多様性

A G E レ セ プタ ^ー の 分子多様性^{と そのメ カ ニ ズム}

金 沢 大 学 医学 部 医 学 科生化 学 第^二講座 ( 主任^: 山本 博 教授) M d^.J^oy^{n a}l A bedin

後期 糖 化 反応 生成 物 (^{adv a n c ed}gl_yc atio n e nd p^{r o}du cts,A G E) ^が特 異 受容 体 (^{r e c e}p to r払r A G E,R A G E) を 介し て血 管 細胞 を 障 害 する こ と が, 糖 尿 病 血 管 合 併 症^の発 症, 進 展^に重 要^な役 割^を果たすこ と が知ら れ てき た^. し か し, A G E リ ガ^ンド結 合 彼^の細 胞 内 情 報 伝 達 経路や血 管恒 常 性破 綻^{の メカニズムにつ いて はい}まだ不 明な 点が多^い. 本研 究^で筆 者^は, R A G E 後シ グ ナ リング解 明^への第^一 歩と し て^ヒト R A G E 蛋 白^の分 子性 状 を 調^べた結 果, 以 下^の新 知 見 を 得た^. ま ず, 種^{々 の ヒ}ト組 織 ^■ 細 胞か らの抽 出 物 を^{ウエスタンプロッ}ト 分 析 すると, 分 子 量^の異な る二 つのタイプ が存 在 する^こと が見 出 され た.

一 つは分 子 豊約 5 5 k Daで肺で発 現し て^いること か ら｢ 肺 型｣ と命名^{し た. も う一 つは}分 子 量 約^{4 6 k Daで}, 血管 内皮 細 胞, 周 皮 細 胞 な^{ど で}発 現^{さ れ る}分 子 種^であ^{ること か ら}｢血管型｣ ^と命名し た^. 逆 転 写 ^{‑ D N A} 増 幅 反 応に よ る クロ ^ー ニ ング と塩 基 配 列 決 定^の結 果,

肺と血 管 細 胞^{に は}同^{一 の}成 熟型^m R N A が存 在 する こ と が明ら か とな り, 両細 胞^で同^{一 の}構 造 を 有 す^{る プレ}R A G E 蛋白が制 訳 され る と推 定^{さ れ た･} 全 長^{R A G E cD N A} を 鋳 型 とし た試験 管 内転 写 ^･ 翻 訳 反応 生 成 物^は約5 1 k Daの位 置に泳動さ れ, 小 胞 体 膜の存 在下 で はプレR A G E は小 胞 体 内^への移 行に伴っ て高分 子 化し た. 肺 抽 出物 を^{グ リコ ペプ チ ダー ゼ F で}消 化 す^{る と}, 肺 型 R A G E 蛋 白^のサイズ は 5 1 k Daに減 少^{し た. 一} 方, 血管 型^{R A G E} 蛋 白は グ リコ ペプチ ダ^ー ゼ F に よって は全 く 影 響^{さ れ}なかっ た^.

し た が^っ て

, 肺 型は N^‑グ リ^コ シ^ル化さ れ ており, 血 管 型^{は こ の}修 飾 を 受 けて^いな^いと考 えら れ た. 領 域 特 異 的 な 抗 体 を 用^い た ウ^エスタンプロ ット分 析で 血管 塾R A G E 蛋 白^{は N} 末 端 側^{1 6 ア ミノ}酸 及^{び C} 末 端 側2 0 ア ミノ酸に対 応 する抗 体に よっ て は認 識 さ れ な か^っ た^. 血 管 型R A G E は, 肺^{型R A G E と}比 較^{し て}, より 低 濃 度^の界 面 活性 剤 存在下 で可 溶 化 さ れる こ と が示^された.

し た がっ て, 以 上^の結 果か ら, 血管 細 胞で発 現 する R A G E 蛋白^は肺^{R A G E} 蛋 白^{と は}構 造 上 異な^っ て おり, これ は糖 鎖 付 加や蛋 白 限 定 分 解^{に よ る}翻 訳 後 修 飾^の差に よ るも^の と推 定さ れ た^. 本 研 究で見 出 さ れた R A G E 蛋 白^の分 子多様 性は, A G E リ ガ^ンド

に対 する細 胞 応 答^の多様 性 を理 解 する た めの基 礎 とな るもの と考^{えら れ る.}

Key w o rds adv a n c ed gly^{c a}tio n e ndp^{r o}du cts(^{A G E})^{, r e C e}p t^{O r} fo r A G E (^{R A G E}), diab etic C O m plic atio n s,m Ole c ula rhete r oge n ei_{t y}

,V a S C ula r e ndoth elialc e11s_,lu ng

グ^{ル コ ー ス}な どの還元糖は蛋 白 質^の ア ミ ノ基と非 酵 素 的に反 応し, シフ塩 基, アマ ド リ転 移 化合 物 を 経^て, 不 可逆 的 な 脱 水,

縮 合, 架 橋に より 特 異 な 吸 光, 蛍 光を示 す 後 期 糖 化 反 応 生 成 物 (adv a n c ed glyc atio n e ndpr odu cts, A G E) ^を形 成 す^{る. こ の}現 象 は当 初 食 品 化 学^の領 域で見 出さ れ, 1 9 1 2年Mai11a rd^l) に よって 最 初に記 載さ れ た^こと か ら, メイ ラ^ー ド反 応と し て知ら れ てい

る. 近 年^に至 り, メイ ラ^ー ド 反応は 生体 内でも 加 齢^に伴^って起 り, 特に糖 尿 病 状 態で慢 性 的 な 高血糖状 態が続 くと, 循 環 血 液 や組 織 中^{で A G E の}形 成^と蓄 積^が加 速 的^に進 行 す^ること が明か に さ れ た^2). さ ら に, この高血糖に よ る A G E 蓄 積が網 膜 症, 腎 症 をは じ め とする糖尿 痛 合併 症 発症^の原 因^{の 一 つ}と な るも^のと 推 測 され てきて いる^. A G E の生 物 学 的 作 用^を仲 介 する特 異^レ セ プ タ ^ー や結 合 蛋 白^の存 在 も 知^{ら れ て}きた. 1 9 9 2年^{Ne e}p^{e r}ら

3) は! ウ シ肺か ら A G E 結 合 能 を 持^つ細 胞 膜 表 面 蛋 白^を分 離し,

A G E レセ プ タ ^ー (^{r e c e}p to rfo rA G E,R A G E) ^と名 付 け^{た. ア セ ナ}

ル化 低 密 度リ ボ蛋 白, 酸 化低 密 度^{リ ボ}蛋 白^{とい った}変性 蛋 白^の

スカベ ンジャ ^ー 受 容 体と し て知ら れ て^いるマクロ ファ ^ー ジ ク ラ

スA ^スカベ ン ジャ ^ー 受 容 体 も^{A G E の}取 り 込み能を有 する⁴⁾.

Ⅵa s s a r aの グ^{ル ー} プ は⁵⁾⁶⁾, ラッ ト肝 臓^{か ら A G E} 結 合 活性 を 示

す^ガレク テ^ンー3 複 合 体 を 分推^{し た. これ らの}う ち, 糖 尿 病 性^の 細^′ト血 管 細胞 変 化に は R A G E が重 要な役 割 を 果^{た し てい る}可 能 性^が示唆さ れ てきて^いる. Ya m agi sh i ら⁷⁾ は, A G E が ウ シ網膜 微 小血管 周皮 細 胞^の増 殖を遅 延さ せ る と ともに, 周 皮 細胞に対 し て急 性 毒 性 効 果 も発 揮 す^ること を示し た^. A G E は 血管 内 皮 細 胞にも 直接 作 用^し, 血管 新生を 促 す^{8) 一}方で, プロ ス タサ イ ク リ^ン産生の低下 と プ ラ^スミノ ^ー ゲンア ク チ^{ベ ー} タ^ー イ^{ン ヒ}ビ タ ^ー 1の産 生 克 進^{に よ る 血}栓 傾 向 も 招 く^9). A G E の内皮 ^･ 周 皮 細 胞 作 用は, R A G E m R N A に相補 的 な^{アンチ セン ス}オ^T) ^{ゴ ヌ}ク レオ チ ド でテ肖去さ れ る^こと か ら, R A G E との相互作 用を 介 する も^のと推 定さ れ る. Ts uj^{i ら1 0) は}, A G E が腎^メサンギウム細 胞 で細 胞 外 基 質^{の 一} 種であるⅠⅤ塑^コ ラ ^ー ゲン の産生 を克進^{さ せ},

これ が R A G E m R N A に対 する リ ボ ザ イ^ムで防 止さ れ た^こと か ら, 糖 尿 病 性 腎 症^の初 期 病変^である メ サンギ ウ^ム領 域^の拡 大に A G E^‑R A G E 系が関与し て^いる可能 性 を 提 唱し た.

平 成^{1 1} 年¹¹月^{2 4} 日受 付, 平 成12 年1 月12 日受^理

A b br e viatio n s : A G E, adv a n c ed _gl_yc atio n e nd p^{r o}du cts; E N^‑R A G E, e Xtr a C ellula r n e wly ide nti丘ed R A G E^‑binding p^{r o}tein;F B S, 鎚tal bovi n e s e ru m;R A C E,r apid ^{a m}pliBc atio n ofcD N A e nds;R A G E, r e C eP t^{O r} forA G E

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こ の ように, A G E^‑R A G E系は糖 尿 病性 血 管 症 特^に細 小^血管 症

の発 症^に関係^{し ている}も^のと推 察さ れ る が, 糖 尿 病で細 小血管 が障 害さ れ る メ カ^ニズム の全 容 を 明^{か に}する に は, R A G E 後^の 細 胞 内シ グ ナ リ^ング経 路 を 個^{々 の}細 胞 種で究 明 する必 要があ る^. し か し な が ら, R A G E 蛋 白^の莫 体^や存 在様式^{につ いて は}な お不 明な点が多く, また A G E リ ガ^ンド受容 後 細 胞 内で R A G E と相互作 用 す^{る セ カンド メッセンジャー} 分 子 も 未 だ特 定されて いな^い.

そ^こで筆者^は, R A G E 後 細 胞 内 情報伝 達 経 路 解 明^への第 ^一歩 と し て, ヒト組 織 ^･ 細 胞で発 現し て^いる R A G E蛋 白^の実体を 明 らかにする こ とを 目 的に本 研 究 を 行っ た^. この結 果, ヒト R A G E 蛋白に は分 子多様 性が存在し, 血 管 細 胞^で発 現 し^ている R A G E 蛋白は_, 従 来肺^での観察か ら推 定 され て^いた性 状と は異 な る分子 性 状 を も^{つ こと が}発 見^{さ れ た.} 本 研 究^{で は}さら に, こ の分 子多様性が どの よう な^メカ^ニズムで生 ずる か に^{つ い}ても 追 求し た^.

材 料お よび方 法

Ⅰ^. 組織, 細 胞 1 . 組 織

ヒト組 織は, 金 沢 大 学 医 学部 附属 病 院^で外 科 的^に切 除^{さ れ た} 痛標本^{中の健 常 部 を 用いた.} 肺組織^は第^一 外 科 ( 渡連洋 字 教 授),

肝 ^･ 膵 組 織は第^二外 科 (^三輪晃^一 教 授), 腎組織^は泌 尿 器 科 (並 木 幹 夫 教 授), 脳 組 織は脳神経 外科( 山下純 宏 教 授) より 分 与さ れ た^. 各^{組 織は氷 上で細 切}後^{‑ 8 0℃で}保 存^{し た.}

2 . 細 胞

ヒト皮 膚 由来 微 小 血 管 内皮 細 胞 (^{Ca s c ade},Po rtland,U S A) ^は,

ク ラ ボ ウ ^{･ バ}イ オ メ ディカル部 (大 阪) ^{の マニ ュ}ア^ルに従^い,

5 % ウ シ胎 児 血 清 倹^{tal bovin es e ru m} ,F B S), 5ng/ml塩 基 性 線 推 芽 細 胞 増 殖 因 子, 1 0_{/ 絹}/ml^{ヘ パ}リ^ン, 1 0ng/ ml上 皮 成 長 国 子,

1 _〃g/^mlハイド^ロ コ ^ー チ ゾ^ンと 3 9.3 _〃g/皿1 ジ ブ チ リ^ルcA M P を 含む Hu^‑M ediaE B 2培 地 中^で維 持し た^{. ヒ}ト脳 微 小^血管 周 皮 細 胞は^ヒ ト正 常 脳 皮 質か ら培 養 化 され たも^の で, 製 造 会 社 ( 如plied Cell B iolog y Re s e a r ch In stitu r e,Kirkla nd,U S A) ^の推 奨 ど おりC S^‑C完 全培地 中で維 持し た^. ヒ ト胎 児 肺 由 来^の線推芽 細 胞 株M R C^‑5細 胞^{11) は}理 化 学 研 究所 細 胞 銀行 (^つく ば 市) ^{か ら} 購入 し, 1 0 % F B S (J^{R H B io s cie n c e s,Le n e x a, U S A}) を含^む

m c 8 0^‑7培 地 中^で維 持^{し た. ヒト}単球 細 胞^は健^{常ボ ランティア}

か ら採 取し た全血か ら Co n r ad¹²⁾ の方 法に より 培養^{化し た.}

Ⅰ. 試 薬

ウ サギ網 状 赤 血 球 溶 解 液 転 写^･ 翻訳 共役キットは Pr o m ega社

(^{M adis o n},U S A) ^{か ら}購^{入 し た.} 組 換 え^ヒト R A G E蛋 白^の細 胞

外ドメイ^ンに対 する ウ サ ギ ポ リ ク^{ロ ー} ナ^ル抗 体^は, 三井 製 薬^工 業 株 式 会 社 生 物 科 学 研 究 所 ( 茂 原 市) ^より 恵 与 され た^{. ヒ}ト R A G E 蛋 白^の細胞 内 ド^メイ^ンに対 する ウ サ ギ ポ リ ク^{ロ ー} ナル抗 体は, サ ワ デ ^{ー ･} テ ク^{ノ ロ}ジ ^ー ( 束 京) に委託 し て, ヒ ト R A G E cD N A 配 列^{3 )} か ら推定 され た 1 6 ア ミノ 酸^の配 列 (^{D R R}QR R G E E R E A P E NQ) を化 学 合 成 し, これ を抗 原と し て ウ

サ ギを 免 疫後, 得^{ら れ た}抗 血 清 を^{さ ら に アブ イ}. ^{ニテ ィ}

ー 精 製

し て 得 た ^. ヒ ト R A G E 蛋 白の N 末 端1 6 ア ミ ノ 酸 (^AQ ^{N I m} R I G E P L V L K C) と C末 端 ^{2 0 ア ミ ノ} 酸 CE R A E I^JNQS E E P E A G E S S T G G) に対 する ヤギポ リ ク^{ロ ー} ナ^ル抗 体(^{N‑1 6 と C‑2 0}) ^は, Sa nta Cr u z B iote chn olog y(^{Sa nta Cr u z},

U S朗 より 購 入し た^. グリ^{コ ペ}プチ ダ ^ー ゼ F は_, 宝 酒 造 (京 都)

より購 入^{し た.}

Ⅱ^. 組 織^･ 細 胞 抽 出物^の調 製

凍 結^ヒト組 織は_, 液 体 窒 素 中で粉 末 化後, he m mli緩 衝 液^{1 3)} (^{6 2.5m M ト リス}塩 酸 緩 衝 液b ^{H 6.8), 2 % S D S, 1 0 % グ リ セロ ー}

ル_, 0^.0 0 2 % ブロ モ フ ェノ ^ー ルブル ^ー _, 5 % 2^‑メ ルカ プト^エ タ^{ノ ー} ル) 中^で室 温^{に て 3 0 ‑ 4 0}秒 超 音 波 破 砕^{し た}後, 1 0 0 ℃ で 5分 間 加 熱し た^. 培 養 細 胞は, 7 5c m2 フラ^スコ 中で 8 0 ‑ ^{9 0 % コ ン プ ル}

エ ンシ ^ー に達^{し た}時 点^で冷^{P B S で 1} 回 洗 浄 後, 5ml^の冷P B S 中 でス ク レ ^ー パ ^ー を 用 ^い てフ ラ^{ス コ} 面か ら は が し, 4 ℃,

1 0 0 0rpm の遠 心で沈 殿^{さ せ た.} 沈 殿 物 をI.a e m mli綾 衝 液に懸 濁 後, 上 記^と同様^に超 音 波 破 砕 ^･ 加 熱 処 理し て細 胞 抽 出 物^{と し}

た.

Ⅳ^. 蛋 白質^の定 量

蛋 白 濃 度は ウ シ 血清アルブ ミンを標 準として Br ad fo rd法^{1 4)} で測 定し た^.

Ⅴ^. ウ^エス タ ンプロ ット分 析

蛋 白 質 を^{S D S‑P A G E で}分 離^{し た}後, P V D F膜 (^{Im m ob ilo n P},

M illi_po r e,Bed fo rd,U S A) 上に セ ミ ド ラ イ方 式で電 気 的に転 写し た. 転 写 後, m F膜 上^の蛋 白 非 付 着 部位 を^{5 %}脱 脂ミ^ルク, 1 % ウ シ血 清^{アルブ ミン}を 含^{む 0.1 % Twe e n‑2 0}加P B S で ブ^ロッ キ^ン グ し た後, ヒトR A G E 蛋 白 細 胞 外ド メ イ^ンあるいは R A G E 蛋 白

の特 定 領 域に対 する抗 体 を ^一 次 抗 体 とし て, m F 膜^と反 応^さ せ西 洋^{ワ サ ビペ ルオ キ シ ダ ー ゼ}結 合抗ウ サギイ ムノグ^ロブ リン

また は抗ヤ ギ イ ム ノ ダ^ロブ リ^ンを二次抗 体^{と し て}, E C L検 出^シ

ステ ム 仏^{m e r sha m P ha r m a cia B iote ch, Bu ckin}gh ^{am Shir e},U K) を用^いて可視 化さ せ た^.

Ⅶ. R A G E cD N A の分 離と構 造 決 定

ヒト微 小 血 管 内 皮 細 胞^{か ら}Q ^uick pr ep m R N A精 製キ ッ ト 伽^{1 e r Sha m P ha r m a cia B iote ch}) を用^いてポリ AT R N A を 分 離 し , こ れ を 鋳 型 ^{と し て M a r atho n cD N A} 増 幅 キ ッ ト (C L O N T E C H Lab o r ato rie s, Palo A lto, U S A) を 用^{い て}

cD N A を調 製^{し た.} 得ら れ たcD N A を 鋳 型と し, 5^'プ ラ イ

マ ^ー と し て は既 報^の R A G E 遺 伝 子^{1 5) の ヌク レオ チ ド}番 号 6 6 4 1 ^‑ 6 6 6 2 に対 応し, 5^,端に g わαⅠ ア ダ プ タ ^ー を 有 す^{る 5'一} G A T t m G 包丁G G G m 3^,, 3^'プ ライ^{マ ー} と し て は^ヌク^レオ チ ド番 号97 5 2 ^‑ 9 77 4 に対 応し, 5^'端に 励β戯 ア ダ プタ^ー を も^つ5,‑G A G A A T r C G C C A G G A C C C T G G A A G G A A G C A^d 3^,を用^い, P y^{r o}be st D N A ポ リメラ^ー ゼ( 宝 酒 造) に より微 少血 管 内 皮 細 胞^{R A G E cD N A を}増 幅^{し た.} 増 幅 産 物 をX baI と Ec oR I で消 化 後, p^CD N A 3 ^ベク タ ^ー (In vitr oge n,Ca rlsbed, U S A) に連 結^し大 腸 菌J^{M l O 9 に}移 入 し た. 形 質 転 換 J^{M l O 9} 細 胞か ら F le xi p^{r e}p プラ^ス ミ ド分 離^{キ ッ ト} (A m e r sha m P ha r m a cia

B iote ch) を 用^いて組 換 えプ ラ^スミ ド D N A を 分 離 精 製し た^. さ ら に 5^,端お よ び 3^,端 領 域^の配 列を知^{る た め}, ヒト微 小 血 管 内 皮 細 胞^{ポ リ A+ R N A} とM ar ath o n cD N A 増 幅キッ ト に より 調 製し た 微 少 血 管 内 皮 細 胞 由来^cD N A お よ び Ⅲ^{e n}Taq D N A ポ¹) メ ラ^ー ゼ (C I D N T E C H h bo r at_orie s) を 用^{いた 5'‑お よ び 3しr}叩id am ph fic ado n ofcD N A e nds O^{i A C E}) 反応 を 行^{った. 5,一郎 虹 E に は, 一}次プ ラ イ

マ ^ー と し て 5^,‑C T G C A C C G G A A A A T C C C C T C A T C^‑3^'(R A G E

cD N A 3) ^{の ヌ} ク レ オ チ ド番号^{2 7 7}‑ ^{2 9 9 に}対 応), ネ^ステッ ド プ ライマ ^ー と し て 5^,‑G T G T T C A G T T T C C A T T C C A G C C G C^‑3^' (^{R A G E cD N A 3}) ^{の ヌクレオ チ ド}番 号^{1 4 1 ‑ 1 6 4 に}対 応) を 用^い

た^. 3^,‑R A C E に は, 5^,A G T C T G T G G G G G G C A G T A m G^‑3^'と 5^'‑ G C T C A A A A C A T C A C A G C C′C G G A T T G^‑3^'(^{そ れ}ぞれ R A G E A bedin