MEGA 5 を用いた塩基配列解析法および分子系統樹作成法 Ver.1
Update: 2012.04.01 ウイルス・疫学研究領域 井関 博 ＜内容＞ 1. MEGA 5 をインストールする 1.1 ダウンロード手順 2. 塩基配列を決定する 2.1 Alignment Explorer の起動 2.2 シークエンスデータの入力 2.2.1 テキストファイルから読み込む場合 2.2.2 波形データから読み込む場合2.3 Forward 配列と Reverse 配列のアライメントと Consensus 配列の作成 3. 分子系統樹を作成する
1. MEGA 5 をインストールする 1.1 ダウンロード手順
MEGA のホームページ（http://www.megasoftware.net/index.php）から MEGA 5 software をコンピュータにインストールする。 2. 塩基配列を決定する 2.1 Alignment Explorer の起動 ① MEGA 5 のアイコンをダブルクリック。 ② “Align”タブから”Edit/Build Alignment”を選択する。（図 1） 図1 メインウィンドウのタブ上で左クリックすると選択項目が出る。
③ “M5: Alignment Editor”のウィンドウが開くので、”Create a new alignment”を選 択して”OK”をクリック（図 2）。
図 2 以前に作業途中で保存したファイルから始めるときには”Open
④ “Data type for alignment”のウィンドウが開き、”Are you building a DNA or Protein sequence alignment?”と聞いてくるので、”DNA”を選択する。
⑤ “M5: Alignment Explorer”の作業ウィンドウが開く（図 3）。
図3 これ以降の塩基配列の修正作業は”Alignment Explorer”上で行う。 2.2 シークエンスデータの入力
2.2.1 テキストファイルから読み込む場合
＜Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列を入力する＞
① M5: Alignment Explorer の”Edit”タブから”Insert Sequence From File”を選択 する。
② 解析するシークエンスファイル（テキストファイル）を選択する。
＊自分でテキストファイルを作成する場合はFASTA 形式にする（図 4）。
図 4 “＞”の後に配列の名前を入れ、改行して塩基配列を
③ “M5: Alignment Explorer”にシークエンスデータが入力される（図 5）。 図 5 配列が青く反転している場合は、いずれかの塩基の上で左クリック すれば解除される。 ④ 波形データを見ながら配列を編集する。（「2.2.2 波形データから読み込む場合」 を参照） ＜Reverse PCR primer を用いてシークエンスした配列を入力する＞
① “M5: Alignment Explorer”の”Edit”タブから”Insert Sequence From File”を選 択し、Reverse PCR primer を用いてシークエンスした配列の入力されたファイ ルを選択する。
② Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列と同様に、波形データを 見ながら配列を編集する。
③ 配列名の部分をクリックして配列情報が青く反転した状態で、”Data”タブか ら”Reverse Complement”を選択する（図 6）。これにより、Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列と同じ向きになる（5’→3’）。
図6 配列が青く反転している状態でないと、”Reverse Complement” できないので注意。
2.2.2 波形データから読み込む場合
＜Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列を入力する＞
① “Sequencer”タブから”Edit Sequencer File”を選択する（あるいは波形のアイコ ンをクリックする）（図7）。 図7 緑の枠で囲ったアイコンを左クリックする。 ② Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列の波形データファイルを 選択する。 ③ “Trace Editor”のウィンドウが開き、波形データが見られるようになる。 ④ 波形を見ながら配列を修正する。開始部と末端部付近は波形が乱れて正確に配 列が認識されないため、”Edit”タブから”Mask Upstream”あるいは”Mask Down Stream”を選択することで、カーソルの位置より前あるいは後ろの配列を 認識させなくすることができる（図8）。 図8 ここでは”C”を左クリックで青く反転させた後、緑の枠で囲った左側の アイコン（Mask Upstream）を選択した。
⑤ 修正が終わったら、”Data”タブから”Add to Alignment Explorer”を選択する。 すると、修正を行った配列のうちでマスクをしなかった部分のみが”Alignment Explorer”のウィンドウに読み込まれる。
⑥ Reverse 配列も同様に修正し、”Reverse Complement”を行ってから”Alignment Explorer”のウィンドウに読み込ませる。
2.3 Forward 配列と Reverse 配列のアライメントをとる
“2.2”で”Alignment Explorer”に読み込ませた Forward 配列と Reverse 配列を比 較・修正し、1 本の Consensus 配列を作る。 ① “Alingment”タブから”Align By ClustalW”を選択する。または”W”のタブをクリ ックして”Align DNA”を選択する（図 9）。ダイアログボックスの数値は変えず に”OK”を選択する。 図9 緑の枠で囲った“W”のアイコンをクリックする。 ② Forward 配列と Reverse 配列の相同部分が重なるので、不一致な部分を確認す る。
③ “Edit”タブから”Insert Blank Sequence”を選択する。
④ 新しく挿入された配列の名前部分をダブルクリックし、名前を変更する（検体名 など）。 ⑤ Forward と Reverse の配列で一致した部分をコピーし、新しく挿入された配列 にペーストする。 ⑥ この検体の Consensus 配列が完成。 2.4 Consensus 配列から PRRS ウイルスの ORF5 を切り出す ① 動衛研 HP から「日本の PRRSV」ファイルを自分のコンピュータにダウンロー ドする。
② Alignment Explorer から Consensus 配列以外の配列を削除する（配列の上で右 クリックして”Delete”を選択）。
③ “Edit”から”Insert Sequence From File”を選択し、「日本のPRRSV」ファイルを 選択する。 ④ ”W”のタブをクリックして”Align DNA”を選択する。ダイアログボックスの数値 は変えずに”OK”を選択する。 ⑤ PRRS ウイルスの ORF5 は 600 塩基あるいは 603 塩基であるため、Consensus 配列を他の配列と比較し、配列の後ろ側は「・・・TAG」、配列の前側は「ATG・・・」 となるように不要な配列を削除する。（他の株のORF5 と全然配列が一致しない 場合は、マニュアル最後の＜得られた塩基配列の核酸相同性解析＞を試してみま しょう）。 ⑥ 600 あるいは 603 塩基となったことを確認して、配列をコピーする。 ⑦ 「日本の PRRSV」ファイルを開き、最後尾にペーストする。前の配列に倣って、 検体名を入力する（図10）。 図10 ここではサンプルの名前を「Sample A 」 とした。 ⑧ 「日本の PRRSV」ファイルを別名で保存してから閉じる。
⑨ “Alignment Explorer”上で、再度”W”のタブをクリックして”Align DNA”を選択 する。ダイアログボックスの数値は変えずに”OK”を選択する。
⑩ “Data”タブから”Save Session”を選択し、任意の場所に保存する。
3. 分子系統樹を作成する
① MEGA のメインウィンドウの”Phylogeny”タブから、”Construct/Test Neighbor Joining Tree…”を選択する。
② “Choose a Data File to Analyze”のウィンドウが開くので、ファイルの種類を”All files”にする。
④ “M5: Analysis Preferences”のウィンドウが開くので、”Test of Phylogeny”の項目 を左クリックして”Bootstrap method”を選択する。 ⑤ “Compute”をクリックすると計算が開始する。 ⑥ 作成された系統樹は見やすいようにカスタマイズする（下記、＜主なアイコンの 機能＞を参照）。 ⑦ “Image”タブから”Copy to Clipboard”を選択し、パワーポイントに貼りつける。 ⑧ パワーポイントスライドの系統樹の上で右クリックし、グループの解除をすれば、 フォントが変更できるようになる。 ＜主なアイコンの機能＞ →枝の指定 →枝の上下入れ替え →選択した分枝を中心に系統樹を作成 →枝の反転 →選択した枝をまとめて表示または非表示 →系統樹の形を選択 ＜得られた塩基配列の核酸相同性解析＞ ① “Alignment Explorer”上の調べたい配列の名前の上で右クリックし、”BLAST sequence”を選択。 ② 選択した配列が入力された BLAST の新しいウィンドウが開くので、下記の項目 を修正する（図11）。
Choose Search Set
Database: Others (nr etc), Nucleotide collection (nr/nt) Program Selection
Optimize for: Somewhat similar sequences (blastn)
General Parameters
Max target sequence: 探し出す 候補の数を入力
③ “BLAST”のアイコンをクリックする。
④ 相同性の高いものから順番に候補が表示される。
