いわ ゆ るタイ出血熱 の病 原体 チ ク ングニ ア ウイル ス
の増殖 に関す る電子 顕微鏡 学 的研究
東 昇
Studieson theEtiologicalAgentoftheSo-called ThaiFaemorrhagic Fever,ParticularlyAssociatedwith theElectron Microscopyofthe
Multiplication oftileCIlikungnyaViru sinCellCultures by
NoboruHIGASHI
ウイル ス性 のいわ ゆ る タイ出血熱 患者 の87%は デ ング熱 ウイル スに よ り, 残 り13%は チ クソ 1) グニア ウイル スを原 因 とす る (S.B.Halsteadら,1962)｡ チ ク ソグニア ウイル スに よる疾 病 が チ クソグニア病 と して独立 疾病 の名を与 え られ た のは,Tanganyikaにおい て 最初 に認 め ら れ て (1952-1953)以来 の ことで, 比較 的新 しい人 の ウイル ス病 で あ る｡ チ クソグエア とい う 名称 は臨床 症 状か らきた もので 激烈 な関 節痛 のた め に患者 が "doubled-upりの姿 勢 を とると こ ろに 由来 してい る｡ 2) 本病 の病 原 ウイル スが分離 され た のは1956年 の ことで,Rossに よ り急性 患者 の 血 液 お よび 野生 の蚊か ら分離 された｡1958年 に Spenceらに よ りA群 アル ボ ウイル スに 属す る ことが 明 ら 3〕 か に され た｡ タイ国に おいてほ1962年 にか な りの流行 が あ り,毎年 散 発性 の流 行 を, 特 に小 児 に流 行 して い る｡ そ の病 原 ウイル スの性状 につ いては全 く知 られ ていない｡ 著者 は1965年8月, タイ国立 4)
ウイル ス研究所 の TuchindaPrakov博 士,伊 藤利根 太 郎博 士 らの協 力を得 て, チ クソグエア ウイル スの培 養細胞 内増 殖様式 を電 子顕微 鏡 学 的 に研究 して, ウイル スの大 きさ, 形,構 造, 増 殖 の場所 ,増 殖 の メカ ニズ ム等 を 明 らか に し得 た ので ここに報 告す る｡ 材 料 と 方 法 供 試 した ウイル スは BaH306株 で, 乳呑み マ ウスの脳 を7代 , - ムス ター腎細胞 を3代 通過 した もので あ る｡ 培 養細胞 はサ ル (タイ国産 の Cynomolgus)の腎細胞 を 2代培 養 した もので 培 養2日の細胞 を ウイル ス感染 に供 した｡ 培 養液 は2
%
calfserum を含 む YLE, 感染 時 の 培 養温 度 は 37oCで あ った｡封 :タイ出血熱 の病 原体 チ ク ングニア ウ イル スの増殖 感 染
1
5
時 間 を経 過 す る と, 細胞 変 性(
CPE)
が 現 れ 始 め,2
0
時 間後 に は著 明 とな り,3
0
時 間 を経 る と細胞 は ガ ラス壁 よ り脱 落す る｡ 電 子顕 微鏡 用 の感 染 細胞 はCPE
鼻 著 な感 染 後2
0
時 間 を経 た もので, これ を オ ス ミック酸 国 定 後, メ タ ク リル樹 脂 に包 埋 した｡ メ タ ク リル樹 脂 は今 は必 ず しも良好 な包 埋 材 で は な いけれ ども, 現地 で この樹 脂 以 外 の包 埋 材 が得 られ なか った ので, 専 らメ タ ク リル樹 脂 を使 用 した｡ しか し, 細胞 は別 と して, ウイ ル ス粒 子 の構 造 ,増 殖 の メ カニ ズ ム等 は, 写 真 に示す よ うに, 極 め て良好 な成果 を得 る こ とが で きた｡ 包 埋 した 感 染 細胞 は Porter-Blum 型超 ミクロ トー ムで切 り,JEM 6C電 子顕 微 鏡 で観 察 し た｡ な お切 片 は鏡検 前 に鉛 -ウ ラニ ウムの二 重 染 色 を 施 した ｡ 実 験 成 績 増 殖様 式 , 粒 子 の形 , 大 きさ と構 造 , 不 完全 ウイル ス粒 子 , ウイル ス結 晶 の形 成 につ い て述 べ る｡ 1. チ ク ソグエア ウイ ル スの増 殖様 式 この ウイ ル スは細 胞 内 (細胞 質 お よび核 質) に =ほ とん ど全 ぐ 'とい って よい程 , 現 れ ない とい う特徴 を も ってい る こ とが 見 出 され た｡ 図1 サル腎細胞で増殖 したChikungnyavirus.細胞表層及び細胞外に ウイルス粒子集 団を認める｡集団の多 くは2次元結晶構造を示す｡ なお左端の膜面に不完全 ウイ ルス粒子を認める｡細胞質内には ウイルス粒子を認めないo メタク1)ル樹脂包埋. 図1に示 す よ うに, ウイル ス粒子 はす べ て細 胞 質膜 に接 して, あ るいは細胞 外 に遊 離 の状 態 で存 在 す る｡ 細胞 内に は全 くウイル ス粒 子 を認 め る ことが で きない｡ ウイル ス粒子 の この よ うな あ りか た は, チ ク ソダニア ウイル スの増 殖様 式 が いわ ゆ る "buddingofplasmamembrane で あ ろ うことを強 く示 唆 す るもので あ る｡ そ こで plasma membraneの隆 起 部 の 発見 に鏡 検
の主 力 を注 い だ｡
東 南 ア ジ ア 研 究 第4号毒 帝1Pj ス粒子 が全 然 出現 してい な い ことを 指 摘 し て お きた い｡本 国 の矢 印の部 に見 る よ うに, 細胞 質膜 が隆 起 し てい る｡ 注 目すべ きは,隆 起 した細胞質膜 の内部 は球 状に electron dense で あ ることであ る｡ ウイル ス 粒子 の coreを示す もの と 見 て よい｡ 換 言す れば,粒 子 は膜 面 で形 成 され る際, 粒子 のshell(あ るいはli m-itingmembrane)形成,所 定 の形,大 きさを とるだけ で な く, 同時 に coreの形 成 もお こなわ れ てい るこ と を物 語 る｡ 図3は細胞 質膜 部 よ り脱 落 した microviliにおけ る ウイ′レス粒子 の膜 面発育 を 示す｡
2
個 の粒子 の うち, 上 方 の粒子 は発育がか な り 進 んで い る｡ しか し, 粒子 の膜 は microviliの膜 と連 続 してい る｡ 下方 の粒子 は 図2の矢 印のそれ よ りは発 育が進行 してい るが, 同時 図2 ウイルス粒子の膜面発育 Hbuddingof plasmamembraneMを認める (矢印)0 図3 microvili膜面 (矢印)での ウイルス 粒子の発育を示す｡上方の粒子では発 芽がかな り進行 しているが,粒子の膜 とmicroviliの膜 とは連続性である｡ に coreの形 成 が見 られ る ことに 留 意 した い｡ この所 見 お よび上方 の粒子 即 ち両者 (粒子 と細 胞 質膜 ) の膜 は連続 していて 且つ粒子が coreを もつ ことが 見 出 され た ことは,2,3の ガ ンウ イル スの膜 面発育 との根 本的相違 を示す もので あ って興味深 い｡ 図4で も 同様 の ウ イ ル ス粒子 の 膜 面発育 が 認め られ る｡ microviliよ り数 個 の粒子, また 細胞質 の膜 面 よ り数個 の粒子 が発育 してい る｡ 一方 細胞質 内には 全 く ウ イ ル ス粒 子 を 認 めな い｡lil;:タ イ,E1..1filL熱 の病 原 体 テ ク ングニ ア ウ イル ス の増 殖 図 4 細胞質膜 と microviliにおける粒子の 発育を示す (矢印)｡ 図5 ウイルス粒子の形 と構造を示す｡矢印は3個の ウイルス粒子が共通の limiting membraneに 包まれていることを示す｡ 以上 の諸 因は いず れ も こ の ウイル スの増 殖様 式 , も っ と詳 し く言 えば, 粒 子 形 成 の場 は膜 面 で あ る こ とを 強 く示 す もので あ る｡ 2.粒 子 の形 ,大 きさ と構 造 オ ス ミック酸 固定 の粒子 の超 薄 切 片 で測 った ウイル ス粒子 の大 き さは50m〃で あ る(図5)｡ しか も粒 子 に 大 き さの分布 が ない ことが 見 出 され た｡ この こ とは こ の ウイル スは適 当 な 条件下 で は結 晶を つ くるで あ ろ う こ とを強 く示唆 す る｡ ウイル ス粒 子 の形 は一 見 球状 に 見 え る が よ く見 る と6角 形 を 呈 す る｡ 構 造 は limiting membraneと core の 2成 分 と い う単純 な もので あ るが, 特 記す べ きは coreは均 質 で な くて, coreの 中心 部位 は電子 密 度 が 低 い こ とで あ る｡ この ウ イル ス独 特 の構 造 とい って よい｡ なお この図 で矢 印に 示す よ うに, 3個 の粒 子 の 1imiting melTlbrane が 連続 してい る ことは興味 深い ｡ これ は粒 子 が膜 面 で 形 成 され る際 , 同一 均所 で 次 利 こつ くられ て細 胞 外 -放 出 され た た めで あ る と考 え ら れ る｡ なお この図で microviliの膜 に 2個 の粒 子 が接 触 してい るの はや は り膜 面 発 育 を完 了 し た結果 で あ ろ う｡ 偶 然 に こ こ- 粒 子 が接 触 して い るので は あ る まい｡ 3.不 完全 ウイ ル ス粒 子 ウイル ス粒子 は上 述 の よ うな大 き さ と構 造 とを常 に示 さな い｡稀 に大 きさが 50m FLよ り大 き
束 南ア i7 ア 研 究 第4巻 簡 1号 く, 同時 に構 造 と して 内部 coreを 欠 く粒 子 が 出現す る｡ 内部 coreを 欠 くこ と は核 酸 を含 まない と見 て よ いで あ ろ う｡ 図6の膜 面 に 見 られ る 2カ所 の粒 子 集 団 (矢 印) は, す べ て この よ うな性 格 の 粒 子 で あ る｡ (な お, この切 片 で は細 胞 質膜 部 は切 線 に切 られ てい るので膜 は平 面 を呈 す る｡) この よ うな粒 子 は不 完全 ウ イ ル ス粒子 , 未 熟 ウイル ス 粒 子 ない しabortiveform の カテ ゴ リーに入 る もので あ る｡
4.
ウイル ス結 晶 の形 成 さ き に ウ イ ル ス の大 き さ, 形 , 構 造 の項 で, 粒 子 の大 き さに分 布 の存 在 しな い こ と, 粒 子 は膜 面 の 同一 場所 か らつ ぎつ ぎに細 胞 外 に放 出 され て連鎖 をつ くる 傾 向 のあ る こ とを述 べ た｡ これ らの こ とは, この ウイ ル スが 結 晶を つ くるで あ ろ うこ とを強 く示 唆す る もの 図6 膜面での不完全 ウイルス粒子の形成を 示す (矢印)0 図7 細胞間隙に見出された大 きいウイルス結晶｡ 矢印は結晶面の dislocationを,(
⊃印のつい た矢印は screw dislocationを示す｡ で あ る｡ 図7
に細胞 間 隙 に見 出 され た 2次元 の ウイ ル ス結 晶 を示す｡ 特 に画 面左 側 の大 きい結 晶 は, い くつ か の結 晶 面 を示 し, 各 結 晶面 に お け る ウイル ス粒 子 は実 にみ ご とな規 則正 しい配 列 を示 してい る｡ た だ し,矢 印 の部分 の 面 は 明 らか に結 晶 の dislocationを示 し, 且 つ この面 の粒 子 に は層 のず れ が あ るた め に粒 子 個 々の電 子 密 度 が均 一 で ない｡ また ○ 印 のつ いた矢 印 の 示す ふ たつ の面 は いわ ゆ る screw dislocationを 示 して い る｡ この よ うな大 きいみ ご とな結 晶が "細 胞 外 " に 自然 につ くられ てい るの は ウイル ス と して外束 :タ イ出血熱 の病 原体 チ グ ングニア ウ イル スの増 殖 に類 をみ ない ことで興味 深 い｡ 考 察 チ クンダニア ウイル スの超形態学 ,増 殖様式 は これ まで全 然知 られ ていなか った｡ 著者 らは 培 養細胞 内増 殖に関す る研究 か ら, この ウイル スの大 きさ,形,構 造 と増 殖 メカニズ ムを 明 ら かにす る ことがで きた｡ 大 きさは 50m〃で アル ボ ウイル スA群 に属す るア メ リカ西部馬脳 炎 ウイル ス の 大 きさに相 5) 当 し,B群 に属す る 日本 脳 炎 ウイル スの大 きさ (38mp) よ りは大 きい｡ 形 が6角形 を望す る ことは 日本 脳 炎 ウイル ス と 同様 で あ る｡ そ の構造 は上記2種 の ウイル ス と異 な って coreが 中 空 で あ る とい う特徴 を示 してい る｡ 増 殖 メカニズ ムで得 られた興味深 い知 見 は, そ の膜 面発育に おい て粒子が細胞外に放 出 され る以前 に coreの形 成 を示す ことで あ る｡ この ことを示す み ご とな写 真 は これ まで アル ボ ウイ スに おい ては未 だ報 告 され てい ない｡ 一万 この知 見 は, 同 じ く膜 面粒子形 成 を もつ,Bittnerの乳 ガ ソウイル ス,2,3の 白血病 ウ イル スの よ うないわ ゆ るガ ンウイル スのそれ と本質 的に異 な るもので あ る｡ これ らの ガ ンウイ ル スに おい ては,粒 子 の coreは粒 子 が完全 に細胞外 に放 出 され てか ら,細胞 外に おい て core がつ くられ るので あ る｡ この ウイル スに おいて も既 に ミクソウイル スで 知 られ てい る よ うないわ ゆ る不完全 粒子 ない し未 熟 粒子 がそ の発育過程 におい て 出現す る ことが見 出 された｡ 未 熟 粒子 は大 きさが大 き くて 核酸 coreを も ってい ない (図1の細胞質膜 部 の左端 に3個 ,図6の膜 に多数矢 印で示す よ うに 認 め る ことが で きる)｡ この ウイル スのひ とつ の大 きい特徴 は細胞外 にみ ご とな 大 きい結 晶をつ くる ことで あ る｡ こ れ は粒 子 の大 きさに分布 のない こと,粒子 が膜 面 の各部 において それ ぞれ の部位 においてつ ぎ つ ぎに細胞 外に放 出 され ることに よって結 晶形 成が容易 なので あ ろ う｡ 図7に示す よ うなみ ご とな2次元結 晶の電顕写 真 は, も しこの ウイル スを精製 して 適 当 な化学 的条件 を与 えれば3次 元 の結 晶を試験管 内で うる ことがで きるで あ ろ うことを強 く示唆す る｡ 結 論 チ クソグニア ウイル ス BaH306株 を タイ国産 Cynomolgusサ ル の腎細胞 に培 養 し, そ の感 染細 胞 の電顕 的研究 か ら次 の よ うな成績 を得 た｡ 1.ウイル ス粒子形 成 の場 は細胞質膜 で あ り, 細胞質膜 の隆起, 出芽 に よ り粒子 が形 づ くら れ る｡ 2.粒子 は microviliの表 層部に おい て も形 成 され る｡
東 南 ア ク ア 研 究 第4巻 第1号 3.粒 子 形 成 の際 に coreも同時 につ くられ る｡ 4.粒 子 の大 きさは 50mJLe, 形 は6角形 で あ る｡ coreは 中空 で あ る粒 子 が 多 い｡
5.
未 熟 粒 子 と推 定 され る粒 子 が 細胞表 面 に配 列 して い る｡ coreを 欠 き (核 酸 欠除) 大 き さ も上 述 の値 よ り大 きい｡ 6.粒 子 は 同一膜 面 か らつ ぎつ ぎに細胞 外 に放 出 され て連鎖 をつ くる｡7.
そ の結果 と して, 細 胞 外 に お い て, 粒 子 は規 則正 し く配 列 しみ ご とな 大 小 の2
次元 的結 晶構 造 を示す ｡ 謝 辞 本 研究 は京 都大学 東 南 ア ジ ア研究 セ ソクーお よび タイ国立 ウイル ス研 究所 の 援 助 に よ り遂 行 され た｡ タイ国立 ウイル ス研 究所 に お い てほ 伊 藤 利根 太 郎, 緒 方隆 幸, 清 水 明諸博 士 の援 助 を, また 当研 究室 で は松 本 明博 士 , 藤 原栄 一 氏 の協 力 を得 た ｡ 記 して以 て感 謝 の意 を表 す る｡ 文 献1) S.ち.Halstead,C.Yamarat,andJ.E.Scanlon,HTheThaihaemorrhagicfeverepidemicof1962. Apreliminary report,"I.of theMed.Ass.of Thailand.(1962),Vol.46,No.8.
2) R.W.Ross,"TheNewalaepidemic･ⅠⅠⅠ･Thevirus;isolation,pathogenicpropertiesandrelation･ shiptotheepidemic,H∫.伽 .(1956),γol.54,pp.177-191.
3) T.M.Rivers& F.L Horsfall,ViralandRicketisialZnfeciionsof Man.(3rded･;Philadelphia: 1959),p.298.
4) 東昇,伊藤利根太郎,松本明,緒方隆幸,清水明, 藤原栄一 ｢Chikungnyavirusの増殖に関する電 子顕微鏡学的研究｣
,
『熱帯医学会報』(1966)第7巻第1号,p.41.5) 東昇,井上幸垂,松本明,藤原栄一 ｢日本脳炎 ウイルスの増殖に関する電子顕微鏡的研究｣,第 12回 日本 ウイルス学会総会1964,記録 p.41.
