博 士 （ 歯 学 ） 長 谷 由 理
学 位 論 文 題 名
Mechanism for propofol inhibition of Na+, K+‑ATPase activity in rat brain
(Propofol によるラット脳Na+ ，K+‑ATPase 活性阻害機構）
学位論文内容の要旨
【緒言】
Propofolは 短 時 間 作 用 型 の 静 脈 麻 酔 薬 と し て 全 身 麻 酔 の 導 入 維 持 ， 集 中 治 療 室 で の 鎮 静 及 び 歯 科 治 療 に お け る 静 脈 内 鎮 静 法 な ど ， 臨 床 で 広 く 用 い ら れ て い る が ， 麻 酔 作 用 に 関 し て は 未だ 不 明 な 点 が 多 い ．Na゛ ， ぽ ーATPaseは 生 体 内 に 普 遍 的 に 存 在 し ， 神 経 細 胞 の 興 奮 性 の 維 持 な ど基 本的 な 細胞 の機 能 に関 与す る ．そ こで 我 々は ，propofollこよ るNa゛ ，K゛ ―ATPase活 性の 阻害 が 脳の 機 能 変 化 に 関 係 し ， 麻 酔 状 態 や 副 作 用 に 関 連 す る 可 能 性 が あ る と 仮 説 を 立 て た ．Propofolに よ るNa゛ ，K゛ ーATPase活 性 阻 害 の 報 告 は1報 あ る が ， そ の 機 構 に つ い て は 研 究 さ れ て い な い た め，
Na゛ ，K＋ ―ATPaseの 反 応 機 構 に 基 づ ぃ たpropofolに よ る 活 性 阻 害 機 構 の解 明を 目 的と して 本 研究 を行った．
【材料と方法】
Jorgensenら の 方 法 に 従 っ て ラ ッ ト 全 脳 か ら 抽 出 し た ミ ク ロ ソ ― ム を 精 製 し て 得 た Na゛ ，K＾ ―ATPaseを 材 料と した ．Propofol（2，6―Diisopropylphenol)は水に不溶な ため，吸光度測定 分 析 が 可 能 と な る よ う に0.2%の 濃 度 でdimethyl sulfoxide (DMSO)に 溶 解後 水で 希 釈し 実験 に 用い た ．ATP加 水 分 解 の 結 果 生 成 さ れ た 無 機 リ ン 量 をChifflet法 に 従 っ て 定 量 し た ． 反 応 液 に 各 種 濃 度 のpropofolを 加 え た と き の 影 響 か ら ，Na゛ ， ぽ −ATPase活 性阻 害のpropofol濃 度 依存 性を 調 べた また ，Na゛ ，K＾ −ATPase活 性のNa゛， で，Mg2゛ お よびATP濃 度依 存 性に 対す るpropofolと溶媒として 用 い たDMSOの 影 響 を 調 べ た ． さ ら に ， 部 分 反 応 で あ るNa十‑ATPase活 性 のNa゛ 濃 度 依 存 性 お よ びK゛‑pNPPase活 性 の で 濃 度 依 存 性 に 対 す るprop。f。1の 作 用 を 調 べ た ，加 えて ，propofolに よる Na＋ ，K゛ ―ATPase活 性 阻害 の可 逆 性を 検討 す るた め，pr。pof。｜ の希 釈 によ る活 性 回復 実験 を 行っ た．
【結果】
Na゛ ，K゛ 一ATPase活 性 お よびNa＋ ―ATPase活 性 はpropof0｜の 濃 度に 依存 し て低 下し ，1．03mMで ほぼ完全に抑制 された，50％活性 阻害濃度（IC5。）は約0．26mMであっ た．
Propof01非存 在 下のNa゛ ，K十 一IATPase活 性はNa＋，K゛，Mf゛ 及 びATPの濃 度に 依 存し て増 加 し，
HilIpI。tの結果，Na゛，K＾，およびMf゛に対する50％活性化濃度（［S］。．5）はそれぞれ12、6．1．5およ び0．43mMで あ っ た ．PropofoIは ， 濃 度 依 存 的 にNa＾ ，K゛ ，Mf゛ お よ びATP濃度 を 変化 させ た 際の
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最大活性(Vmax)を減少させた．ー方，［S］。．5に対する影響は―様ではなく，0.35 mMのpropofol 存在下でのNa゛に対する［S］0．5を約2倍に増加させ，K゛に対しては3分の2に減少させ，Mg2'に対 しては顕著な影響を与えなかった，
ATP濃 度依 存性 の結果 をLineweaverBurkの 二重逆 数プロ ットに より解 析する と，propofolや DMSOの 有 無 に 関 わ ら ず 直 線 は 折れ 曲 が り ，そ れ ぞ れ のx切片 とy切 片 の 値 からATPに 対 する 高 ・ 低 二 つのKmとVmaxが計 算 さ れ た，Propofolは 濃 度 依 存的 にVmaxを 減 少 させ る 一 方，両 親和性部位のKmを減少させたことからATPに対する親和性は増加した，
部 分反応 のNa＋−ATPase活性およぴK゛‑pNPPase活性はNa゛，ぽーATPase活性と同様にpropofol に よ り 阻 害さ れ，Na十‑ATPase活性 およぴK+‑pNPPase活性 ともにVmaxが減少 し，親 和性の 変化 が認められた，
完 全に活 性が抑制される1．03mMpropofb｜で処理したのちにpropofo｜濃度を希釈したところ，
最終pr。p。fb｜濃度に依存して活性は回復し，20倍希釈で60％の回復が認められた．この過程は温 度の影響を受けなかった．
【考察】
Propofolは濃度依存的にNa゛，ぽ−ATPase活性を阻害し，完全な阻害濃度は1．03mMであった．
Propofolによる イヌ腎 髄質のNa゛，K゛IATPase活性阻害濃度を73−800ロMとする報告があるが，
作 用機序 につい ては検 討され ていなかったため，Na＋，KLATPaseの反応機構に基づき解析を行っ た．
PostlAIbersの反応機構では，Na＋，K＋―ATPaseはNa゛およびMf＾存在下でATPを加水分解し，
ATPの ァ 位 のり ン 酸 を 結合 し た り ン酸 化 酵 素EPを 形 成 する ，ADPと反 応してATPを合成 しうる E1PがNaを細 胞 外 に 遊離 す る と ぽに 感 受 性 の高 いE2Pと なる ．K゛ の 非 存在 下 でE2Pの 自然加 水 分解に より無 機リン を遊離 するのが ，部分 反応のNaLATPase活性 である ．K゛の存在下では，
ぽ がE2Pに 結 合 し て 脱 リ ン 酸 化 す る とKE2と な り ，pNPPを 加 水 分 解 す る 部 分 反 応 で あ る K゛一 州PPase活 性 を 示 す．Pos卜Albersの反 応 機 構 から ，Na＋，で，Mヂおよ ぴATPに よって Na．，K＋一ATPase活性は調節されている．PropofbIがどの段階でNa゛，K゛ーATPase活性を阻害する の かを調 べるた め，Na゛ ，K＋ーATPase活性 のNa゛，K゛，Mf゛およびATPの濃度依存性に対する propofo｜の作用について調べた．Propof。l｜ま濃度依存的にNa゛，K゛，MヂおよびATP全てに対す る 活性のVmaxを低下 させた ことか ら，反応の特定の過程ではなく，全体に影響を与えることが示 唆 された ，また ，prop。folはATPの高低両親和性部位およびぽに対する親和性を増加させ，Na゛ に 対して は低下 させ，Mf゛に対 しては変化を与えなかった，Vmaxを低下させる一方でりガンドに 対 する親 和性に 影響を 与える ことから ，その 様式は 拮抗型 や非拮 抗型で はなく 混合型の酵素阻
酔に 必 要と され るpropofol濃度 に関しては議論 があるが，麻酔維持中の血 漿を採取してHPLC法 によりpropofol濃 度を測定すると，皮膚切開 ，腹膜切開，腹壁牽引に必要 な血漿propofol濃度は それ ぞ れ72，96，109ロMで ある と報告されてい る，同じ濃度域でNa＋，K'‑ATPase活性の約30%
が阻害されることから，この阻害が麻酔作用に関係する可能性があると考えられた． 100liM相当 の濃 度 のpropofolが10―20%の過 分極作動性Hチ ヤネルを抑制するという報 告も．我々の見解を 支持する．
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Mechanism for propofol inhibition of Na+, K+‑ATPase activity in rat brain
(Propofol0 こよるラット脳Na+ ，K+ 一ATPase 活性阻害機構）
審査は，審査担当者全員の出席の下に行われた．主査，副査の前で申請者が提出論文の 内容をスライド形式で発表し，っいでその内容および関連分野にっいて主査，副査が口頭 により諮問を行った．審査論文の概 要は以下の通りである，
Propofolは短時間作用型の静脈 麻酔薬として臨床で広く用いられているが，麻酔作用に 関しては未だ不明な点が多い．Na+，K+‑ATPaseは生体内に普遍的に存在し，神経細胞の興 奮性の維持など基本的な細胞の機 能に関与する，そこで，propofolによるNa+，K+‑ATPase 活性の阻害が脳の機能変化に関係 し，麻酔状態や副作用に関連する可能性があると仮説を 立てた．PropofolによるNa+，K+‑ATPase活性阻害の報告は1報 あるが，その機構にっいて は研究されていないため，Na+，K+‑ATPaseの反応機構に基づいたpropofolによる活性阻害 機構の解明を目的として本研究を行った，
得られた結果と考察は以下の通りである・
ぐD Propofolは濃度依存的にNa+，K+‑ATPase活性を阻害し，完全な阻害濃度は1.03 mMで あった，
◎Propofolは 濃 度 依 存 的 にNa+，K+，Mg2+お よぴATP全 てに 対す る活 性のVmaxを低 下 させたことから，反応の特定の過程ではなく，全体に影響を与えることが示唆された．
昭
明
誠
和
邦
島
木
橋
福
鈴
舩
授
授
授
教
教
教
査
査
査
主
副
副
＠ 臨 床 的 に 麻 酔 に 必 要 と き れ るpropofol濃 度 に 関 し て は 議 論 が あ る が ，65 uMで Na+，K+‑ATPase活性の約30％が阻害される．ことから，この阻害が麻酔作用に関係する 可能性があると考えられた，
Na+，K+.ATPaseは生 体内 で基 本的 な細 胞の機能に関与し ，神経細胞においてはATPの 約 70％が消費されている ，Na+，K+‑ATPaseは細胞内外のイオン濃度勾配を形成するため，ATP 加水分解エネルギーを 用いて3分子のNa+を細胞外にくみ出し，2分子のK+を細胞内に取り 入れる．心筋において 強心配糖体ジギタリスが，Na，Kt．ATPa8e活性の抑制の結果として Nが．Ca2＋交換体によるCa2＋排出遅延から心筋収縮カを増大させ，強心作用を呈するのは既 知の事実であるが，同様に脳においても，Nが，K＋．ATPaseがpropofolにより阻害されると，
細胞内Na＋が増加し，Na十℃a2＋交換系が働くことでCa2＋が細胞内情報伝達系の変化に関与す ると考えられる，Na十，Ip．ATPaseはNがとK＋の能動輸送を担っているだけでなく，それに より維持されるNが濃度勾配を駆動カとする活動電 流の発生やイオン交換系を介してCa2＋ やH＋の細胞内濃度の調節などにも重要な働きを果たしている．申請者は研究の立案と実行 に基づいた明晰なデータとともに，propofolによるNa＋，K＋．ATPase活性阻害機構を明らかに した．研究遂行および 結果評価について十分な能カがあることが認められた．また，本研 究はこの分野での新し い知見を提供しており，生体に作用する薬物の作用機構を理解する うえでも極めて有用だと考えられた．
口頭試問では，本論 文の内容とそれに関連した学問分野にっいて質疑応答がなされた．
主な質問内容は，
1．麻酔作用に関連して，Na十，K＋．ATPa8eの阻害を調べた理由 2．麻酔の定義に関して
3．Na十，I【＋‐觚IPaseと全身麻酔薬，局所麻酔薬との関連性 4，酵素阻害様式に関する知識
5．Na＋，K十．A．TPa8eと反応機構
6．Propof01の臨床濃度と本実験の濃度の比較 7．今後の研究の展開と将来の展望
こ れ ら の 質 問 に 対 し て ， 積 極 的 な 議 論 が 行 わ れ ， 申 請 者 は 適 切 に 回 答 し た ． 審査担当者との質疑 応答をとおして，申請者が本研究ならびに関連分野に対する理解が 十分になされており， 幅広い知識を有していることが明らかになり，本研究のさらなる発 展，今後の研究が期待 された．審査担当者全員が，本研究が学位論文に十分に値し，申請 者 は 博 士 （ 歯 学 ） の 学 位 を 授 与 す る 十分 な学 識・ 資 質を 有し てい るも のと 認め た．
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