalepithelial cell sheetsby reducingthe temperatureto 200 C. (D)Endoscopic cell sheet transplantationimmediatelyafter esophageal ESD. ハ 吋 d n h uFig.6 Clinical case (A) An oral mucosal epithelial cell sheet on a support membrane. (B) A large esophageal post-ESD ulceration. (C) Cell sheet transplantation using endoscopic forceps manipulated through an overture. (D) Iodine staining to confirm complete esophageal epithelialization. た. また細胞シート培養スペシャリストの養成，実 際に外来診察から内視鏡室での移植に至るまでの一 連の過程が円滑に稼働するような病院内システムの 構築を行った? 次に臨床症例を行う前に，ボラン ティアドナーから組織提供された口腔粘膜上皮細胞 シートを作製し大動物に移植するコールドランを 行ったベ そして2年間の準備期間を経て， 2008年
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月より患者登録を開始した凡 4. 口腔粘膜上皮細胞シートの内視鏡的移植術の 実際 ESD施行前に，局所麻酔下に患者の口腔粘膜組織 を採取した (Fig.5・A
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採取した口腔粘膜組織から タンパク分解酵素を用いて口腔粘膜上皮細胞を単離 し温度応答性カルチャーインサートで16日間培養 した(Fig.5-B).細胞シート培養中に感染がないこと をモニタリング，上皮細胞含有率などの出荷検査合 格後，移植に臨んだ.ESD当日に細胞シート移植用 の培養皿の温度を維持したまま細胞培養室から内視 鏡室内に設置した細胞シート移植用のインキュベー ターへ移送した術中， ESDの進行状況に合わせて 培養皿から低温処理で細胞シートを回収して (Fig. 4， Fig. 5-C)移植に備えた.移植は通常使用している 内視鏡を用いた.細胞シートはとてもやわらかいた め支持膜の上に載せ，生検錯子で支持膜を把持して (Fig. 6-A) ， ESD後の潰蕩面 (Fig.6-B)に移植した 食道入口部は狭いため，移植時にはオーバーチュー ブを挿入しワーキングスペースを確保して移植した (Fig. 5-C). 2011年までに 10例 に 施 行 し 潰 蕩 の 炎 症を抑えることで良好な潰蕩創傷治癒と狭窄抑制を 認めた (Fig.5-D，Table1
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10例中， EMRを施行 した第1例日を除く ESDを施行した 9例につい て，その成果をGastroenterology
誌に報告した凡現 在，スウェーデンのカロリンスカ研究所や長崎大学 と共同研究を開始しており，症例を集積中である. 5. 食道癌内視鏡治療ガイドラインの変化 食道ESD後の潰蕩糠痕狭窄に対する様々な研究 が進み2山 5)前述のように2007年 4月発行の日本食 道 学 会 ・ 食 道 診 断 ・ 治 療 ガ イ ド ラ イ ン5)における EMR適応基準の大きさの制限因子は， 2012年 4月 発行の日本食道学会・食道癌診断・治療ガイドライ ン26)では，適応から外され，[粘膜切除が3
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周以上 に及ぶ場合，粘膜切除後の癒痕狭窄の発生が予想、さ 一170-15 Table 1 Outcomes of the cell sheet treatment for achieving regenerative esophageal epithelium in the study at our hospital 狭窄の有無 1 i っ “ q J A ﹃A F U F O 月 i o O Q d n u 唱 Ei (-) (-) (一) (-) (+) (-) (一) (-) (一) (-) 切除標本径 (mm) 22x 17 43x36 21 x 11 43x 15 55x70 24x23 45x40 43x28 45x30 30x42 細胞シートの 移植枚数 1 ょ っ “ っ “ q J 門 i つ 中 司 i o O A 吐 氏 U ESD後潰療の 周 在 性 1/2 2/3 2/3 2/3 亜全周 112 3/4 2/3 3/4 3/4 切除方法 EMR ESD ESD ESD ESD ESD ESD ESD ESD ESD 病変表在型 IIc IIb IIc IIc IIc IIc IIc IIc IIc IIc 年齢/性別 52/男 性 70/男 性 73/男 性 73/男 性 65/男 性 64/男 性 55/男 性 80/男 性 70/男 性 68/男 性 症例
isopropylacrylamide ). J Biomed Mater Res 27: 1243-1251.1993
7) Kushida A， Yamato M， Konno C et al: Decrease in culture temperature releases monolayer endothe -lial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture sur -faces. J Biomed Mater Res 45: 355-362，1999 8) Yamato M， Utsumi M， Kushida A et al:
Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dis -pase by reducing temperature. Tissue Eng 7: 473 -480，2001 9) Yang J， Yamato M， Nishida K et al: Cell delivery in regenerative medicine: the cell sheet engineer -ing approach. J Control Release 116: 193-203，2006 10) Yang J， Yamato M， Shimizu T et al: Reconstruc -tion of functional tissues with cell sheet engineer -ing. Biomaterials 28: 5033-5043， 2007
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14) Takagi R， Yamato M， Murakami D et al: Prepa司
ration of keratinocyte culture medium for the clini -cal applications of regenerative medicine. J Tissue Eng Regen Med 5: e63-e73， 2011
15) http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/iryousaisei .html
16) Yamato M， Takagi R， Kondo M et al: Grand Espoir: Robotics in Regenerative Medicine. Journal of Robotics and Mechatronics 19: 500-505， 2007 17) Takagi R， Murakami D， Kondo M et al: Fabrica
-tion of human oral mucosal epithelial cell sheets for treatment of esophageal ulceration by endoscopic submucosal dissection. Gastrointest Endosc 72: れるため十分な術前説明と狭窄予防が必要である」 と の コ メ ン ト へ 変 更 さ れ た こ の よ う に 新 し い 治 療 法や研究が進むにつれ，癌の標準治療が少しずつ変 わり，患者の
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はより改善して いくと思われる.そのような意味で細胞シートによ る再生医療技術は，癌治療におけるー領域を担うと 考えられた. おわりに 本研究は，学内で大動物実験から開発を行い臨床 応用まで行うことのできた消化器領域初の細胞シー ト臨床応用の成功モデルである.本学で開発された 細胞シート技術を様々な分野で活用し臨床研究を推 し進める必要があると考えられる. 開示すべき利益相反状態はない. 文 献1)Oyama T， Tomori A， Hotta K et al: Endoscopic submucosal dissection of ear1y esophageal cancer. Clin Gastroenterol Hepatol 3 (Suppl 1): S67-S70， 2005 2) Fujishiro M， Yahagi N， Kakushima N et al: Endo -scopic submucosal dissection of esophageal squamous cell neoplasms. Clin Gastroenterol Hepa -to14:688-694，2006 3) Fujishiro M， Kodashima S， Goto 0 et al: Endo -scopic submucosal dissection for esophageal squamous cell neoplasms. Dig Endosc 21: 109-115， 2009 4) Sato H， Inoue H， Ikeda H et al: Clinical experience of esophageal perforation occurring with endo -scopic submucosal dissection. Dis Esophagus 27: 617-622，2014 5) 日本食道学会:
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食道癌診断・治療ガイドライン 2007年 4月 版J，pp10-13，金原出版 (2007) 6) Okano T， Yamada N， Sakai H et al: A novel re -covery system for cultured cells using plasma -treated polystyrene dishes grafted with poly (N-1253-1259，2010
18)Ohki T， Yamato M， Ota M et al: Application of cell sheet technology for esophageal endoscopic submu・
cosal dissection. Techniques in Gastrointestinal En -doscopy13: 105-109，2011
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20)Yamaguchi N， Isomoto H， Nakayama T et al: Usefulness of oral prednisolone in the treatment of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection for superficial esophageal squamous cell carcinoma. Gastrointest Endosc 73: 1115-112 2，1 011 21) Hashimoto S， Kobayashi M， Takeuchi M et al:
The efficacy of endoscopic triamcinolone injection for the prevention of esophageal stricture after en -doscopic submucosal dissection. Gastrointest En -dosc74: 1389-1393， 2011 22)Nieponice A， McGrath K， Qureshi 1 et al: An ex -tracellular matrix sca妊oldfor esophageal stricture prevention after circumferential EMR.Gastrointest Endosc 69: 289-296， 2009 23)Sakurai T， Miyazaki S， Miyata G et al: Autolo司 gous buccal keratinocyte implantation for the pre -vention of stenosis after EMR of the esophagus. Gastrointest Endosc 66: 167-173，2007
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