博士（医鞘保前英希 学位論文題名
内因性生理活性物質による神経細胞K ＋ チ ャ ネ ル 修 飾 作 用に 関 す る研 究
イ オ ン チ ャ ネ ル は 、 イ オ ン 透 過 に よ る 膜 電 位 変 化 発 生 を 電 気 信 号 と し て 提 供 す る こ と に よ り 、 情 報 伝 達 に 寄 与 す る 膜 蛋 白 分 子 で あ る 。 そ の う ち 神 経 細 胞 電 位 依 存 性K゛ チ ャ ネ ル は 、 細 胞 膜K゛ コ ン ダ ク タ ン ス を 変 化 さ せ る こ と によ り、 静 止 膜 電 位 の 維 持 、 活 動 電 位 形 成 、 活 動 電 位 反 復 発 射 の 調 節 と い っ た 神 経 細 胞 の 興 奮 に と っ て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 。 近 年 こ れ らK゛ チ ャ ネ ル 遺 伝 子 の ク 口 ー こ ン グ が 進 み 、 徐 々 に そ の 構 造 が 解 明 さ れ つ っ あ る が 、 チ ャ ネ ル が 有 す る 機 能 に 関 し て は 今 な お 不 明 な 点 が 多 い 。 薬 理 学 観 点 か ら は 従 来 か ら 用 い ら れ て い る 古 典 的 な チ ャ ネ ル 阻 害 薬 や そ の 派 生 物 質 に よ る 研 究 に 終 始 し て い る た め 、 臨 床 応 用 の 際 生 じ る 様 々 な 問 題 点 を 解 決 で き ぬ ま ま 現 在 に 至 っ て い る 。 こ の よ う な 外 因 性 の チ ャ ネ ル 修 飾 薬 と い う 観 点 か ら 離 れ 、 元 来 生 体 内 に 存 在 す る 内 因 性 の 生 理 活 性 物 質 に 注 目 し 、 こ れ に よ る チ ャ ネ ル 修 飾 作 用 を 解 き 明 か す こ と は 、 新 た な 創 薬 に っ な が る 可 能 性 を 秘 め て い る 。 そ こ で 本 研 究 は い く つ か の 内 因 性 生 理 活 性 物 質 を 用 い そ れ が 有 す る 神 経 細 胞 電 位 依 存 性K゛ チ ャ ネ ル ヘ の 修 飾 作 用 を 検 討 し た 。 胎 生 ラ ッ ト 大 脳 皮 質 神 経 細 胞 を 初 代 培 養 し 、 こ れ に 対 し て バ ッ チ ク ラ ン プ 法 に よ る イ オ ン 膜 電 流 を 計 測 し て 各 物 質 に よ る 修 飾 作 用 を 機 能 的 に 評 価 し た 。 さ ら に 細 胞 毒 性 試 験 や チ ャ ネ ル 蛋 白 定 量 な ど も 加 え 、 こ の 修 飾 作 用 の 持 つ意味を細胞生物学的な角度からも検討した。
（1）腫瘍壊死因子(Tumor necrosis factor ‑Q：TNF)
TNFを 培 養 液 に 添 加 し12時 間 以 上 処 置 す る こ と に よ り 、 一 過 性 外 向 きK゛ 電 流(IA)の 電 流 密 度 増 大 が 生 じ た 。 こ の 反 応 が 生 じ る シ グ ナ ル 伝 達 機 構 を調 べる 目 的 で 各 種 伝 達 機 構 修 飾 薬 を 用 い て 検 討 し た 結 果 、TNF受 容 体 (p55)、 Phosphatidilcholine‑speci『Ic phopholipaseC、Protein kinaseCの関与を認めたが、セ ラ ミ ド の 関 与 は 乏 し い と 考 え ら れ た 。 ま た 、 増 大 し たIハ の カ イ ネ テ ィ ク ス は 変 化 し な か っ た こ と か ら 、TNFは 個 々 の チ ャ ネ ル 機 能 に は 影 響 せ ず 、 チ ャ ネ ル 蛋 白 自 体 の 発 現 量 を 増 大 さ せ た も の と 推 測 さ れ た 。 事 実 、 発 現 蛋 白 量 の 定量 では 、 神 経 細 胞IA形 成 の 責 任 チ ャ ネ ル の ー つ で あ るKvl.4チ ャ ネ ル の 発 現 増 大 がTNF
処 置 に よ り も た ら さ れ た 。 細 胞 毒 性 試 験 で は 、TNF自 体 に 神 経 毒 性 は な く 、 逆 にTNFはIA増 大 を 介 し てNMDA神 経 毒 性 に 対 す る 神 経 保 護 作 用 を 示 す こ と が 確認された。
（2）Thiamine
細 胞 膜 透 過 性 の 低 いthiamineを 細 胞 外 か ら 投 与し ても 遅延 整流 性K゛ 電流(IK)お よ び 活 動 電 位 に 変 化 を 及 ぽ さ な い が 、 膜 透 過 性 の 高 いthiamine誘 導 体(thiamine tetrahydrofurfuryl disulfide; TTFD)の細胞外投与によりIKの抑制ならびに活動電位 幅 延 長 が 生 じ た 。Thiamineを バ ッ チ 電 極 内 液 を 介 し て 細 胞 内 ヘ 直 接 投 与 す るとIK 抑 制 が 出 現 す る が 、 細胞 質か らバ ッチ 膜を 遊離 するinside‑out patch法 にて 細胞 膜 内 側 面 へthiamineを 直 接 投 与 し て もIK抑 制 は 再 現 で き な か っ た 。 し か し な がら 、 thiamineの りン 酸化 エス テル であ るthiaminediphospha他 （TDP）は このinside．out pびch法 で のIエ 抑 制 を 引 き 起 こ し た 。 っ ま り 、thiarnineは細 胞内 に移 行し た後 リ ン 酸 化 を 受 け て は じ め てIエ 抑 制 物 質 と し て の 作 用 を 発 揮 す る と 考 え ら れ た 。 ま た 、 こ の 現 象 は 神 経 細 胞IK形 成 の 責 任 チ ャ ネ ル の ー つ で あ るKv1．2ク 口 ー ン チ ヤネルに対しても確 認された。
（3）カイニン酸
イオンチャネル供 役型グルタミン酸受容体（ionotroplcglutama忙receptor；iGluR） の う ち 」6LMPA爪 茄nate受 容 体 を 選 択 的 に 活 性 化す る興 奮 性ア ミノ 酸の カイ ニン 酸 が 、 培 養 ラ ッ ト 大 脳 皮 質 神 経 細 胞 のIKを 抑 制 す る こ と を 見 い 出 し た 。 こ のIエ 抑 制はAMPA瓜証nate受容体拮抗薬の6‐cyanO‐7‐nitroquinOX甜me−2，3‐dione（CNQX）で 消 失 す る こ と か ら 、AMPA′ 斌nate受 容 体 活 性 化 に よ る 陽 イ オ ン 流 入 が 原 因 と 考 え られ た。 そこ で細 胞外 のNa十をCholineま たはN‐memyl一D‐glucamineに置換する と 保 持 電 流 の 内 向 き 偏 位 とIエ 抑 制 は 消 失 し た こ と か ら 、 細 胞 内 に 増 加 し たNr がK゛ チ ャ ネ ル の イ オ ン 透 過 孔 を 塞 ぐ こ と に よ りIエ 抑 制 が 生 じ る と 考 え ら れた 。 こ の 現 象 の 持 つ 意 味 と し て 、 シ ナ プ ス 伝 達 の 際 グ ル タ ミ ン 酸 刺 激 が 起 こ る と iGluRを 介 し た シ ナ プ ス 後 細 胞 の 脱 分 極 は 、 同 時 に 生 じ るIエ 抑 制 に よ ル フ イ ー ドフォワード的に加 速される可能性を示唆している。
以 上 の よ う に 電 位 依 存 性K゛ チ ャ ネ ル の 機 能 な ら び に そ の 発 現 は 、 今 回 用 い た 内 因 性 生 理 活 性 物 質 に よ っ て 修 飾 を 受 け る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ の こ と は 逆 に 生 理 的 状 態 に あ っ て は 、 常 に 電 位 依 存 性K゛ チ ャ ネ ル が 内 因 性 物 質 に よ っ て 調 節 を 受 け て い る こ と を 意 味 し て い る 。 し か し 、 そ の 調 節 機 構 は け っ し て 単 純 な も の で は な く 、 複 雑 な シ グ ナ ル 伝 達 機 構 が 介 在 す る こ と は 本 研 究 か ら も 明 白 で あ る 。 一 方 で こ の 伝 達 機 構 を 解 き 明 か す こ と は 、 内 因 性 物 質 の 新 た な 生 理 作 用 究 明 に 寄 与 す る も の と 考 え ら れ る 。 さ ら に 、 元 来 生 体 が 持 つ 調 節 機 能 と し て 様 々 な 内 因 性 生 理 活 性 物 質 がK゛ チ ャ ネ ル に 作 用 し て い る の な ら ば 、 将 来K． チ ヤ ネ ル を 標 的 と し う る 多 く の 内 因 性 物 質 を 見 っ け 、 こ れ を 創 薬 に 結 び っ け る 上 で 本 研 究 は そ の 一 里 塚 に な る と 思 わ れ る 。
主査教授 菅野贐夫 副査教授 田代邦雄 副査教授 福島菊郎
学 位 論 文 題 名
内因´陸生理活性物質による神経細胞K ＋ チャネル修飾作用に関する研究
申請者が提出した学位論文は、申請者が主著者 となって発表したラッ卜胎仔大脳皮質 神経 細胞 の外 向きK゛電 流を 形成 するK゛ チ ャネ ルに対する内 因性生理活性物質の影響 を検 討し た3編 の研 究成 果を総括したものである。他の興奮性 細胞と同様に神経細胞で は、K゛ チャ ネ ルは 静止 膜電位の維持、活動電位再分極相の形 成、活動電位反復発射の 調節もしくは不応期の設定と細胞の興奮性に重要 な関わりを持っている。したがって、
K゛ チャ ネル の 薬理 学的 修飾は神経細胞の興奮性を調節するこ ととなり、興奮性の異常 に基づく病態の改善に寄与することが期待される 。本研究は、従来から知られている古 典的 なK゛チ ャ ネル 阻害 薬や 活性 化薬 の概 念か ら離 れ、K゛チ ャネル修飾作用を有する 内因 性生 理活 性物 質を 探索し、そ の物質の生成や分解を調節する事により間接的にK゛ チャネル機能を変容させる新しい治療法の開発を 目的としたものである。以下に得られ た新知見を要約する。
1． 中 枢 神 経 系 変 性 疾患 およ び虚 血 等で 増カ ロし てく る腫 瘍壊 死因 子(TNFa） は急 性 投与 では ラッ 卜大 脳皮 質神 経細 胞の 膜電 流 には 何ら 影響 を与 えな いが 、TNFを培養液 に添 加し12時 間以 上処 置すると、 一過性外向きK゛電流(IA)の 電流密度増大が生じる事 を見 出し た。 増大 したIAの カイ ネテ ィク ス は変 化し なか った こと から 、TNFは個々の チャネル機能には影響せずテャネル蛋白自体の発 現量を増大させたものと推測され、事 実、 神経 細胞IA形 成の 責任 チャ ネル のー つ であ るKvl.4チャ ネル の発 現 増大 を確認し た。 この チャ ネル 蛋白 の増加には 、TNF受容体(p55)、phosphatidylcholine ‑specific phopholipaseC、protein kinaseCが 関与 し 、セ ラミドの関与 は乏しいことを薬理学的 に 明 ら か に し た 。 細 胞毒 性試 験で は、TNF自 体に 神経 毒性 はな く、 逆にTNFはIA増 大 を 介 し てNMDA神 経 毒 陸 に 対 す る 神 経 保 護 作 用 を 示す こと を示 した 。2．Vitamin Bi であ るthiamineを 細胞 外から投与 しても遅延整流性K゛電流(IK)および活動電位に変化 を 及 ぽ さ な い が 、 膜 透 過 性 の 高 いthiamine誘 導 体(thiamine tetrahydrofurfuryl 出sumde；TrFD）の 細胞 外投与によりIKの抑制ならびに活動電 位幅延長を認めた。詳細 一99―
な電気生理学的検討により、膜を透過したTTFDが細胞内でthiamineとなり、リン酸 化を受けて生じるthiaunine diphosphate (TDP)がIK抑制の本体であることを明らかに し た。3． イ オ ンチ ャ ネル 供 役 型グ ル タミ ン 酸 受容 体 （iGluR）の ー つ であ る AMPA/kainate受容体を選択的に活性化する興奮性アミノ酸のカイニン酸が、培養ラ ット大 脳皮質神経細胞のIKを抑制することを見い出し、その機序として、AlvIPA/
kinate受容体活性化によって流入したNa゛がK゛チャネルのイオン透過孔を塞ぐこと によりIK抑制が生じると結諭した。この現象は、シナブス伝達の際にグルタミン酸刺激 が起こると、iGluRを介したシナブス後細胞の脱分極が同時に生じるIK抑制により加 速される可能性を示唆している。学位論文発表に際して、主査および副査から、TNF による神経細胞のK゛テャネル蛋白の上方修飾の時間依存性について、TNFによる神経 保護作用の機序、TI'FDの臨床有用性、神経細胞に対するK゛チャネル抑制薬研究の将 来展望、他のサイトカインの神経膜電流に及ぽす作用等の質問が、また、参加者から、
カイニン酸によるIK抑制の意義、AM PA/kainate受容体活性化によって流入レたNa゛ がK゛チャネルを抑制する機序等の質問があったが、申請者は自己の実験データおよび 文献的知識に基づぃて概ね的確に解答した。
本研究は、サイトカインであるTNF、ピタミンBiおよびその膜透過性誘導体および 興奮性アミノ酸であるカイニン酸の培養ラッ卜大脳皮質神経細胞K+チャネルに及ぽす 影響を電気生理学的に詳細に解析して、内因性生理活性物質がK゛チャネル機能を修飾 して神経細胞の興奮I陸に影響し得る可能性を示唆レ、中枢神経系疾患治療法の開発に新 たな視点を加えたものである。
審査員一同fま、バッテクランプ法などの精緻な研究方法を駆使して内因性生理活性物 質の神経細胞K゛チャネル機能に及ぽす作用を解析して、難治性中枢神経疾患治療法開 発に新しい可能性を示唆した本研究を高く評価し、加えて、申請者の豊富な学識および 研究に対する誠実な姿勢も勘案して、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な 資格を有するものと判定した。
